CN103717736B - 具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质、编码该蛋白质的基因及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质、编码该蛋白质的多核苷酸等。本发明提供例如含有序列号1或4的碱基序列的多核苷酸、编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体及转化体、使用该转化体的脂质或脂肪酸的制造方法或含有通过此种制法制造的脂质或脂肪酸的食品等。

Description

具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质、编码该蛋白质的基因及其用途
技术领域
本发明涉及具有脂肪酸链延长促进活性的新型蛋白质、编码该蛋白质的多核苷酸及其利用方法。
背景技术
在酵母等的微生物中，脂肪酸的链延长反应经过（i）脂酰-CoA与丙二酰-CoA的缩合反应、（ii）作为缩合生成物的3-氧酰基-CoA的还原反应、（iii）3‐羟酰-CoA的脱水反应、（iv）反式-2-烯酰-CoA的还原反应的四步反应，碳原子数每次增加2个，碳链得到延长（非专利文献1）。
已知上述（i）～（iv）的反应中分别为（i）3-酮脂酰-CoA合成酶、（ii）β-酮脂酰还原酶、（iii）3-羟酰-CoA脱氢酶、（iv）烯酰-CoA还原酶的酶起媒介作用（非专利文献1）。
已知这些酶中，负责缩合反应的3-酮脂酰-CoA合成酶对作为底物的脂肪酸显示特异性，从各种生物中克隆了具有各种特异性的酶。
特别是已明确了在真菌类中的最经常研究的酵母中，脂肪酸链延长反应的全部四步反应中负责各反应的酶及编码该酶的基因。
例如，在酵母中，作为编码负责β-酮脂酰还原酶活性的酶的基因，已知有IFA38和AYR1的2个，且还已知同时缺失这2个基因时会致死（非专利文献2）。此外，还已知AYR1基因具有1-酰基二羟基丙酮磷酸还原酶活性。（非专利文献3）
另一方面，作为编码负责3-羟酰-CoA脱氢酶活性的酶的基因，已知有PHS1（必需），作为编码负责烯酰-CoA还原酶活性的酶的基因，已报道了TSC13（必需）。
相对于此，在作为脂质生产菌的高山被孢霉（Mortierellaalpina(M.alpina)）中，已知有承担与脂肪酸链延长有关的最初的反应的3-酮脂酰-CoA合成酶（所谓的链延长酶）基因（MALCE1（ELO3）、MALCE2、GLELO、MAELO）（专利文献1），但3-酮脂酰-CoA合成酶以外的酶的基因还不为人所知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开公报WO2010/147138号
非专利文献
非专利文献1:KiharaA.,etal.,(2008)J.Biol.Chem.283,11199-11209
非专利文献2:Han,G.etal.,(2002)J.Biol.Chem.277,35440-35449
非专利文献3:Athenstaedt,K.,andDaum,G.(2000)J.Biol.Chem.275,235-240
发明内容
在如上所述的状况下，希望得到与高山被孢霉（M.alpina）细胞内的脂肪酸链延长反应有关的新型蛋白质或编码该蛋白质的基因。
本发明者不断深入研究的结果，成功地克隆了编码作为酵母的3-羟酰-CoA脱氢酶的AYR1的同源蛋白质MaADR1的基因，从而完成了本发明。即本发明提供以下的多核苷酸、蛋白质、表达载体、转化体、使用该转化体的脂质或脂肪酸组合物及食品等的制造方法以及通过此种制法制造的食品等。
具体地说，本发明如下。
［1］一种多核苷酸，其特征在于，选自以下（a）～（e）中的任一项所述的多核苷酸:
（a）多核苷酸，含有序列号1或4的碱基序列；
（b）多核苷酸，编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质；
（c）多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中1～100个氨基酸发生缺失、取代、插入及／或附加的氨基酸序列组成且具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质；
（d）多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列且具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质；及
（e）多核苷酸，其与由序列号1或4的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，编码具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质。
［2］根据上述［1］中所述的多核苷酸，其特征在于，为以下（f）或（g）中的任一项:
（f）多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中1～10个氨基酸发生缺失、取代、插入及／或附加的氨基酸序列组成且具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质；及
（g）多核苷酸，编码具有与序列号2的氨基酸序列有75%以上同一性的氨基酸序列且具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质。
［3］根据上述［1］中所述的多核苷酸，其特征在于，含有序列号1或4的碱基序列。
［4］根据上述［1］中所述的多核苷酸，其特征在于，编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质。
［5］根据上述［1］～［4］中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，为DNA。
［6］一种蛋白质，其特征在于，由上述［1］～［5］中任一项所述的多核苷酸编码。
［7］一种载体，其特征在于，含有上述［1］～［5］中任一项所述的多核苷酸。
［8］一种非人体转化体，其特征在于，导入了上述［1］～［5］中任一项所述的多核苷酸。
