KR20140041483A

KR20140041483A - 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질, 이것을 코드하는 유전자 및 그 용도

Info

Publication number: KR20140041483A
Application number: KR1020137029958A
Authority: KR
Inventors: 미사 오치아이
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2011-08-04
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2014-04-04
Also published as: CN103717736A; BR112014002418A2; EP2740797A1; EP2740797B1; CA2843552A1; JP5632085B2; WO2013018879A1; JPWO2013018879A1; DK2740797T3; KR101437308B1; CA2853849C; US8980591B2; AU2012290942B2; CA2853849A1; CN103717736B; US20140242648A1; AU2012290942A1; EP2740797A4; RU2556375C1

Abstract

본 발명은, 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성, 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드 등에 관한 것이다. 본 발명은, 예컨대, 서열 번호 1 또는 4의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터 및 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하는 지질 또는 지방산의 제조 방법, 또는 그와 같은 제법에 의해서 제조된 지질 또는 지방산을 함유하는 식품 등을 제공한다.

Description

지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질, 이것을 코드하는 유전자 및 그 용도{PROTEIN EXHIBITING FATTY ACID ELONGATION PROMOTING ACTIVITY, GENE ENCODING SAME AND USE THEREOF}

본 발명은, 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 신규 단백질, 이것을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 그 이용 방법에 관한 것이다.

효모 등의 미생물에 있어서, 지방산의 쇄 길이 연장 반응은, (i) 지방산아실-CoA와 말로닐-CoA의 축합 반응, (ii) 축합 생성물인 3-옥소아실-CoA의 환원 반응, (iii) 3-히드록시아실-CoA의 탈수 반응, (iv) trans-2-에노일-CoA의 환원 반응이라는, 4단계의 반응을 거쳐 탄소수가 2개씩 증가하여, 쇄 길이가 연장된다(비특허문헌 1).

상기 (i)∼(iv)의 반응은, 각각 (i) 3-케토아실-CoA 신타아제, (ii) β-케토아실 리덕타아제, (iii) 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나아제, (iv) 에노일-CoA 리덕타아제의 효소가 매개하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1).

이들 효소 중, 축합 반응을 담당하는 3-케토아실-CoA 신타아제는, 기질이 되는 지방산에 대하여 특이성을 나타내는 것이 알려져 있고, 여러가지 생물로부터, 여러가지 특이성을 갖는 효소가 클론화되어 있다.

특히, 진균류에서 가장 잘 연구되어 있는 효모에서는, 지방산 쇄 길이 연장 반응의 4단계의 반응 전부에 있어서, 각 반응을 담당하는 효소와 그것을 코드하는 유전자가 밝혀져 있다.

예컨대, 효모에 있어서 β-케토아실 리덕타아제 활성을 담당하는 효소를 코드하는 유전자로서 IFA38과 AYR1의 2개가 알려져 있고, 또한, 이들을 동시에 결실시키면 치사(致死)인 것도 알려져 있다(비특허문헌 2). 또, AYR1 유전자는, 1-아실디히드록시아세톤포스페이트 리덕타아제 활성을 갖는 것도 알려져 있다(비특허문헌 3).

한편, 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나아제 활성을 담당하는 효소를 코드하는 유전자로는, PHS1(필수)이 알려져 있고, 에노일-CoA 리덕타아제 활성을 담당하는 효소를 코드하는 유전자로는, TSC13(필수)이 보고되어 있다.

이에 비하여, 지질 생산균인 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina(M. 알피나))에서는, 지방산 쇄 길이 연장에 관한 최초의 반응을 담당하는 3-케토아실-CoA 신타아제(소위 쇄 길이 연장 효소) 유전자(MALCE1(ELO3), MALCE2, GLELO, MAELO)가 알려져 있지만(특허문헌 1), 3-케토아실-CoA 신타아제 이외의 효소의 유전자는 알려져 있지 않다.

특허문헌 1 : 국제공개공보 WO2010/147138호

비특허문헌 1 : Kihara A., et al., (2008) J. Biol. Chem. 283, 11199-11209 비특허문헌 2 : Han, G. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277, 35440-35449 비특허문헌 3 : Athenstaedt, K., and Daum, G. (2000) J. Biol. Chem. 275, 235-240

상기와 같은 상황하에서, M. 알피나 세포 내에서의 지방산 쇄 길이 연장 반응에 관련된 새로운 단백질 또는 이것을 코드하는 유전자를 얻는 것이 요구되고 있다.

본 발명자들은, 예의 연구의 결과, 효모의 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나아제인 AYR1의 호모로그 단백질 MaADR1을 코드하는 유전자를 클로닝하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은, 이하의 폴리뉴클레오티드, 단백질, 발현 벡터, 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하는 지질 또는 지방산 조성물 및 식품 등의 제조방법, 및 그와 같은 제법에 의해서 제조된 식품 등을 제공한다.

구체적으로는, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 이하의 (a)∼(e)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 :

(a) 서열 번호 1 또는 4의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 1∼100개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;

(d) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대하여, 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및

(e) 서열 번호 1 또는 4의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.

[2] 이하의 (f) 또는 (g)의 어느 하나인 상기 [1]에 기재된 폴리뉴클레오티드:

(f) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및

(g) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대하여, 75% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.

[3] 서열 번호 1 또는 4의 염기 서열을 함유하는 상기 [1]에 기재된 폴리뉴클레오티드.

[4] 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 상기 [1]에 기재된 폴리뉴클레오티드.

[5] DNA인 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드.

[6] 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질.

[7] 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.

[8] 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 비인간 형질전환체.

[9] 상기 [7]에 기재된 벡터가 도입된 비인간 형질전환체.

[10] 상기 형질전환체가 지질 생산균인 상기 [8] 또는 [9]에 기재된 형질전환체.

[11] 상기 지질 생산균이 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)인 상기 [10]에 기재된 형질전환체.

[12] 상기 [8]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 형질전환체의 배양물로부터, 지질 또는 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 지질 또는 지방산 조성물의 제조 방법.

[13] 상기 지질이 트리아실글리세롤인 상기 [12]에 기재된 방법.

[14] 상기 지방산이 탄소수 18 이상인 것인 상기 [12]에 기재된 방법.

