JP6778207B2 - Aobgl3ホモログを用いたステビオール配糖体およびステビオールの製造方法 - Google Patents
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Description
一方、ステビオールについては、認知機能の改善効果などが知られている。
以上のように、麹菌を含むアスペルギルス属糸状菌はステビオール配糖体加水分解活性を有する酵素遺伝子を有していることが示唆されてはいたものの、酵素活性を担う遺伝子や酵素についての報告はない。
それ以外の生物でも、ステビオール配糖体を加水分解する活性を有することが報告されている。例えば、クラビバクター属細菌が、ルブソシドの19位グルコシルエステル結合を分解するが13位グルコシド結合は分解しない酵素を有することが開示されている(特許文献2)。また、Flavobacterium johnsoniae由来のβ-グルコシダーゼに、ステビオール配糖体を分解する活性(13位β-グルコシド結合と19位グルコシルエステル結合を加水分解する活性)があることが報告されている。
しかしながら、これらはいずれもステビオール配糖体を加水分解する活性を見出してはいるもののその活性を担う遺伝子については特定されていない。
さらに、麹菌には、β-グルコシダーゼ様活性を有するGH3ファミリー酵素やGH5ファミリー酵素をコードすると考えられる遺伝子が多数存在しており、酵素活性が検出できても、どの遺伝子がその活性を担っているかを特定するのは容易ではない。
[1]
以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体を反応させて、前記モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する工程を含む、ステビオール配糖体および/またはステビオールの調製方法。
(a)配列番号3または4のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質
[2]
前記少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体が、レバウジオシドA、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルから選択される、前記[1]に記載の方法。
[3]
前記モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合のないステビオール配糖体が、ルブソシドである、前記[2]に記載の方法。
[4]
少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体を生成する宿主に、以下の(a)〜(e)からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合のないステビオール配糖体および/またはステビオールの生産方法。
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[5]
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記[4]に記載の方法。
[6]
前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母または形質転換植物である、前記[4]または[5]に記載の方法。
[7]
宿主細胞に、以下の(a)〜(e)からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体と接触させて、前記モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する工程を含む、モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合のないステビオール配糖体および/またはステビオールの調製方法。
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
[8]
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記[7]に記載の方法。
[9]
前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換細菌または形質転換酵母である、前記[7]または[8]に記載の方法。
[10]
前記少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体が、レバウジオシドA、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルから選択される、前記[7]〜[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11]
前記モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合のないステビオール配糖体が、レバウジオシドBおよびステビオールビオシドから選択される、前記[10]に記載の方法。
[12]
以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるタンパク質と、(d)〜(f)からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体を反応させる工程を含む、ステビオール配糖体および/またはステビオールを製造する方法。
(a)配列番号3または4のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質
(d)配列番号7または8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(e)配列番号7または8のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ1,2グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質;
(f)配列番号7または8のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ1,2グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質
[13]
少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体が、レバウジオシドA、レバウジオシドD、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルから選択される1つ以上のステビオール配糖体である、前記[12]に記載の方法。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2015年10 月30日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2015−214256号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