［9］一种非人体转化体，其特征在于，导入了上述［7］中所述的载体。
［10］根据上述［8］或［9］中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述转化体为脂质生产菌。
［11］根据上述［10］中所述的转化体，其特征在于，所述脂质生产菌为高山被孢霉（Mortierellaalpina）。
［12］一种脂质或脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从上述［8］～［11］中任一项所述的转化体的培养物中采集脂质或脂肪酸组合物。
［13］根据上述［12］中所述的方法，其特征在于，所述脂质为三酰甘油。
［14］根据上述［12］中所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸为碳原子数18以上的脂肪酸。
［15］一种食品、医药品、化妆品或肥皂，其特征在于，含有通过上述［12］中所述的制造方法所采集的脂质或脂肪酸组合物。
本发明的多核苷酸可用于脂质生产菌（例如，高山被孢霉（M.alpina））、酵母、植物等的转化，如此得到的转化脂质生产菌、转化酵母或转化植物等可用于脂肪酸组合物、食品、化妆品、医药、肥皂等的制造。
更具体地说，本发明的转化体的脂质及脂肪酸的生产效率极高。因此，本发明可有效用于需要大量脂质或脂肪酸的医药品或保健食品的制造。
附图说明
图1是表示MaADR1的基因组序列与CDS序列的比对的图。
图2是表示MaADR1的CDS序列及推定氨基酸序列的图。
图3是表示来自MaADR1、团藻（Volvoxcarterif.nagariensis）（绿藻类）的推定蛋白质（GENEBANKaccessionNo.XP_002946364）及来自酿酒酵母（S.cerevisiae）的AYR1p的各氨基酸序列的比对图（图中，双下划线部表示NADPH结合位点（bindingsite），带有星号（＊）的部分表示活性中心）。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，并不意味着将本发明仅限于此实施方式。本发明只要不脱离其主旨，可实施各种方式。
另外，本说明书中引用的全部文献及公开公报、专利公报、其它的专利文献已作为参照编入本说明书中。此外，本说明书包含2011年8月4日申请的成为本申请优先权主张的基础的日本国专利申请（日本特愿2011-171044号）的说明书及图面中所述的内容。
如后述实施例中的详细记载，本发明者首次成功地克隆了作为脂质生产菌的高山被孢霉（M.Alpina）中的AYR1的同源基因（MaADR1）的全长cDNA。此外，本发明者也鉴定了来自高山被孢霉（M.Alpina）的MaADR1的基因组DNA的碱基序列及推定氨基酸序列。MaADR1的ORF序列、推定氨基酸序列、CDS序列及基因组序列分别为序列号1、序列号2、序列号3及序列号4。这些多核苷酸及酶可通过后述实施例中所述的方法、公知的基因工程的方法、公知的合成方法等获得。
1.本发明的多核苷酸
首先，本发明提供选自以下（a）～（e）中任一项所述的多核苷酸。
（a）多核苷酸，含有序列号1或4的碱基序列；
（b）多核苷酸，编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质；
（c）多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中1～100个氨基酸发生缺失、取代、插入及／或附加的氨基酸序列组成且具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质；
（d）多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列且具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质；及
（e）多核苷酸，其为与由序列号1或4的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸，编码具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质。
本说明书中，“多核苷酸”是指DNA或RNA。
本说明书中，“在严谨条件下杂交的多核苷酸”是指，例如将由序列号1或4的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸或以由编码序列号2的氨基酸序列的碱基序列组成的多核苷酸的全部或一部分作为探针，采用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等得到的多核苷酸。作为杂交的方法，例如，可利用“Sambrook＆Russell，MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3,ColdSpringHarbor,LaboratoryPress2001”及“Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley＆Sons1987-1997”等中的所记载方法。
本说明书中，“严谨条件”可以是低严谨条件、中严谨条件及高严谨条件中的任一项。“低严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、32℃的条件。此外，“中严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、42℃或5×SSC、1%SDS、50mMTris-HCl（pH7.5）、50%甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、50℃或0.2×SSC、0.1%SDS、65℃的条件。在这些条件中，越提高温度越能期待高效地得到具有高同一性的DNA。但是，作为影响杂交的严谨度的因素，有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，只要是本领域技术人员，即可通过适当选择这些因素来实现同样的严谨度。