[15] 상기 [12]에 기재된 제조방법에 의해 채취된 지질 또는 지방산 조성물을 함유하는 식품, 의약품, 화장품 또는 비누.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 지질 생산균(예컨대, M. 알피나), 효모, 식물 등의 형질전환에 이용할 수 있고, 그와 같이 하여 얻어지는 형질전환 지질 생산균, 형질전환 효모 또는 형질전환 식물 등은 지방산 조성물, 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 제조에 이용할 수 있다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 형질전환체는, 지질 및 지방산의 생산 효율이 매우 높다. 따라서, 본 발명은, 대량의 지질 또는 지방산을 필요로 하는 의약품 혹은 건강 식품의 제조에 유효하게 사용할 수 있다.

도 1은 MaADR1의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 나타낸 도면이다.
도 2는 MaADR1의 CDS 서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 3은 MaADR1, Volvox carterif. nagariensis(녹조류) 유래의 추정 단백질(GENEBANK accession No. XP_002946364) 및 S. cerevisiae 유래의 AYR1p의 각 아미노산 서열의 얼라이먼트를 나타낸 도면이다(도면 중, 이중 하선부는 NADPH 결합 부위를 나타내고, 별표(*)를 붙인 부분은 활성 중심을 나타낸다).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 이하의 실시형태는, 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명을 이 실시형태에만 한정하는 취지는 아니다. 본 발명은, 그 요지를 일탈하지 않는 한, 여러가지 형태로 실시를 할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 인용한 모든 문헌 및 공개 공보, 특허 공보, 기타 특허 문헌은, 참조로서 본 명세서에 포함시키는 것으로 한다. 또, 본 명세서는, 2011년 8월 4일에 출원된 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허 출원(일본 특허 출원 2011-171044호)의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.

본 발명자들은, 후술하는 실시예에서 상세히 기재하는 바와 같이, 지질 생산균인 M. 알피나로부터 AYR1의 호모로그의 유전자(MaADR1)의 전장 cDNA의 클로닝에 처음으로 성공했다. 또, 본 발명자들은, M. 알피나 유래의 MaADR1의 게놈 DNA의 염기 서열, 및 추정 아미노산 서열도 동정했다. MaADR1의 ORF 서열, 추정 아미노산 서열, CDS 서열 및 게놈 서열은, 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4이다. 이들 폴리뉴클레오티드 및 효소는, 후술하는 실시예에 기재한 방법, 공지의 유전자공학적 방법, 공지의 합성 방법 등에 의해서 취득하는 것이 가능하다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

우선, 본 발명은, 이하의 (a)∼(e)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 명세서 중, 「폴리뉴클레오티드」란 DNA 또는 RNA를 의미한다.

본 명세서 중, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」란, 예컨대, 서열 번호 1 또는 4의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 프로브로서, 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법 또는 서던 하이브리다이제이션법 등을 이용하는 것에 의해 얻어지는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 하이브리다이제이션의 방법으로는, 예컨대, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001" 및 "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997" 등에 기재되어 있는 방법을 이용할 수 있다.

본 명세서 중, 「스트린젠트한 조건」이란, 저 스트린젠트한 조건, 중간 스트린젠트한 조건 및 고 스트린젠트한 조건의 어느 것이어도 좋다. 「저 스트린젠트한 조건」은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 32℃의 조건이다. 또, 「중간 스트린젠트한 조건」은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 42℃ 또는 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50% 포름아미드, 42℃의 조건이다. 「고 스트린젠트한 조건」은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 50℃ 또는 0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃의 조건이다. 이러한 조건에서, 온도를 높일수록 높은 동일성을 갖는 DNA가 효율적으로 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 미치는 요소로는 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 이온 강도, 시간, 염농도 등의 복수의 요소를 생각할 수 있고, 당업자라면 이러한 요소를 적절하게 선택함으로써 동일한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.

또한, 하이브리다이제이션에 시판하는 키트를 이용하는 경우는, 예컨대 Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)을 이용할 수 있다. 이 경우는, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라서, 표지한 프로브와의 인큐베이션을 하룻밤 행한 후, 멤브레인을 55℃의 조건하에서 0.1%(w/v) SDS를 포함하는 1차 세정 버퍼로 세정후, 하이브리다이즈한 DNA를 검출할 수 있다. 또는, 서열 번호 1 또는 4의 염기 서열과 상보적인 염기 서열, 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열의 전부 또는 일부에 기초하여 프로브를 제작할 때, 시판하는 시약(예컨대, PCR 라벨링 믹스(로슈 다이아그노스틱스사) 등)을 이용하여 상기 프로브를 디곡시게닌(DIG) 라벨한 경우에는, DIG 핵산 검출 키트(로슈 다이아그노스틱스사)를 이용하여 하이브리다이제이션을 검출할 수 있다.

상기 이외에 하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오티드로는, FASTA, BLAST 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해, 디폴트의 파라미터를 이용하여 계산했을 때, 서열 번호 1 또는 4의 DNA, 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코드하는 DNA와 50% 이상, 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 DNA를 들 수 있다.

또한, 아미노산 서열이나 염기 서열의 동일성은, FASTA(Science 227(4693) : 1435-1441, (1985))나, 컬린 및 앨트슐에 의한 알고리즘 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90 : 5873, 1993)를 이용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘에 기초한 blastn, blastx, blastp, tblastn이나 tblastx라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul SF, et al : J Mol Biol 215 : 403, 1990). blastn을 이용하여 염기 서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예컨대 score=100, wordlength=12로 한다. 또, blastp를 이용하여 아미노산 서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예컨대 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 이용한다.

상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 공지의 유전자공학적 방법 또는 공지의 합성 방법에 의해 취득하는 것이 가능하다.

2. 본 발명의 단백질

본 발명은, 다음 (i)∼(iv)에 나타내는 단백질을 제공한다.

(i) 상기 (a)∼(e)의 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질

(ii) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질

(iii) 서열 번호 2의 아미노산 서열에서의 하나 또는 복수개의 아미노산이, 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질

(iv) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대하여 75% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질

상기 (iii) 또는 (iv)에 기재된 단백질은, 대표적으로는, 천연에 존재하는 서열 번호 2의 단백질의 변이체이지만, 예컨대, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", "Nuc. Acids. Res., 10, 6487(1982)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)", "Gene, 34, 315(1985)", "Nuc. Acids. Res., 13, 4431(1985)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)" 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여, 인위적으로 취득할 수 있는 것도 포함된다.