「AOBGL1」は、麹菌由来のβ−グルコシダーゼであり、そのcDNA配列、ゲノムDNA配列、アミノ酸配列、および成熟タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8に示される。
本発明は、以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるタンパク質(以下、「本発明のタンパク質」という)と、少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体を反応させて、前記モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する工程を含む、モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合のないステビオールまたはステビオール配糖体の調製方法を提供する。
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質
あるいは、p-ニトロフェニルβ-D-グルコピラノシドを基質として用いて、加水分解により生じるp-ニトロフェノール量を吸光度(A405)で測定することによりβ-グルコシド結合を加水分解する活性を測定することができる。
また、β-グルコシド結合を加水分解する活性は、本発明のタンパク質を発現するよう遺伝子組み換えした形質転換体をX−β−Glcを含む培地で培養し、菌体およびその周りが青く染まるかどうかを確認することにより検出することができる。
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸;
C群:アスパラギン、グルタミン;
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸;
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン;
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン;
G群:フェニルアラニン、チロシン。
本発明のいくつかの態様では、ルブソシドのモノグルコシド結合およびモノグルコシルエステル結合が切断され、ステビオールが得られる。
モノグルコシド結合またはグルコシルエステル結合のない本発明のステビオール配糖体は、適切な溶媒(水等の水性溶媒、またはアルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒)による抽出、酢酸エチルその他の有機溶媒:水の勾配、高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析(Time−of−Flight mass spectrometry:TOF−MS)、超高性能液体クロマトグラフィー(Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC)等の公知の方法によって精製することができる。
そこで、別の実施形態において、本発明のタンパク質と、以下の(d)〜(f)からなる群から選択されるタンパク質(以下、「第2の活性タンパク質」という)と、少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体とを反応させる工程を含む、レバウジオシドBおよびステビオールの少なくとも1つを製造する方法が提供される。
(d)配列番号7または8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(e)配列番号7または8のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ1,2グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質;
(f)配列番号7または8のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ1,2グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質
あるいは、p-ニトロフェニルβ-D-グルコピラノシドを基質として用いて、加水分解により生じるp-ニトロフェノール量を吸光度(A405)で測定することによりβ-グルコシド結合を加水分解する活性を測定することができる。
相互に置換可能なアミノ酸残基の例は既に述べたとおりである。
本発明のタンパク質は、麹菌に由来する分泌型の酵素またはその変異体であり、細胞外環境において高い活性を有することが期待される。この場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド(後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照)を、細菌、真菌類、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を細胞外に発現させ、本発明のタンパク質と、モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体とを反応させることにより本発明のステビオール配糖体を生成することができる。あるいは、宿主によっては、本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させ、本発明のステビオール配糖体および/またはステビオールを生成することもできる。
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃、または0.2xSSC、0.1%SDS、60℃、または0.2xSSC、0.1%SDS、62℃、または0.2xSSC、0.1%SDS、65℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
(i)宿主細胞内で転写可能なプロモーター;
(ii)該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド;および
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