另外，当使用市售的试剂盒进行杂交时，例如可以使用AlkphosDirectLabellingandDetectionSystem（GEHealthcare）。此时，按照试剂盒中附带的操作指南，与标记的探针孵育过夜后，在55℃的条件下使用含有0.1%（w/v）SDS的最初的洗涤缓冲液将膜洗涤后，即可检测出杂交的DNA。或基于序列号1或4的碱基序列的互补碱基序列或编码序列号2的氨基酸序列的碱基序列的全部或一部分制备探针时，使用市售的试剂（例如，PCR标记混合物（罗氏诊断有限公司（RocheDiagnostics公司））等）将该探针进行地高辛（DIG）标记的情况下，可使用DIG核酸检测试剂盒（RocheDiagnostics公司）来检测杂交。
作为除上述以外可杂交的多核苷酸，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件，使用默认参数计算时，可列举与序列号1或4的DNA或编码序列号2的氨基酸序列的DNA有50%以上、51%以上、52%以上、53%以上、54%以上、55%以上、56%以上、57%以上、58%以上、59%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上或99.9%以上同一性的DNA。
另外，氨基酸序列、碱基序列的同一性，可以用FASTA(Science227(4693):1435-1441,(1985))、Karlin-Altschul的算法BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)（Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268,1990;ProcNatlAcadSciUSA90:5873,1993）来确定。开发出了基于BLAST算法的被称为blastn、blastx、blastp、tblastn和tblastx的程序（AltschulSF,etal:JMolBiol215:403,1990）。使用blastn分析碱基序列时，参数例如为score=100、wordlength=12。此外使用blastp分析氨基酸序列时，参数例如为score=50、wordlength=3。使用BLAST和GappedBLAST程序时，使用各程序的默认参数。
上述的本发明的多核苷酸可通过公知的基因工程的方法或公知的合成方法获得。
2.本发明的蛋白质
本发明提供如下（i）～（iv）所示的蛋白质。
（i）蛋白质，其由上述（a）～（e）中任一项的多核苷酸编码；
（ii）蛋白质，其含有序列号2的氨基酸序列；
（iii）蛋白质，其包含序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及／或附加的氨基酸序列，且具有脂肪酸链延长促进活性；
（iv）蛋白质，其具有与序列号2的氨基酸序列有75%以上同一性的氨基酸序列，且具有脂肪酸链延长促进活性。
上述（iii）或（iv）所述的蛋白质，代表性的有天然存在的序列号2的蛋白质的突变体，但也包括可使用例如“Sambrook＆Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3,ColdSpringHarborLaboratoryPress2001”、“Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley＆Sons1987-1997”、“Nuc.Acids.Res.,10,6487（1982）”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409（1982）”、“Gene,34,315（1985）”、“Nuc.Acids.Res.,13,4431（1985）”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488（1985）”等中记载的定点突变法而人工获得的蛋白质。
本说明书中，作为“由序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及／或附加的氨基酸序列组成的具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质”，可列举如下蛋白质，其由序列号2的氨基酸序列中，例如1～100个、1～90个、1～80个、1～70个、1～60个、1～50个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个（1～数个）、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及／或附加的氨基酸序列组成，且具有脂肪酸链延长促进活性。上述氨基酸残基发生缺失、取代、插入及／或附加的数量通常越小越优选。
此外，作为此种蛋白质，还可以列举如下蛋白质，其具有与序列号2的氨基酸序列有60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上或99.9%以上同一性的氨基酸序列，且具有脂肪酸链延长促进活性。上述同一性的数值通常越大越优选。
在任意蛋白质具有“脂肪酸链延长促进活性”的情况下，使该蛋白质在酵母、脂质生产菌及植物细胞等的适合的宿主细胞中表达时，与不表达的同种细胞相比，在其细胞可合成的脂肪酸中，碳原子数更多的脂肪酸的含量增加。此时，所述“碳原子数更多的脂肪酸”的合成中，因使用与其相比碳原子数少2个的脂肪酸，所以，该碳原子数少2个的脂肪酸的量也可减少。
具体而言，使具有脂肪酸链延长促进活性的蛋白质在上述适合的宿主细胞中表达时，与不表达的同种细胞相比，（i）碳原子数16的脂肪酸量减少，碳原子数18的脂肪酸量增加，或（ii）碳原子数17的脂肪酸量减少，碳原子数19的脂肪酸量增加，或（iii）碳原子数18的脂肪酸量减少，碳原子数20的脂肪酸量增加，或（iv）碳原子数20的脂肪酸量减少，碳原子数22的脂肪酸量增加，或（v）碳原子数22的脂肪酸量减少，碳原子数24的脂肪酸量增加，或（vi）碳原子数24的脂肪酸量减少，碳原子数26的脂肪酸量增加，或（vii）碳原子数26的脂肪酸量减少，碳原子数28的脂肪酸量增加，或（viii）碳原子数28的脂肪酸量减少，碳原子数30的脂肪酸量增加。
另外，脂肪酸链延长促进活性可根据Han,G.etal.,(2002)J.Biol.Chem.277,35440-35449中记载的方法测定。