본 명세서 중, 「서열 번호 2의 아미노산 서열에서의 하나 또는 복수개의 아미노산이, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질」로는, 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대, 1∼100개, 1∼90개, 1∼80개, 1∼70개, 1∼60개, 1∼50개, 1∼40개, 1∼39개, 1∼38개, 1∼37개, 1∼36개, 1∼35개, 1∼34개, 1∼33개, 1∼32개, 1∼31개, 1∼30개, 1∼29개, 1∼28개, 1∼27개, 1∼26개, 1∼25개, 1∼24개, 1∼23개, 1∼22개, 1∼21개, 1∼20개, 1∼19개, 1∼18개, 1∼17개, 1∼16개, 1∼15개, 1∼14개, 1∼13개, 1∼12개, 1∼11개, 1∼10개, 1∼9개(1∼수개), 1∼8개, 1∼7개, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개, 1∼2개, 또는 1개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는, 일반적으로는 작을수록 바람직하다.

또, 이러한 단백질로는, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 동일성의 수치는 일반적으로 클수록 바람직하다.

임의의 단백질이 「지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성」을 갖는 경우, 상기 단백질을 효모, 지질 생산균 및 식물 세포 등의 적절한 숙주 세포로 발현시킨 경우, 발현시키지 않은 동종 세포와 비교해서, 그 세포가 합성할 수 있는 지방산 중, 보다 탄소수가 많은 지방산의 함유량이 증가한다. 이 때, 상기 「보다 탄소수가 많은 지방산」의 합성에, 이것보다 탄소수가 2 적은 지방산이 사용되므로, 상기 탄소수가 2 적은 지방산의 양은 감소해도 좋다.

구체적으로는, 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을, 상기 적절한 숙주 세포로 발현시킨 경우, 발현시키지 않은 동종 세포와 비교해서, (i) 탄소수 16의 지방산량이 감소하고, 탄소수 18의 지방산량이 증가하거나, (ii) 탄소수 17의 지방산량이 감소하고, 탄소수 19의 지방산량이 증가하거나, (iii) 탄소수 18의 지방산량이 감소하고, 탄소수 20의 지방산량이 증가하거나, (iv) 탄소수 20의 지방산량이 감소하고, 탄소수 22의 지방산량이 증가하거나, (v) 탄소수 22의 지방산량이 감소하고, 탄소수 24의 지방산량이 증가하거나, (vi) 탄소수 24의 지방산량이 감소하고, 탄소수 26의 지방산량이 증가하거나, (vii) 탄소수 26의 지방산량이 감소하고, 탄소수 28의 지방산량이 증가하거나, 또는 (viii) 탄소수 28의 지방산량이 감소하고, 탄소수 30의 지방산량이 증가한다.

또한, 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성은, Han, G. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277, 35440-35449에 기재된 방법에 따라서 측정할 수 있다.

또, 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 확인하는 방법으로는, 효모, 지질 생산균 및 식물 세포 등의 적절한 숙주 세포를 이용한 실험을 들 수 있다. 본 발명의 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내에서 발현시킨 경우에, 보다 쇄 길이가 긴 지방산의 생성량이 증가하면, 그 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질 또는 펩티드는 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는다고 할 수 있다. 본 발명자들은, 실시예에서, 효모 세포 내에서 본 발명의 단백질을 발현시켜, 가스 크로마토그래피를 이용하여, 상기 효모 세포에 포함되는 지방산 조성을 분석한 바, 탄소수 16의 지방산량이 감소하고, 탄소수 18의 지방산량이 증대한 것을 확인했다.

효모는, 탄소수 18까지의 지방산만 합성할 수 있기 때문에, 실시예에서는 탄소수 18의 지방산의 양이 증가했지만, 탄소수가 18보다 많은 지방산, 예컨대, 탄소수 19 또는 20의 지방산을 합성 가능한 세포(예컨대, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina))를 숙주로서 이용한 경우, 그 숙주 세포가 합성할 수 있는 지방산 중, 보다 탄소수가 많은 지방산(예컨대, 가장 탄소수가 많은 지방산)(예컨대, 모르티에렐라 알피나라면, 탄소수 20의 지방산)의 양이 증가하는 것으로 생각된다.

본 발명의 단백질은, 바람직하게는, 트리아실글리세롤에 포함되는 지방산에 대하여, 쇄 길이 연장 촉진 활성을 나타낸다.

또, 본 발명의 단백질에 의해 쇄 길이 연장되는 지방산은, 포화 지방산 또는 불포화 지방산의 어느 것이어도 좋지만, 바람직하게는 불포화 지방산이고, 더욱 바람직하게는, 1가, 2가, 3가 또는 4가의 불포화 지방산이다.

본 발명의 단백질은, 효모 유래의 AYR1 단백질의 호모로그 단백질이기 때문에, AYR1과 마찬가지로, β-케토아실 리덕타아제 활성을 갖는 것으로 생각된다. 효모에서는, β-케토아실 리덕타아제 활성을 갖는 유전자로서, AYR1 외에 IFA38이 알려져 있고, 이들 2개를 동시에 파괴하면 치사인 것이 알려져 있다(Han, G. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277, 35440-35449). 본 발명의 단백질이 β-케토아실 리덕타아제 활성을 갖는지의 여부는, AYR1 유전자 및 IFA38 유전자를 파괴한 효모주에 있어서, 본 발명의 단백질을 발현시키면 동주(同株)가 생육할 수 있는지, 또는, β-케토아실 리덕타아제 활성이 보충될 수 있는지의 여부를 조사하는 것에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되었다는 것은, 동일 서열 중의 임의의, 또한 하나 또는 복수의 아미노산 서열 중의 위치에서, 하나 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가가 있는 것을 의미하며, 결실, 치환, 삽입 및 부가중 2종 이상이 동시에 생겨도 좋다.

이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 예를 나타낸다. 동일군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다. A군 : 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; B군 : 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베린산; C군 : 아스파라긴, 글루타민; D군 : 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; E군 : 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; F군 : 세린, 트레오닌, 호모세린; G군 : 페닐알라닌, 티로신.

또, 본 발명의 단백질은, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또, Advanced Automation Peptide Protein Technologies사 제조, Perkin Elmer사 제조, Protein Technologies사 제조, PerSeptive사 제조, Applied Biosystems사 제조, SHIMADZU사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 이것을 도입한 형질전환 체

본 발명은 또한, 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터는 통상,

(i) 숙주 세포 내에서 전사 가능한 프로모터;

(ii) 상기 프로모터에 결합한, 상기 (a)∼(g) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드; 및

(iii) RNA 분자의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관해, 숙주 세포 내에서 기능하는 시그널을 구성 요소로서 포함하는 발현 카세트

를 포함하도록 구성된다.