本発明のポリヌクレオチドを、細菌、真菌類、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、本発明のタンパク質を発現する形質転換細胞に由来する酵素剤を用いること、すなわち、本発明のタンパク質を発現する形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体と接触させることにより本発明のステビオール配糖体を生成することができる。「形質転換細胞に由来する酵素剤」は、形質転換細胞を用いて調製され、本発明のタンパク質を含むものであれば限定されないが、例えば、形質転換細胞自体、形質転換細胞の粉砕物自体、形質転換細胞の培養上清自体、およびこれらの精製物である。
そこで、本発明は、宿主細胞に、以下の(a)〜(e)からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも1つのモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体と接触させて、前記モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する工程を含む、モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合のないステビオール配糖体および/またはステビオールの調製方法を提供する。
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
1-(1)遺伝子
AO090009000356およびAO090701000274をクローニングし、酵母で発現させて活性を確認することにした。
麹菌 Aspergillus oryzae var.Brunneus(IFO30102)をGYプレート(2%グルコース、0.5%酵母エキス、2% アガー)に植菌し、25℃で3日間培養した。生育した菌体をGYプレートから回収し、RNeasy(QIAGEN)でトータルRNAを抽出した。SuperScript Double−Stranded cDNA Synthesis Kit(ライフテクノロジーズ)により、cDNAを合成した。
AO090009000356およびAO090701000274のDNA配列をもとに、以下のプライマーを設計した。
AO090009000356(以下AOBGL1と表記)
AOBGL1-1:5’−AGATCTATGAAGCTTGGTTGGATCGAGGT−3’(配列番号9)
AOBGL1-2:5’−GTCGACTTACTGGGCCTTAGGCAGCGA−3’(配列番号10)
AO090701000274(以下AOBGL3と表記)
AOBGL3-1:5’-GCGGCCGCatggtttccggtgtctttacgaagg−3’(配列番号11)
AOBGL3-2:5’ -GGATCCtcactgcacatagaaagtagcattgcc−3’(配列番号12)
上述のとおり合成したcDNAを鋳型として、ExTaq(タカラバイオ)を用いて、
PCRにより増幅された約2.6kbpまたは2.3kbpのDNA断片をTOPO−TA cloning Kit(ライフテクノロジーズ)を用いてクローニングした。ここで得られたプラスミドをそれぞれ、pCR-AOBGL1、またはpCR-AOBGL3とした。
2-(1)酵母発現用ベクターの構築と形質転換株の取得
酵母用発現ベクターpYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221−1228,1995)を制限酵素BamHIとSalIで消化して得られたDNA断片と、pCR−AOBGL1を制限酵素BglIIとSalIで消化して得られた約2.6kbpのDNA断片を、DNA Ligation Kit Ver.1(タカラバイオ)を用いて、連結し、得られたプラスミドをpYE−AOBGL1とした。また、pYE22mNを制限酵素NotIとBamHIで消化して得られたDNA断片とpCR−AOBGL3を制限酵素NotIとBamHIで消化して得られた約2.3kbpのDNA断片を同様に連結して得られたプラスミドをpYE−AOBGL3とした。
形質転換の親株として、S.cerevisiaeのEH13−15株(trp1,MATα)(Appl.Microbiol.Biotechnol.,30,515−520,1989)を用いた。
選抜した株を、0.004% X−β−Glcを含むSC−Trp寒天培地に塗布し、30℃で3日間培養したが、pYE−AOBGL1、pYE−AOBGL3いずれのプラスミドで形質転換した株も、コントロールであるpYE22mで形質転換した株もどちらも青色を呈さず、X−β−Glc分解活性を確認できなかった。
一方、選抜した株を、1Mリン酸カリウムバッファーを1/10量添加したSC−Trp液体培地10mLに1白金耳植菌し、30℃、125rpmで2日間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離により、培養上清と菌体に分けた。菌体は、50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)、0.1%CHAPS溶液に懸濁して、ガラスビーズにて菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を菌体破砕液とした。得られた培養上清または菌体破砕液のpNP−β−Glc活性を検討した。
その結果、コントロールを含めて、いずれの形質転換株の培養上清および菌体破砕液の両方に、pNP−β−Glc分解活性があり、両者の間で、活性に大きな差はなかった。
これらのことから、プラスミドpYE−AOBGL1、pYE−AOBGL3を酵母EH13−15株に導入しても、β−グルコシダーゼ活性を有する活性型のタンパク質を発現させることができないことが示唆された。また、酵母の内在性のβ−グルコシダーゼ活性を担う遺伝子を欠失させておく必要があることも分かった。
形質転換の宿主株としては、酵母の菌体外β−グルコシダーゼ活性の大半を担っていると考えられているEXG1(YLR300w)遺伝子とそのホモログであるEXG2(YDR261c)遺伝子を欠損させた株を使用することとし、以下のとおり作成した。
Δexg1株(MATalpha his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0,クローンID15210、Open Bio Systems)と。Δexg2株(MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0,クローンID3620、Open Bio Systems)をそれぞれYPD寒天培地に塗布し、30℃で2日間培養した。それぞれの菌体を白金耳でかきとり、SC-Met,Lys1Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO)6.7g、グルコース20g、およびアミノ酸パウダー(アデニン硫酸塩1.25g、アルギニン0.6g、アスパラギン酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0.6g、ロイシン1.8g、フェニルアラニン1.5g、セリン11.25g、チロシン0.9g、バリン4.5g、スレオニン6g、トリプトファン1.2g、ウラシル0.6gを混合したもの)1.3gを含む)寒天培地(2%アガー)上で混合し、30℃で2日間培養した。生育してくる株は、2つの株が掛け合わされたヘテロ二倍体であると考えられた。得られた株をYPD寒天培地に塗布し、30℃で2日間培養した後、菌体を白金耳でかきとって、0.5% 酢酸カリウム寒天培地(2%アガー)に塗布し、室温で5日間培養し、胞子を形成させた。四分子分離を行い、一倍体株を分離した。得られた株の遺伝子型をPCRにより確認し、Δexg1 Δexg2-1株(his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)であるものを選抜した。