且作为确认脂肪酸链延长促进活性的方法，可列举使用酵母、脂质生产菌及植物细胞等适当的宿主细胞的实验。使编码本发明的蛋白质的多核苷酸在宿主细胞内中表达时，如碳链更长的脂肪酸的生成量增加，则由该多核苷酸编码的蛋白质或肽可称为具有脂肪酸链延长促进活性。本发明者在实施例中，在使本发明的蛋白质在酵母细胞内表达，使用气相色谱法分析该酵母细胞中所含有的脂肪酸组成时，确认为碳原子数16的脂肪酸量减少，碳原子数18的脂肪酸量增大。
因酵母只能合成碳原子数18以下的脂肪酸，所以，实施例中碳原子数18的脂肪酸的量增加，但认为使用可合成碳原子数多于18的脂肪酸，例如碳原子数19或20的脂肪酸的细胞（例如，高山被孢霉（Mortierellaalpina））作为宿主时，在其宿主细胞可合成的脂肪酸中，碳原子数更多的脂肪酸（例如，碳原子数最多的脂肪酸）（例如，如果是高山被孢霉，则为碳原子数20的脂肪酸）的量增加。
本发明的蛋白质优选相对于三酰甘油中所含有的脂肪酸，显示碳链延长促进活性。
此外，通过本发明的蛋白质而进行了碳链延长的脂肪酸可以为饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸中的任一种，优选为不饱和脂肪酸，进一步优选为1元、2元、3元或4元的不饱和脂肪酸。
因本发明的蛋白质为来自酵母的AYR1蛋白质的同源蛋白质，所以，认为与AYR1同样具有β‐酮脂酰还原酶活性。在酵母中，作为具有β‐酮脂酰还原酶活性的基因，除了AYR1之外已知还有IFA38，还已知同时破坏这2个时会致死（Han,G.etal.,(2002)J.Biol.Chem.277,35440-35449）。本发明的蛋白质是否具有β‐酮脂酰还原酶活性，可通过在破坏了AYR1基因及IFA38基因的酵母株中使本发明的蛋白质表达时该菌株可生长繁殖或分析是否可弥补β‐酮脂酰还原酶活性来确认。
本发明的蛋白质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及／或附加，是指在同一序列中的任意且1个或多个氨基酸序列中的位置上，1个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及／或附加，缺失、取代、插入及附加中的2种以上也可同时发生。
以下举例表示可相互取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可相互取代。A组:亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o－甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；B组:天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组:天冬酰胺、谷氨酰胺；D组:赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E组:脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；F组:丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组:苯丙氨酸、酪氨酸。
此外，本发明的蛋白质也可通过Fmoc法（9-芴甲氧羰基法）、tBoc法（叔丁氧羰基法）等的化学合成法制造。此外，还可利用美国先进自动多肽蛋白技术公司（AdvancedAutomationPeptideProteinTechnologies）公司制、珀金埃尔默（PerkinElmer）公司制、ProteinTechnologies公司制、PerSeptive公司制、AppliedBiosystems公司制、岛津（SHIMADZU）公司制等的肽合成仪进行化学合成。
3.本发明的载体及导入该载体的转化体
本发明还在其他实施方式中提供含有本发明的多核苷酸的表达载体。
本发明的载体通常如下构成，其含有
（i）在宿主细胞内可转录的启动子；
（ii）与该启动子结合的上述（a）～（g）中任一项所述的多核苷酸；及
（iii）与RNA分子的转录终止及多聚腺苷化有关且将在宿主细胞内起作用的信号作为构成要素的表达盒。
如此构建的载体被导入宿主细胞。作为本发明中所使用的适合的宿主细胞的例子，可列举脂质生产菌、酵母等。
作为脂质生产菌，例如可以使用在MYCOTAXON,Vol.XLIV,No.2,pp.257-265（1992）中记载的菌株，具体而言，可以列举属于被孢霉属（Mortierella）的微生物，例如，属于长孢被孢霉（Mortierellaelongata）IFO8570、微小被孢霉（Mortierellaexigua）IFO8571、喜湿被孢霉（Mortierellahygrophila）IFO5941、高山被孢霉（Mortierellaalpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等的被孢霉亚属（subgenusMortierella）的微生物或属于深黄被孢霉（Mortierellaisabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、矮被孢霉（Mortierellanana）IFO8190、拉曼被孢霉（Mortierellaramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡酒色被孢霉（Mortierellavinacea）CBS236.82等的Micromucor亚属（subgenusMicromucor）的微生物等。尤其优选高山被孢霉（Mortierellaalpina）。
此外，作为酵母的例子，可列举酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）EH13-15、NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。
由本发明的载体转化后的这些宿主细胞，与未由本发明的载体转化的宿主细胞相比，碳链长的脂肪酸（例如，碳原子数18、19或20的脂肪酸或具有比其更多的碳原子数的脂肪酸）的量增加。优选为所述脂肪酸为三酰甘油（也称为“甘油三酯”）中所含有的脂肪酸。