이와 같이 구축되는 벡터는 숙주 세포에 도입된다. 본 발명에서 사용되는 적절한 숙주 세포의 예로는, 지질 생산균, 효모 등을 들 수 있다.

지질 생산균으로는, 예컨대, MYCOTAXON, Vol. XLIV, No. 2, pp. 257-265(1992)에 기재되어 있는 균주를 사용할 수 있고, 구체적으로는, 모르티에렐라(Mortierella)속에 속하는 미생물, 예컨대, 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS 219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 모르티에렐라 아속(subgenus Mortierella)에 속하는 미생물, 또는 모르티에렐라 이사벨리나(Mortierella isabellina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, 모르티에렐라 나나(Mortierella nana) IFO8190, 모르티에렐라 라마니아나(Mortierella ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, 모르티에렐라 비나세아(Mortierella vinacea) CBS236.82 등의 마이크로뮤코 아속(subgenus Micromucor)에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 특히, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)가 바람직하다.

또, 효모의 예로는, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) EH13-15, NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954 등을 들 수 있다.

본 발명의 벡터로 형질전환된 이들 숙주 세포에서는, 본 발명의 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포에 비해, 쇄 길이가 긴 지방산(예컨대, 탄소수 18, 19 또는 20의 지방산 또는 그 이상의 탄소수를 갖는 지방산)의 양이 증가하고 있다. 바람직하게는, 상기 지방산은, 트리아실글리세롤(「트리글리세리드」라고도 불림)에 포함되는 지방산이다.

지질 생산균에 도입할 때 이용하는 벡터로는, 예컨대, pDura5(Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004))를 이용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

효모에 도입할 때에 이용하는 벡터로는, 효모 세포 내에서 인서트를 발현하는 활성을 갖는 벡터라면 특별히 한정되지 않지만, 예로는, pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)을 들 수 있다.

숙주 세포 중에서의 유전자 발현을 조절하기 위한 프로모터/터미네이터로는, 숙주 세포 중에서 기능하는 한, 임의의 조합이면 된다. 예컨대, 지질 생산균에서 이용하는 경우는 histon H4.1 유전자의 프로모터, 글리세르알데히드-3-인산데히드로게나아제 유전자의 프로모터 등을 이용할 수 있다.

형질전환시에 이용하는 선택 마커로는, 영양 요구성 마커(ura5, niaD, trp1), 약제 내성 마커(하이그로마이신(hygromycine), 제오신), 제네티신 내성 유전자(G418r), 구리 내성 유전자(CUP1)(Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984), 세룰레닌 내성 유전자(fas2m, PDR4)(각각 이노코시 쥰지 등, 생화학, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991) 등을 이용할 수 있다.

숙주 세포의 형질전환 방법으로는, 일반적으로 이용되는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 지질 생산균의 경우, 일렉트로포레이션법(Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000)이나 파티클 딜리버리법(일본 특허 공개 제2005-287403 「지질 생산균의 육종 방법」에 기재된 방법)을 이용할 수 있다. 또, 효모의 경우는, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriology, 153, p163(1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 등에 기재된 방법으로 실시할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

기타, 일반적인 클로닝 기술에 관해서는, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)" 등을 참조할 수 있다.

4. 본 발명의 지질 또는 지방산 조성물의 제조방법

본 발명은 또한, 다른 실시형태에서, 상기 형질전환 지질 생산균 또는 효모를 이용하는 지질 또는 지방산 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 명세서 중 「지질」이란, 지방산과 알콜이 에스테르 결합한 화합물(예컨대 글리세리드) 또는 그 유사체(예컨대, 콜레스테롤에스테르) 등을 포함하는 단순 지질, 단순 지질의 일부에 인산, 아미노산, 당 등이 더 결합한 복합 지질, 및 지질의 가수분해물로 물에 녹지 않는 유도 지질을 말하는 것으로 한다.

본 명세서 중 「유지」란, 글리세롤과 지방산의 에스테르(글리세리드)를 말한다.

본 명세서 중 「지방산」이란, 일반식 RCOOH(R은 알킬기)로 표시되는 지방족 모노카르복실산(카르복실기를 1개 가지며, 탄소 원자가 쇄형으로 연결된 카르복실산)을 말한다. 지방산에는, 탄화수소쇄 중에 이중 결합을 갖지 않는 포화 지방산과, 이중 결합을 포함하는 불포화 지방산이 포함된다.

본 발명의 지질 또는 지방산 조성물은, 본 발명에 따라서 형질전환한 세포로부터 이하와 같이 하여 추출할 수 있다. 생물(예컨대, 지질 생산균 또는 효모)의 형질전환주에 대해, 배양 종료후, 원심 분리법, 여과 등의 통상법에 따라서 배양 세포를 얻는다. 세포를 충분히 물로 세정하고, 바람직하게는 건조시킨다. 건조는, 동결 건조, 바람 건조 등에 의해 행할 수 있다. 건조 세포를, 필요에 따라서, 다이노밀이나 초음파 등에 의해 파쇄한 후, 바람직하게는 질소 기류하에 유기 용매에 의해서 추출 처리한다. 유기 용매로는 에테르, 헥산, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 석유 에테르 등을 이용할 수 있고, 또는 메탄올 및 석유 에테르의 교대 추출 또는 클로로포름-메탄올-물의 1층계의 용매를 이용한 추출에 의해서도 양호한 결과를 얻을 수 있다. 추출물로부터 감압하에 유기 용매를 증류 제거함으로써, 지방산을 함유하는 지질을 얻을 수 있다. 추출한 지방산은, 염산메탄올법 등에 의해서 메틸에스테르화해도 좋다.

또한, 상기 지방산을 함유하는 지질로부터의 지방산의 분리는, 혼합 지방산 또는 혼합 지방산 에스테르의 상태로, 통상법(예컨대, 요소 부가법, 냉각 분리법, 컬럼 크로마토그래피법 등)에 의해 농축 분리함으로써 행할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 지질은, 바람직하게는 트리아실글리세롤이고, 보다 바람직하게는, 탄소수 18 이상의 지방산을 함유하는 트리아실글리세롤이다.

또, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 지방산은, 바람직하게는, 탄소수 18 이상의 지방산이고, 더욱 바람직하게는, 트리아실글리세롤에 함유되는 탄소수 18 이상의 지방산이다.