酵母S288C株のゲノムDNAを鋳型として、以下のプライマーTRP1-FとプライマーTRP1-Rで、KOD−Plus(東洋紡)を用いてPCRを行った。増幅された約2.7kbpのDNA断片をZero Blunt TOPO PCR cloning Kit(ライフテクノロジーズ)を用いてクローニングし、プラスミドpCR-TRP1を得た。
TRP1-F:TACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCG(配列番号13)
TRP1-R:TCTACAACCGCTAAATGTTTTTGTTCG(配列番号14)
AOBGL1pのN末端の19アミノ酸(配列番号28)、およびAOBGL3のN末端の22アミノ酸(配列番号30)は分泌シグナル配列であると推定される。
そこで、AOBGL1、AOBGL3を酵母で分泌発現させるために、推定分泌シグナル配列を酵母の分泌タンパク質の分泌シグナル配列に置換することにした。まず、以下のオリゴDNAを合成し、アニーリングさせたのち、ベクターpYE22mのEcoRIサイトに挿入し、pYE−PacNheを作成した。
PacI−NheI−F:5’−AATTAATTAAGAGCTAGCG−3’ (配列番号15)
PacI−NheI−R:5’−TTAATTCTCGATCGCTTAA−3’ (配列番号16)
プラスミドpCR−AOBGL1またはpCR−ASBGL1を鋳型にして、以下のプライマーBgl2−AOBGL1−FとプライマーAOBGL1−2で、KOD−Plus(東洋紡)を用いてPCRを行った。PCRにより増幅したDNA断片を制限酵素BglIIとSalIで消化して得られた約2.5kbpのDNA断片を、ベクターpYE−PacNheの制限酵素BamHIとSalIサイトに挿入し、プラスミドpYE−PN−AOBGL1を構築した。
Bgl2−AOBGL1−F:
5’−TAAGATCTAAGGATGATCTCGCGTACTCCCC−3’ (配列番号17)
AOBGL1−2:
5’−GTCGACTTACTGGGCCTTAGGCAGCGA−3’ (配列番号18)
Bam-AOBGL3-F:
5’−AAGGATCCCAAGATGAGAAGCCTCGCTACAAGG−3’ (配列番号19)
Sal-AOBGL3-R:
5’−GGGTCGACTCACTGCACATAGAAAGTAGCATTGCC−3’ (配列番号20)
ScPHO5−F:
5’−TAAATGTTTAAATCTGTTGTTTATTCAATTTTAGCCGCTTCTTTGGCCAATGCAG−3’ (配列番号21)
ScPHO5−R:
5’−CTAGCTGCATTGGCCAAAGAAGCGGCTAAAATTGAATAAACAACAGATTTAAACATTTAAT−3’ (配列番号22)
ScSUC2−F:
5’−TAAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCAG−3’ (配列番号23)
ScSUC2−R:
5’−TAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG−3’ (配列番号24)
ScMF1−F:
5’−TAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG−3’ (配列番号25)
ScMF1−R:
5’−CTAGCAGCTAATGCGGAGGATGCTGCGAATAAAACTGCAGTAAAAATTGAAGGAAATCTCATTTAAT−3’ (配列番号26)
pYE−PHO5s−AOBGL1(PHO5s−AOBGL1発現用)
pYE−SUC2s−AOBGL1(SUC2s−AOBGL1発現用)
pYE−MF1s−AOBGL1(MF1s−AOBGL1発現用)
pYE−PHO5s−AOBGL3(PHO5s−AOBGL3発現用)
pYE−SUC2s−AOBGL3(SUC2s−AOBGL3発現用)
pYE−MF1s−AOBGL3(MF1s−AOBGL3発現用)
一方、AOBGL3を発現させるためのプラスミドで形質転換した株は、菌体およびその周辺は青く染まらず、X−β−Glcを加水分解する活性を確認することはできなかった。
また、コントロールベクターを導入した株でも、菌体およびその周辺は青く染まらず、X−β−Glcを加水分解する活性はなかった。
培養上清50μL、0.2Mクエン酸ナトリウムバッファー50μL、20mMpNP−βGlc水溶液50μL、水50μLを混合し、37℃で1時間反応させ、β-グルコシダーゼ活性による405nmの吸光度の増加を調べた。
AOBGL1を発現させた場合は、表5のとおり、β-グルコシダーゼ活性を確認できた。AOBGL1は、MF1シグナル配列に付替えた場合に最もよく発現すると考えられた。
AOBGL1が、ステビオシドをルブソシドに変換する活性を有することが確認できた。
3-(1) 麹菌発現用ベクターの構築
麹菌用ベクターpUNA(酒類総合研究所)を制限酵素SmaIで消化して得られたDNA断片と、プラスミドpCR-AOBGL3を制限酵素NotI、BamHIで消化し末端をBlunting Kit(タカラバイオ)によって平滑化して得られた約2.3kbpのDNA断片を連結し、プラスミドpUNA-AOBGL3を得た。
麹菌の形質転換は以下のとおり実施した。
宿主として、Aspergillus oryzae niaD300株(酒類総合研究所)を使用した。宿主株をPDAプレートに植菌し、30℃でおよそ1週間培養した。分生子懸濁液を得るために、0.1% tween80, 0.8% NaClを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、0.1% tween80, 0.8% NaClで洗浄し、滅菌水に懸濁した。
分生子をCDプレートに塗布し、パーティクルデリバリー法により、DNAの導入を行った。PDS-1000/He(バイオラッド)を使って、パーティクル:タングステンM-10、ラプチャーディスク:1100psi、距離:3cmとした。形質転換株として、CDプレート(1Lあたり、NaNO3 6g、KCl 0.52g、KH2PO4 1.52g、グルコース 10g、1M MgSO4 2ml、Trace element solution(1Lあたり、FeSO4・7H2O 1g、ZnSO4・7H2O 8.8g、CuSO4・5H2O 0.4g、NaB4O7・10H2O 0.1g、(NH4)6Mo7O24・4H2O 0.05g ) 1ml、アガー 20g(pH6.5))で生育するものを選抜した。