作为在脂质生产菌中导入时使用的载体，例如可以利用pDura5(Appl.Microbiol.Biotechnol.,65,419-425,(2004))，但不限于此。
作为在酵母中导入时使用的载体，只要是具有在酵母细胞内表达插入片段的活性的载体，则无特别限制，作为例子，可以列举pYE22m（Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221-1228,1995）。
作为调节宿主细胞中的基因表达的启动子/终止子，只要在宿主细胞中起作用，则可以是任意的组合。例如，在脂质生产菌中利用时，可以利用histonH4.1基因的启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子等。
作为转化时使用的选择标记，可以利用营养缺陷型标记（ura5、niaD、trp1）、抗药性标记（潮霉素、博来霉素（Zeocin））、遗传霉素（Geneticin）抗性基因（G418r）、铜抗性基因（CUP1）（Marinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,3371984）、浅蓝菌素抗性基因（fas2m,PDR4）（分别参考猪腰淳嗣等,生化学,64,660,1992；Hussainetetal.,gene,101,149,1991）等。
作为宿主细胞的转化方法，可以利用常用的公知方法。例如为脂质生产菌时，可以利用电穿孔法（MackenxieD.A.etal.Appl.Environ.Microbiol.,66,4655-4661,2000）、粒子轰击（ParticleDelivery）法（日本特开2005-287403《脂质生产菌的育种方法》（日语原名「脂質生産菌の育種方法」）中所述的方法）。此外，为酵母时，可使用电穿孔法、原生质球法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929（1978））、醋酸锂法（J.Bacteriology,153,p163（1983））、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929（1978）、Methodsinyeastgenetics,2000Edition:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual等中记载的方法来实施，但不限于这些。
其他，有关通常的克隆技术，可以参照“Sambrook＆Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3,ColdSpringHarborLaboratoryPress2001”、“MethodsinYeastGenetics、Alaboratorymanual（ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor,NY）”等。
4.本发明的脂质或脂肪酸组合物的制造方法
本发明还在其他实施方式中提供使用上述转化脂质生产菌或酵母的脂质或脂肪酸组合物的制造方法。
本说明书中，“脂质”是指包括由脂肪酸和醇通过酯键形成的化合物（例如甘油酯）或其类似物（例如胆固醇酯）等的单纯脂质、在单纯脂质的一部分上进一步键合了磷酸、氨基酸、糖等的复合脂质以及脂质的水解产物中不溶于水的衍生脂质。
本说明书中，“油脂”是指甘油和脂肪酸的酯（甘油酯）。
本说明书中，“脂肪酸”是指由通式RCOOH（R为烷基）表示的脂肪族单羧酸（具有1个羧基，碳原子呈链状连接的羧酸）。脂肪酸包括烃链中不含双键的饱和脂肪酸和含双键的不饱和脂肪酸。
本发明的脂质或脂肪酸组合物，可以从根据本发明进行了转化的细胞中按以下操作来提取。对于生物（例如脂质生产菌或酵母）的转化株，培养结束后，可以按照离心分离法、过滤等常规方法得到培养细胞。将细胞充分水洗，优选进行干燥。干燥可以通过冷冻干燥、风干等来进行。将干燥细胞根据需要采用DynoMill或超声波等破碎后，优选在氮气流下使用有机溶剂进行提取处理。作为有机溶剂，可以使用醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚等，或者通过甲醇和石油醚的交替提取或使用了氯仿-甲醇-水的单相溶剂的提取，也能得到良好的结果。通过在减压下从提取物中馏去有机溶剂，可以得到含有脂肪酸的脂质。提取的脂肪酸也可以采用盐酸甲醇法等进行甲酯化。
进而，从上述含有脂肪酸的脂质中分离脂肪酸，可以在混合脂肪酸或混合脂肪酸酯的状态下，通过通常方法（例如尿素附加法、冷却分离法、柱色谱法等）浓缩分离来进行。
通过本发明的方法制造的脂质优选为三酰甘油，更优选为含有碳原子数18以上的脂肪酸的三酰甘油。
此外，通过本发明的方法制造的脂肪酸优选为碳原子数18以上的脂肪酸，更优选为三酰甘油中所含有的碳原子数为18以上的脂肪酸。
作为碳原子数18以上的脂肪酸的例子，可列举硬脂酸（18:0）、油酸(18:1(9))、异油酸(18:1(11))、亚油酸(18:2(9,12))、α-亚麻酸(18:3(9,12,15))、γ-亚麻酸(18:3(6,9,12))、桐酸(18:3(9,11,13))、花生酸(20:0)、二十碳烯酸（20:1Δ11）、8,11-二十碳二烯酸(20:2(8,11))、5,8,11-二十碳三烯酸(20:3(5,8,11))、花生四烯酸（20:4(5,8,11,14)）、山萮酸(22:0)、木质素酸(24:0)、神经酸(24:1)、蜡酸(26:0)、褐煤酸(28:0)及蜂花酸(30:0)，但不限于这些。
此外通过本发明的方法制造的脂肪酸可以是饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸中的任一个，但优选为不饱和脂肪酸，进一步优选为1元、2元、3元或4元的不饱和脂肪酸。
另外，通过本发明的方法生成的脂质及该脂质中所含有的脂肪酸的组成可通过上述的脂质提取方法、脂肪酸分离方法或它们的组合来确认。
通过本发明的制造方法得到的脂质或脂肪酸组合物可根据通常的方法例如用于含有油脂的食品、医药品、工业原料（化妆品、肥皂等的原料）的制造等的用途。