탄소수 18 이상의 지방산의 예로는, 스테아르산(18:0), 올레산(18:1(9)), 박센산(18:1(11)), 리놀레산(18:2(9,12)), α-리놀렌산(18:3(9,12,15)), γ-리놀렌산(18:3(6,9,12)), 엘레오스테아르산(18:3(9,11,13)), 아라키딘산(20:0), 에이코센산(20:1Δ11), 8,11-에이코사디엔산(20:2(8,11)), 5,8,11-에이코사트리엔산(20:3(5,8,11)), 아라키돈산(20:4(5,8,11,14)), 베헨산(22:0), 리그노세린산(24:0), 네르본산(24:1), 세로틴산(26:0), 몬탄산(28:0) 및 멜리스산(30:0)을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 지방산은, 포화 지방산 또는 불포화 지방산의 어느 것이어도 좋지만, 바람직하게는 불포화 지방산이고, 더욱 바람직하게는, 1가, 2가, 3가 또는 4가의 불포화 지방산이다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 지질 및 상기 지질에 포함되는 지방산의 조성은, 상기 지질의 추출 방법, 지방산의 분리 방법 또는 이들의 조합에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 지질 또는 지방산 조성물은, 통상법에 따라서, 예컨대, 유지를 포함하는 식품, 의약품, 공업 원료(화장료, 비누 등의 원료)의 제조 등의 용도로 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 다른 실시형태에서, 본 발명의 형질전환 지질 생산균 또는 형질전환 효모를 이용하는 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 제조방법을 제공한다. 이 방법은, 본 발명의 형질전환 지질 생산균 또는 형질전환 효모를 이용하여 지질 또는 지방산을 생성하는 공정을 포함한다. 생성된 지질 또는 지방산을 함유하는 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 조제는, 통상법에 의한다. 이와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 식품, 화장료, 의약, 비누 등은, 본 발명의 형질전환 지질 생산균 또는 형질전환 효모를 이용하여 생성된 지질 또는 지방산을 함유한다. 본 발명은 또한, 그와 같은 방법에 의해서 제조된 식품, 화장료, 의약, 비누 등을 제공한다.

본 발명의 화장품(조성물) 또는 의약품(조성물)의 제형은, 특별히 한정되지 않고, 용액형, 페이스트형, 겔형, 고체형, 분말형 등 임의의 제형을 취할 수 있다. 또, 본 발명의 화장료 조성물 또는 의약 조성물은, 오일, 로션, 크림, 유액, 겔, 샴푸, 헤어린스, 헤어컨디셔너, 에나멜, 파운데이션, 립스틱, 분, 팩, 연고, 향수, 파우더, 오데코롱, 치약, 비누, 에어로졸, 클렌징폼 등의 화장료 또는 피부 외용약 외에, 피부 노화 방지 개선제, 피부 염증 방지 개선제, 욕용제, 양모제, 피부 미용액, 썬블록 또는, 외상, 살갗 틈, 갈라짐 등에 의한 피부 거칠음의 방지 개선제 등에 이용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은, 필요에 따라서, 그 밖의 유지, 및/또는 색소, 향료, 방부제, 계면 활성제, 안료, 산화 방지제 등을 적절하게 더 배합할 수 있다. 이들의 배합 비율은, 목적에 따라서 당업자가 적절하게 결정할 수 있다(예컨대, 유지는, 조성물 중에 1∼99.99 중량%, 바람직하게는 5∼99.99 중량%, 보다 바람직하게는 10∼99.95 중량% 함유될 수 있음). 또, 본 발명의 의약 조성물은, 필요에 따라서, 그 밖의 의약 활성 성분(예컨대, 소염 성분) 또는 보조 성분(예컨대, 윤활 성분, 담체 성분)을 더 포함하고 있어도 좋다. 예컨대, 화장료 혹은 피부 외용약에서의 그 밖의 상용 성분으로는, 여드름용 약제, 비듬ㆍ가려움 방지제, 제한 방취제, 열상용 약제, 항진드기ㆍ이(蝨)제, 각질 연화제, 건피증용 약제, 항바이러스제, 경피 흡수 촉진제 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품의 예로는, 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 유아용 조제유, 미숙아용 조제유, 노인용 식품 등을 들 수 있다. 본 명세서 중, 식품은, 고체, 유동체 및 액체, 및 이들의 혼합물이며, 섭식 가능한 것의 총칭이다.

영양 보조 식품이란, 특정한 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 건강 식품이란, 건강적인 또는 건강에 좋다고 여겨지는 식품을 말하며, 영양 보조 식품, 자연식품, 다이어트 식품 등을 포함한다. 기능성 식품이란, 몸의 조절 기능을 하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하며, 특정 보건용 식품과 동일한 의미이다. 유아용 식품이란, 약 6세까지의 아이를 위한 식품을 말한다. 노인용 식품이란, 무처리한 식품과 비교하여 소화 및 흡수가 용이하도록 처리된 식품을 말한다. 유아용 조제유란, 약 1세까지의 아이를 위한 조제유를 말한다. 미숙아용 조제유란, 미숙아가 생후 약 6개월이 될 때까지를 위한 조제유를 말한다.

이들 식품의 형태의 예로는, 고기, 생선, 넛츠 등의 천연식품(유지로 처리한 것), 중화요리, 라면, 스프 등의 조리시에 유지를 가하는 식품, 튀김, 후라이, 유부, 볶음밥, 도넛, 카린토 등의 열매체로서 유지를 이용한 식품, 버터, 마가린, 마요네즈, 드레싱, 쵸콜릿, 즉석 라면, 캬라멜, 비스킷, 쿠키, 케이크, 아이스크림 등의 유지 식품 또는 가공시에 유지를 가한 가공 식품, 오카키, 하드비스킷, 팥소빵 등의 가공 마무리시에 유지를 분무 또는 도포한 식품 등을 들 수 있다. 그러나, 유지를 포함하는 식품에 한정되는 것은 아니고, 예컨대, 빵, 면류, 밥, 과자류(캔디, 츄잉검, 구미, 정과, 화과자), 두부 및 그 가공품 등의 농산 식품, 청주, 약용주, 미림, 식초, 간장, 된장 등의 발효 식품, 요구르트, 햄, 베이컨, 소시지 등의 축산 식품, 가마보코, 아게텐, 한펜 등의 수산 식품, 과즙 음료, 청량 음료, 스포츠 음료, 알콜 음료, 차 등이어도 좋다.