本发明还在其他实施方式中提供使用本发明的转化脂质生产菌或转化酵母的食品、化妆品、医药、肥皂等的制造方法。该方法包含使用本发明的转化脂质生产菌或转化酵母生成脂质或脂肪酸的工序。含有所生成的脂质或脂肪酸的食品、化妆品、医药、肥皂等的制备根据通常的方法进行。这样，根据本发明的制造方法制造的食品、化妆品、医药、肥皂等含有使用本发明的转化脂质生产菌或转化酵母生成的脂质或脂肪酸。本发明进一步提供根据此种方法制造的食品、化妆品、医药、肥皂等。
本发明的化妆品（组合物）或医药品（组合物）的剂型无特别限定，可采用溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型。此外，本发明的化妆品组合物或医药组合物除了可用于油、化妆水、乳霜、乳液、凝胶、洗发液、润丝、护发素、指甲油、粉底、唇膏、香粉、面膜、软膏、香水、粉饼、古龙水、牙膏、肥皂、气雾剂、洁面膏等的化妆品或皮肤外用药以外，还可用于皮肤老化防止改善剂、皮肤炎症防止改善剂、沐浴剂、生发剂、皮肤美容液、防晒剂或外伤、皲裂、龟裂等引起的皮肤粗糙的防止改善剂等。
本发明的化妆品组合物根据需要还可以进一步适当配合其他油脂及/或色素、香料、防腐剂、表面活性剂、颜料、抗氧化剂等。关于它们的配合比例，本领域技术人员可以根据目的适当决定（例如油脂，在组合物中可以含有1～99.99重量%，优选为5～99.99重量%，更优选为10～99.95重量%）。此外，本发明的医药组合物根据需要也可以进一步含有其他医药活性成分（例如消炎成分）或辅助成分（例如润滑成分、载体成分）。例如，作为化妆品或皮肤外用药中的其他常用成分，可以列举粉刺用药、头屑·瘙痒防止剂、止汗防臭剂、烫伤用药、防螨·虱剂、角质软化剂、干皮症用药、抗病毒剂、经皮吸收促进剂等。
作为本发明的食品的例子，可以列举营养辅助食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方奶、早产儿用配方奶、老人用食品等。在本说明书中，食品是固体、流体、液体以及它们的混合物，是可摄取食用的物质的总称。
营养辅助食品是指强化了特定营养成分的食品。保健食品是指被认为是健康的或对健康有益的食品，包括营养辅助食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充发挥机体调节功能的营养成分的食品，与特定保健用食品同义。幼儿用食品是指供给约6岁以下的儿童用的食品。老人用食品是指处理成与未处理食品相比易消化和吸收的食品。婴儿用配方奶是指供给约1岁以下的儿童用的配方奶。早产儿用配方奶是指供给早产儿出生后到约6个月为止所用的配方奶。
作为这些食品的形态的例子，可以列举肉、鱼、坚果等天然食品（用油脂处理过的食品）、中式菜肴、拉面、汤等在制作时加入油脂的食品、天妇罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、甜甜圈、花林糖等用油脂作为热介质的食品、黄油、人造黄油、蛋黄酱、调味汁、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰激凌等油脂食品或在加工时添加了油脂的加工食品、年糕片、硬饼干、豆沙面包等在加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，并不限于含有油脂的食品，例如还可以是面包、面类、米饭、点心类（糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心）、豆腐及其加工品等农产品、清酒、药酒、甜料酒、食醋、酱油、黄酱等发酵食品、酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品、鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品、果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。
本发明的食品还可以是胶囊等医药制剂的形态，或是在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合了本发明的油脂得到的自然流食、半消化态营养食品以及成分营养食品、保健饮料、经肠营养剂等加工形态。
如上所述，通过使本发明的脂肪酸链延长促进活性基因在宿主细胞内表达，能高效地生成脂质，特别是三酰甘油。
而且，还可以将该基因的表达量作为指标，应用于高效进行脂质、特别是三酰甘油生产的培养条件的研究、培养管理等。
实施例
以下用实施例来更具体地说明本发明，但本发明的范围并不限于这些实施例。
高山被孢霉（Mortierellaalpina）的基因组分析
将M.alpina1S-4株接种到100ml的GY2：1培养基（2%葡萄糖、1%酵母膏pH6.0）中，在28℃下振荡培养2天。通过过滤收集菌体，使用DNeasy（QIAGEN）制备基因组DNA。使用Roche454GSFLXStandard来确定上述基因组DNA的碱基序列。此时，片段文库的碱基序列的确定进行2个run，末端配对文库的碱基序列的确定进行3个run。通过将得到的碱基序列拼接，得到300个超级重叠群（SuperContig）。
cDNA的合成及cDNA文库的构建
将M.alpina1S-4株接种到100ml的培养基（1.8%葡萄糖、1%酵母膏、pH6.0）中，在28℃下预培养3天。在10L培养槽（AbleCo.，东京）中加入5L培养基（1.8%葡萄糖、1%大豆粉、0.1%橄榄油、0.01%增稠剂（ADEKANOL）、0.3%KH2PO4、0.1%Na2SO4、0.05%CaCl2·2H2O、0.05%MgCl2·6H2O、pH6.0），接种全部预培养物，在300rpm、1vvm、26℃的条件下通气搅拌培养8天。培养第1、2及3天时，分别添加相当于2%、2%及1.5%的葡萄糖。培养第1、2、3、6及8天时，回收各阶段的菌体，用盐酸胍／CsCl法制备总RNA。使用Oligotex-dT30<Super>mRNAPurificationKit（TaKaRaBio）从总RNA中进行poly（A）＋RNA的纯化。使用ZAP-cDNAGigapackIIIGoldCloningKit(STRATAGENE)构建各阶段的cDNA文库。
来自酵母AYR1的同源物的探索
将负责酵母的1-酰基二羟基丙酮磷酸还原酶活性及β-酮脂酰还原酶活性的基因即ScAYR1（YIL124W）的同源物通过基因组数据库进行研究。其结果，包含序列号4的序列的超级重叠群（supercontig）匹配（hit）。将与序列号4相关的基因命名为MaADR1。
MaADR1的cDNA的克隆化
为克隆MaADR1基因的cDNA，从起始密码子、终止密码子的存在、与同源物序列相对比，推测序列号4的第1-3位的ATG为起始密码子，第1587‐1589位为终止密码子。因此，合成了以下的引物。
Bam-ADR-F:5’-GGATCCATGGCCTCGTCTAAAAAGATCGTCCT-3’（序列号5）
Sal-ADR-R:5’-GTCGACTACTTTCCAACGACCTTGCCATCC-3’（序列号6）
以M.alpina1S-4株的cDNA为模板，通过引物Bam-ADR-F和Sal-ADR-R、KOD-Plus（TOYOBO）进行PCR扩增时，扩增了约0.87kb的DNA片段。将其使用ZeroBluntTOPOPCR克隆试剂盒（Invitrogen）进行克隆，将所得到的质粒作为pCR-MaADR1。该质粒的插入片段的序列、即MaADR1基因的CDS序列如序列号3所示。且MaADR1基因的ORF序列如序列号1所示。
序列分析
对比MaADR1基因的基因组序列（序列号4）和CDS序列（序列号3）时，推测该基因的基因组序列由5个外显子、4个内含子组成（图1），编码由242个的氨基酸残基组成的蛋白质（图2）。
将MaADR1的推定氨基酸序列（序列号2）相对于在GENEBANKnr注册的氨基酸序列使用BLASTp进行同源性分析。其结果，相对于该序列E-value最低的氨基酸序列、即同一性高的氨基酸序列为来自团藻(Volvoxcarterif.nagariensis)（绿藻类）的推定蛋白质（GENEBANKaccessionNo.XP_002946364），氨基酸序列的同一性为34.7%。此外，MaADR1的推定氨基酸序列显示出与来自酿酒酵母（S.cerevisiae）的AYR1p的氨基酸序列有25.6%的同一性，与IFA38的氨基酸序列有13.6%的同一性。
来自MaADR1、团藻(Volvoxcarterif.nagariensis)（绿藻类）的推定蛋白质（GENEBANKaccessionNo.XP_002946364）及来自酿酒酵母（S.cerevisiae）的AYR1p的各氨基酸序列的对比如图3所示。
MaADR1的功能分析
酵母用表达载体的构建
将用限制性内切酶BamHI和SalI酶切酵母表达用载体pYE22m（Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221-1228,1995）后的DNA片段与用限制性内切酶BamHI和SalI酶切质粒pCR-MaADR1而得到的约0.87Kbp的DNA片段用高效连接试剂盒（ligationhigh）（东洋纺（TOYOBO））连接，构建质粒pYE-MaADR1。转化酵母的获得
分别使用质粒pYE22m、pYE-MaADR1通过醋酸锂法转化酵母S.cerevisiaeEH13-15株（trp1，MATα）（Appl.Microbiol.Biotechnol.,30,515-520,1989）。转化株筛选在SC-Trp（每1l中，无氨基酸酵母氮源（Yeastnitrogenbasew/oaminoacids）（DIFCO）6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉（腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物）1.3g）琼脂培养基（2%琼脂）上生长繁殖的菌株。
酵母的培养
将使用质粒pYE22m转化而得到的任意的4株和使用质粒pYE-MaADR1转化而得到的任意的4株供给以下的培养实验。作为预培养，从培养板中取1白金耳酵母接种到10mlSC-Trp培养基中，在30℃下振荡培养1天。主培养为在10mlSC-Trp培养基中添加100μl预培养液，在30℃下振荡培养2天。
菌体的脂肪酸分析
通过离心分离酵母的培养液而回收菌体。用10ml灭菌水洗涤，通过离心分离再次回收菌体，冷冻干燥。在冷冻干燥菌体中加入1ml的氯仿:甲醇（2:1）和玻璃珠，用珠磨式组织研磨器（BeadBeater）破碎菌体后，离心分离回收上清。在剩余的菌体中进一步重复加入1ml的氯仿:甲醇（2:1）并同样地回收上清的操作，用总量4ml的氯仿:甲醇（2:1）回收脂质。使用真空离心蒸发浓缩器（SpeedVac）馏去溶剂。将试样溶解于1ml的氯仿中。
取200μl该试样，通过盐酸甲醇法将脂肪酸衍生成甲酯，通过气相色谱法进行脂肪酸分析，求出菌体内的总脂肪酸的组成。
结果如以下表1所示。在使MaADR1基因高表达的菌株中，与对照菌株相比，总脂肪酸中C18的脂肪酸所占的比率上升，C16脂肪酸所占的比率下降。即脂肪酸的链延长反应被活化。
表1
表1菌体内的总脂肪酸的组成比
取400μl上述试样，馏去溶剂后，溶解于少量的氯仿中，以供给薄层色谱法。即在硅胶60培养板(默克（Merck）)、展开溶剂己烷:二乙醚:醋酸70:30:1的条件下进行薄层色谱分析，分离脂质。将樱草灵溶液喷雾，通过照射紫外线检测脂质。分别刮取三酰甘油(TG)组分和磷脂(PL)组分收集到试管中，通过盐酸甲醇法将脂肪酸衍生为甲酯，通过气相色谱法进行脂肪酸分析
三酰甘油组分的脂肪酸组成和磷脂组分的脂肪酸组成如表2及3所示。
表2
表2菌体内的三酰甘油组分的脂肪酸组成比
表3
表3菌体内的磷脂组分的脂肪酸组成比
观察三酰甘油组分的脂肪酸组成时，在使MaADR1高表达的菌株中，与对照相比，C18的脂肪酸的比率上升，C16的脂肪酸的比率下降。另一方面，观察磷脂组分的脂肪酸组成时，使MaADR1高表达的菌株与对照菌株的脂肪酸组成比基本相同。
即，使MaADR1在酵母中高表达时，构成三酰甘油的脂肪酸的组成变为更长链的脂肪酸的比率升高。
通过使本发明的多核苷酸在适合的宿主细胞内表达，可高效生成碳原子数18以上的长链脂肪酸及包含该长链脂肪酸的三酰甘油。通过本发明在宿主细胞内生成的脂肪酸可用于食品、化妆品、医药、肥皂等的制造。
序列表自由内容（freetext）
序列号5:合成DNA
序列号6:合成DNA

Claims (13)

1.一种多核苷酸，其特征在于，选自由以下构成的组：
(a)多核苷酸，由序列号1或4的碱基序列组成；和