본 발명의 식품은 또한, 캡슐 등의 의약 제제의 형태, 또는 단백질, 당류, 지방, 미량 원소, 비타민류, 유화제, 향료 등에 본 발명의 유지가 배합된 자연 유동식, 반소화태 영양식, 및 성분 영양식, 드링크제, 경장 영양제 등의 가공 형태이어도 좋다.

이상에 기재한 바와 같이, 본 발명의 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성 유전자를 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써, 효율적으로 지질, 특히, 트리아실글리세롤을 생성시키는 것이 가능하다.

또한, 상기 유전자의 발현량을 지표로 하여, 지질, 특히, 트리아실글리세롤 생산을 효율적으로 행하기 위한 배양 조건의 검토, 배양 관리 등에도 이용할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.

모르티에렐라 알피나의 게놈 해석

M. 알피나 1S-4주를 100 ml의 GY 2:1 배지(2% 글루코오스, 1% 효모 엑기스 pH 6.0)에 식균하여, 28℃에서 2일간 진탕 배양했다. 여과에 의해 균체를 집균하고, DNeasy(QIAGEN)를 이용하여 게놈 DNA를 조제했다. 상기 게놈 DNA의 염기 서열을, Roche 454 GS FLX Standard를 이용하여 결정했다. 그 때, 프래그먼트 라이브러리의 염기 서열 결정을 2런분, 메이트페어 라이브러리의 염기 서열 결정을 3런분 행했다. 얻어진 염기 서열을 어셈블리함으로써, 300개의 슈퍼 콘틱(Super Contig)가 얻어졌다.

cDNA 의 합성 및 cDNA 라이브러리의 제작

M. 알피나 1S-4주를 100 ml의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0)에 식균하여, 3일간 28℃에서 전배양했다. 10 L 배양조(Able Co., 도쿄)에 5 L의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데카놀, 0.3% KH₂PO₄, 0.1% Na₂SO₄, 0.05% CaCl₂ㆍ2H₂O, 0.05% MgCl₂ㆍ6H₂O, pH 6.0)를 넣고, 전배양물을 전량 식균하여, 300 rpm, 1 vvm, 26℃의 조건으로 8일간 통기 교반 배양했다. 배양 1, 2 및 3일째에 각각 2%, 2% 및 1.5% 상당의 글루코오스를 첨가했다. 배양 1, 2, 3, 6 및 8일째의 각 스테이지에 균체를 회수하여, 염산구아니딘/CsCl법으로 total RNA를 조제했다. Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(Takara Bio Inc.)를 이용하여, total RNA로부터 poly(A)⁺RNA의 정제를 행했다. 각 스테이지의 cDNA 라이브러리를, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)를 이용하여 제작했다.

효모 유래 AYR1 의 호모로그의 탐색

효모의 1-아실디히드록시아세톤포스페이트 리덕타아제 활성 및 β-케토아실 리덕타아제 활성을 담당하는 유전자인 ScAYR1(YIL124W)의 호모로그를 게놈 데이터베이스로부터 검토했다. 그 결과, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 슈퍼 콘틱이 히트했다. 서열 번호 4에 관한 유전자를 MaADR1로 명명했다.

MaADR1 의 cDNA 의 클론화

MaADR1 유전자의 cDNA를 클론화하기 위해, 개시 코돈이나 종지 코돈의 존재, 호모로그와의 서열 비교에서, 서열 번호 4의 1-3번째 ATG가 개시 코돈, 1587-1589번째가 종지 코돈으로 추정되었다. 따라서, 이하의 프라이머를 합성했다.

Bam-ADR-F : 5'-GGATCCATGGCCTCGTCTAAAAAGATCGTCCT-3'(서열 번호 5)

Sal-ADR-R : 5'-GTCGACTACTTTCCAACGACCTTGCCATCC3'(서열 번호 6)

M. 알피나 1S-4주의 cDNA를 주형으로 하여, 프라이머 Bam-ADR-F와 Sal-ADR-R, KOD-Plus(TOYOBO)에 의해 PCR 증폭을 행한 바, 약 0.87 kb의 DNA 단편이 증폭되었다. 이것을 Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 클론화하고, 얻어진 플러스미드를 pCR-MaADR1로 했다. 이 플러스미드의 인서트의 서열, 즉, MaADR1 유전자의 CDS 서열을 서열 번호 3에 나타낸다. 또한, MaADR1 유전자의 ORF 서열을 서열 번호 1에 나타낸다.

서열 해석

MaADR1 유전자의 게놈 서열(서열 번호 4)과 CDS 서열(서열 번호 3)을 비교한 바, 본 유전자의 게놈 서열은, 엑손 5개, 인트론 4개로 이루어지고(도 1), 242개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질을 코드하고 있다고 추정된다(도 2).

MaADR1의 추정 아미노산 서열(서열 번호 2)을 GENEBANK nr에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 BLASTp로 상동성 해석을 행했다. 그 결과, 이 서열에 대하여 가장 E-value가 낮은 아미노산 서열, 즉 동일성이 높은 아미노산 서열은, Volvox carterif. nagariensis(녹조류) 유래의 추정 단백질(GENEBANK accession No.XP_002946364)이고, 아미노산 서열의 동일성은 34.7%였다. 또, MaADR1의 추정 아미노산 서열은, 효모 S. cerevisiae 유래의 AYR1p의 아미노산 서열과는 25.6%, IFA38의 아미노산 서열과는 13.6%의 동일성을 나타냈다.

MaADR1, Volvox carterif. nagariensis(녹조류) 유래의 추정 단백질(GENEBANK accession No. XP_002946364) 및 S. cerevisiae 유래의 AYR1p의 각 아미노산 서열의 비교를 도 3에 나타낸다.

MaADR1 의 기능 해석

효모용 발현 벡터의 구축

효모 발현용 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)을 제한 효소 BamHI와 SalI로 소화한 DNA 단편과, 플러스미드 pCR-MaADR1을 제한 효소 BamHI와 SalI로 소화하여 얻어진 약 0.87 Kbp의 DNA 단편을 ligation high(TOYOBO)로 연결하여, 플러스미드 pYE-MaADR1을 구축했다.

형질전환 효모의 취득

플러스미드 pYE22m, pYE-MaADR1을 각각 이용하여 아세트산리튬법에 의해, 효모 S. cerevisiae EH13-15주(trp1, MATα)(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)를 형질전환했다. 형질전환주는, SC-Trp(1 l당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 류신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 우라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로 하여 선발했다.

효모의 배양

플러스미드 pYE22m을 이용하여 형질전환하여 얻어진 임의의 4주와, 플러스미드 pYE-MaADR1을 이용하여 형질전환하여 얻어진 임의의 4주를, 이하의 배양 실험에 제공했다. 전배양으로서, SC-Trp 배지 10 ml에 효모를 플레이트로부터 1 백김이 식균하여, 30℃에서 1일간 진탕 배양을 행했다. 본 배양은, SC-Trp 배지 10 ml에 전배양액을 100 μl 첨가하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행했다.

균체의 지방산 분석

효모의 배양액을 원심 분리함으로써, 균체를 회수했다. 10 ml의 멸균수로 세정하고, 원심 분리에 의해 다시 균체를 회수하여 동결 건조시켰다. 동결 건조 균체에, 1 ml의 클로로포름:메탄올(2:1)과 유리 비드를 첨가하여, 비드비터로 균체를 파쇄한 후, 원심 분리하여 상청을 회수했다. 남은 균체에 1 ml의 클로로포름:메탄올(2:1)을 더 첨가하고, 동일하게 하여, 상청을 회수하는 것을 반복하여, 총량 4 ml의 클로로포름:메탄올(2:1)로 지질을 회수했다. 스피드백을 사용하여 용매를 증류 제거했다. 시료를 1 ml의 클로로포름에 용해했다.

이 시료 중, 200 μl을 취하여, 염산메탄올법에 의해 지방산을 메틸에스테르로 유도하고, 가스 크로마토그래피에 의해 지방산 분석을 행하여, 균체 내의 총지방산의 조성을 구했다.

결과를 이하의 표 1에 나타낸다. MaADR1 유전자를 고발현한 주에서는 컨트롤주에 비해, 총지방산에 차지하는 C18의 지방산의 비율이 상승하고, C16의 지방산의 비율이 저하되었다. 즉, 지방산의 쇄 길이 연장 반응이 활성화되었다.

상기 시료 중 400 μl를 취하여 용매를 증류 제거한 후, 소량의 클로로포름에 용해하여, 박층 크로마토그래피에 제공했다. 즉, 실리카겔 60 플레이트(메르크), 전개 용매 헥산:디에틸에테르:아세트산=70:30:1의 조건으로 박층 크로마토그래피를 행하여 지질을 분획했다. 프리물린 용액을 분무하고, 자외선을 조사함으로써 지질을 검출했다. 트리아실글리세롤(TG) 획분과 인지질(PL) 획분을 각각 긁어서 시험관에 모으고, 염산메탄올법에 의해 지방산을 메틸에스테르로 유도하여, 가스 크로마토그래피에 의해 지방산 분석을 행했다.

트리아실글리세롤 획분의 지방산 조성과, 인지질 획분의 지방산 조성을 표 2 및 3에 나타낸다.

트리아실글리세롤 획분의 지방산 조성을 보면, MaADR1을 고발현한 주에서는 컨트롤에 비해, C18의 지방산의 비율이 상승하고, C16의 지방산의 비율이 저하되었다. 한편, 인지질 획분의 지방산 조성을 보면, MaADR1을 고발현한 주와 컨트롤주의 지방산 조성비는 거의 동일했다.

즉, MaADR1을 효모로 고발현시킨 경우, 트리아실글리세롤을 구성하는 지방산의 조성이 보다 장쇄의 지방산의 비율이 높아지도록 변화하였다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 적절한 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써, 탄소수 18 이상의 장쇄 지방산 및 이것을 포함하는 트리아실글리세롤을 효율적으로 생성시킬 수 있다. 본 발명에 의해 숙주 세포 내에서 생성되는 지방산은, 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 제조에 이용할 수 있다.

[서열표 프리텍스트]