(b)多核苷酸，编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，含有序列号1或4的碱基序列。
3.根据权利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，为DNA。
5.一种蛋白质，其特征在于，由权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸编码。
6.一种载体，其特征在于，含有权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸。
7.一种非人体细胞，其特征在于，导入了权利要求1～4中任一项所述的多核苷酸。
8.一种非人体细胞，其特征在于，导入了权利要求6中所述的载体。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的细胞，其特征在于，为脂质生产菌的细胞。
10.根据权利要求9中所述的细胞，其特征在于，所述脂质生产菌为高山被孢霉。
11.一种脂质或脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，从权利要求10所述的细胞的培养物中采集脂质或脂肪酸组合物。
12.根据权利要求11中所述的方法，其特征在于，所述脂质为三酰甘油。
13.根据权利要求11中所述的方法，其特征在于，所述脂肪酸为碳原子数18以上的脂肪酸。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN2015DN01858A (zh) * 2012-08-10 2015-05-29 Opx Biotechnologies Inc
US20150057465A1 (en) 2013-03-15 2015-02-26 Opx Biotechnologies, Inc. Control of growth-induction-production phases
JP6603658B2 (ja) 2013-07-19 2019-11-06 カーギル インコーポレイテッド 脂肪酸及び脂肪酸誘導体の製造のための微生物及び方法
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
JP6778207B2 (ja) * 2015-10-30 2020-10-28 サントリーホールディングス株式会社 Ａｏｂｇｌ３ホモログを用いたステビオール配糖体およびステビオールの製造方法
CN110494566A (zh) 2017-02-02 2019-11-22 嘉吉公司 产生c6-c10脂肪酸衍生物的经遗传修饰的细胞

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1954079A (zh) * 2004-03-01 2007-04-25 三得利株式会社 含有作为构成要素的长链高不饱和脂肪酸的磷脂质的制造方法及其应用
WO2011078134A1 (ja) * 2009-12-21 2011-06-30 サントリーホールディングス株式会社 ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子及びその用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030163845A1 (en) * 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
JP4481702B2 (ja) 2004-03-31 2010-06-16 サントリーホールディングス株式会社 脂質生産菌の育種方法およびその利用
US7470532B2 (en) * 2005-10-19 2008-12-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina C16/18 fatty acid elongase
AU2007226510B2 (en) * 2006-03-15 2013-09-19 Dsm Ip Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems
US7695950B2 (en) * 2006-05-17 2010-04-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ5 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
CN107858204B (zh) * 2008-11-18 2021-10-29 联邦科学技术研究组织 产生ω-3脂肪酸的酶和方法
WO2010147138A1 (ja) 2009-06-18 2010-12-23 サントリーホールディングス株式会社 脂肪酸鎖長延長酵素をコードする遺伝子およびその用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1954079A (zh) * 2004-03-01 2007-04-25 三得利株式会社 含有作为构成要素的长链高不饱和脂肪酸的磷脂质的制造方法及其应用
WO2011078134A1 (ja) * 2009-12-21 2011-06-30 サントリーホールディングス株式会社 ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子及びその用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The Saccharomyces cerevisiae YBR159w Gene Encodes the 3-Ketoreductase of the Microsomal Fatty Acid Elongase;Gongshe Han等;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20020626;第277卷(第38期);35440-35449 *

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