서열 번호 5 : 합성 DNA

서열 번호 6 : 합성 DNA

SEQUENCE LISTING <110> SUNTORY HOLDINGS LIMITED <120> Protein Having Inductive Activity of Fatty Acid Chain Elongation, Gene Encoding Thereof and Use Thereof <130> PCT12-0028 <150> JP 2011-171044 <151> 2011-08-04 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 726 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 1 atggcctcgt ctaaaaagat cgtcctcgtc accggctgta ccactggagg cattggttat 60 gaaaccgcaa aggcattcga aaagagtggc tgcaaagtgt atgccgcagc aagacgtctc 120 gaagccataa cgggcattga aggtctagat atcgaaaagg tctacatcga cgtactggac 180 gagaagtcca tcaaagacgc cgtcaacatt gagacaaccc gcaagctgct cgacaccaac 240 atcacctccg tcattctcgt gtccaaagag gtggcgcctc atatgattag acaaaagtct 300 ggtctgattg tcaatgttgg ctcagtcaca gcctatctcg cgacaccttg gggcggtctc 360 tatgctgcca gcaaggccgc agtgcactcc atctcggacg cactgcgcat ggagttggct 420 ccctttggtg ttgatgtttc ggtcgtggcg cctggtgcaa tcaagtccaa catcggtgac 480 aacaacttga aggccttcca tcttcccgag acccctggat gcacacccac tgccaagttt 540 gcaaagtacg tcgtggcaaa gtgcctcaag tcatcccccc ctcgatacat cgattacggc 600 acgctgtcaa acctcttccg attcttgcgc tacgcgccct ggatgatcac ggacttcatc 660 ttctcccgca aatttggtct gaatgttctc cagaagtcgg taaaggatgg caaggtcgtt 720 ggaaag 726 <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 2 Met Ala Ser Ser Lys Lys Ile Val Leu Val Thr Gly Cys Thr Thr Gly 1 5 10 15 Gly Ile Gly Tyr Glu Thr Ala Lys Ala Phe Glu Lys Ser Gly Cys Lys 20 25 30 Val Tyr Ala Ala Ala Arg Arg Leu Glu Ala Ile Thr Gly Ile Glu Gly 35 40 45 Leu Asp Ile Glu Lys Val Tyr Ile Asp Val Leu Asp Glu Lys Ser Ile 50 55 60 Lys Asp Ala Val Asn Ile Glu Thr Thr Arg Lys Leu Leu Asp Thr Asn 65 70 75 80 Ile Thr Ser Val Ile Leu Val Ser Lys Glu Val Ala Pro His Met Ile 85 90 95 Arg Gln Lys Ser Gly Leu Ile Val Asn Val Gly Ser Val Thr Ala Tyr 100 105 110 Leu Ala Thr Pro Trp Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Ser Lys Ala Ala Val 115 120 125 His Ser Ile Ser Asp Ala Leu Arg Met Glu Leu Ala Pro Phe Gly Val 130 135 140 Asp Val Ser Val Val Ala Pro Gly Ala Ile Lys Ser Asn Ile Gly Asp 145 150 155 160 Asn Asn Leu Lys Ala Phe His Leu Pro Glu Thr Pro Gly Cys Thr Pro 165 170 175 Thr Ala Lys Phe Ala Lys Tyr Val Val Ala Lys Cys Leu Lys Ser Ser 180 185 190 Pro Pro Arg Tyr Ile Asp Tyr Gly Thr Leu Ser Asn Leu Phe Arg Phe 195 200 205 Leu Arg Tyr Ala Pro Trp Met Ile Thr Asp Phe Ile Phe Ser Arg Lys 210 215 220 Phe Gly Leu Asn Val Leu Gln Lys Ser Val Lys Asp Gly Lys Val Val 225 230 235 240 Gly Lys <210> 3 <211> 729 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 3 atggcctcgt ctaaaaagat cgtcctcgtc accggctgta ccactggagg cattggttat 60 gaaaccgcaa aggcattcga aaagagtggc tgcaaagtgt atgccgcagc aagacgtctc 120 gaagccataa cgggcattga aggtctagat atcgaaaagg tctacatcga cgtactggac 180 gagaagtcca tcaaagacgc cgtcaacatt gagacaaccc gcaagctgct cgacaccaac 240 atcacctccg tcattctcgt gtccaaagag gtggcgcctc atatgattag acaaaagtct 300 ggtctgattg tcaatgttgg ctcagtcaca gcctatctcg cgacaccttg gggcggtctc 360 tatgctgcca gcaaggccgc agtgcactcc atctcggacg cactgcgcat ggagttggct 420 ccctttggtg ttgatgtttc ggtcgtggcg cctggtgcaa tcaagtccaa catcggtgac 480 aacaacttga aggccttcca tcttcccgag acccctggat gcacacccac tgccaagttt 540 gcaaagtacg tcgtggcaaa gtgcctcaag tcatcccccc ctcgatacat cgattacggc 600 acgctgtcaa acctcttccg attcttgcgc tacgcgccct ggatgatcac ggacttcatc 660 ttctcccgca aatttggtct gaatgttctc cagaagtcgg taaaggatgg caaggtcgtt 720 ggaaagtag 729 <210> 4 <211> 1589 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 4 atggcctcgt ctaaaaagat cgtcctcgtc accggctgta ccactggagg cattggttat 60 gaaaccgcaa aggcattcga aaaggtacgc cctcggcagt ctcacttcat ggaaggcccc 120 tctgagaatt accaatcaac caatttgcag ttacagctgg attcattgac taatcgtgca 180 tacctttctt atactaaatg cctattcaga gtggctgcaa agtgtatgcc gcagcaagac 240 gtctcgaagc cataacgggc attgaaggtg agggttgtat tttgccacaa gtcttcgtgg 300 gtcgtgtgcg ggatgcaggc attaacactc cttaaattgc gtgcaggtct agatatcgaa 360 aaggtctaca tcgacgtact ggacgagaag tccatcaaag acgccgtcaa cgtaagatgc 420 ctgctgtcaa ctgtcctact tctacttgca taagttttca attctgatct ctcaggtcct 480 taaacttgca ttgtagcacg ttatcgagaa ggaaggacga atcggtaaga gaagaaacgc 540 gtgttttcag ttcaacggac gattgctcaa catgcaagaa gaccaagcat tgatggctgc 600 cttatattct tcatacagat attctgttca acaatgccgg aatgggactc gcatgcccac 660 tgatcgacat gtctgtaagt aacacagggt ggacatatga acactgaaag gcaaacccca 720 ccttagcaga cggcaagcac taacacttca gccttcattt aatatgtata gattgagaca 780 acccgcaagc tgctcgacac caacatcacc tccgtcattc tcgtgtccaa agaggtggcg 840 cctcatatga ttagacaaaa gtctggtctg attgtcaatg ttggctcagt cacagcctat 900 ctcgcgacac cttggggcgg tctctatgct gccagcaagg ccgcagtgca ctccatctcg 960 gacgcactgc gcatggagtt ggctcccttt ggtgttgatg tttcggtcgt ggcgcctggt 1020 gcaatcaagt ccaacatcgg tgacaacaac ttgaaggcct tccatcttcc cgagagtaag 1080 ttcaaccagc aattccgtcc gcttgaagct gcaatcatat tcccttcagc caaattcctc 1140 atatgctcat actgccttgt tatttttttt ttttccttct ttgttgaaat ctcaagattc 1200 cttctatcag tctgtcatca gctatatcat gtccagagca aatgcttccc aaggtaagac 1260 gcgtcgattt cactgacgat ctgccaacaa tggaaaaaaa accgttgcgt cttgatgcta 1320 ctgacttgtg tctctgacac tcactgtgcc cccatcttgt ttatccatca gcccctggat 1380 gcacacccac tgccaagttt gcaaagtacg tcgtggcaaa gtgcctcaag tcatcccccc 1440 ctcgatacat cgattacggc acgctgtcaa acctcttccg attcttgcgc tacgcgccct 1500 ggatgatcac ggacttcatc ttctcccgca aatttggtct gaatgttctc cagaagtcgg 1560 taaaggatgg caaggtcgtt ggaaagtag 1589 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 ggatccatgg cctcgtctaa aaagatcgtc ct 32 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 gtcgactact ttccaacgac cttgccatcc 30

Claims

이하의 (a)∼(e)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드:
(a) 서열 번호 1 또는 4의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 1∼100개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대하여, 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및
(e) 서열 번호 1 또는 4의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 이하의 (f) 또는 (g)의 어느 하나인 폴리뉴클레오티드:
(f) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및
(g) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대하여, 75% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 지방산 쇄 길이 연장 촉진 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열 번호 1 또는 4의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 비인간 형질전환체.
제7항에 기재된 벡터가 도입된 비인간 형질전환체.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 형질전환체가 지질 생산균인 형질전환체.
제10항에 있어서, 상기 지질 생산균이 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)인 형질전환체.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체의 배양물로부터, 지질 또는 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 지질 또는 지방산 조성물의 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 지질이 트리아실글리세롤인 방법.
제12항에 있어서, 상기 지방산이 탄소수 18 이상의 것인 방법.
제12항에 기재된 제조 방법에 의해 채취된 지질 또는 지방산 조성물을 함유하는 식품, 의약품, 화장품 또는 비누.