BGL3-1株またはC-1株をCDプレートに植菌し、30℃で7日間培養し、分生子を形成させた。分生子懸濁液を得るために、0.1% tween80, 0.8% NaClを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、0.1% tween80, 0.8% NaClで洗浄し、滅菌水に懸濁し、分生子懸濁液とした。
BGL3-1株またはC-1株の分生子を、酵素生産用液体培地(1Lあたり、マルトース 100g、バクトトリプトン 1g、酵母エキス 5g、NaNO31g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、FeSO4・7H2O 0.01g) に植菌し、30℃で2日間振とう培養を行った。ミラクロスによりろ過して菌体を除き、続いてメンブレンフィルターシステム(IWAKI)によりろ過し上清を集めた。さらに、アミコンウルトラ-15 50k(メルク)で、限外ろ過により濃縮し、0.1% CHAPSを含む50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)でバッファー置換することにより、祖酵素液を得た。
各種基質に対する活性を検討した。
pNP-β‐Glc:BGL3-1株、C-1株ともに黄色を呈し、両者ともにpNP-β‐Glcを加水分解する活性を有していた。
X-β-Glc:BGL3-1株は青色を呈し、X-β-Glcを加水分解する活性を有していた。一方、C-1株は青くならなかったため、X-β-Glcを加水分解する活性はないと考えられた。X-β-Glcに対する活性は、AOBGL3遺伝子産物によるものと考えられた。
BGL3-1株またはC-1株由来の酵素液(液体培養、プレート培養)の各種ステビオール配糖体(ルブソシド)に対する加水分解活性を以下のとおり検討した。
基質 50μg/ml、酵素液 20μl、 50mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH5.0)、全量を100μlとし、50℃で反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したSep-PakC18(Waters)に供し、続いて20%アセトニトリルで洗浄したあと、50%アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、100μLの80%アセトニトリルで再溶解し、HPLCに供した。
HPLC条件は以下のとおりである。
移動相:A;アセトニトリル、B;
B conc.70%→30% 40分 linear gradient
流速:1ml/分
温度:40℃
検出:UV 210nm
Claims (13)
- 以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも1つの13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体を反応させて、前記モノグルコシド結合および/またはモノグルコシルエステル結合を切断する工程を含む、13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合のないステビオール配糖体および/またはステビオールの調製方法。
(a)配列番号3または4のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質。 - 前記少なくとも1つの13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体が、レバウジオシドA、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合のないステビオール配糖体が、レバウジオシドBおよびステビオールビオシドから選択される、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも1つの13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体を生成する宿主に、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合のないステビオール配糖体および/またはステビオールの生産方法。
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項4に記載の方法。
- 前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母または形質転換植物である、請求項4または5に記載の方法。
- 宿主細胞に、以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、少なくとも1つの13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体と接触させて、前記13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を切断する工程を含む、13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合のないステビオール配糖体および/またはステビオールの調製方法。
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項7に記載の方法。
- 前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換細菌または形質転換酵母である、請求項7または8に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体が、レバウジオシドA、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルから選択される、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合のないステビオール配糖体が、レバウジオシドBおよびステビオールビオシドから選択される、請求項10に記載の方法。
- 以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるタンパク質と、(d)〜(f)からなる群から選択されるタンパク質と、少なくとも1つの13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体を反応させる工程を含む、ステビオール配糖体および/またはステビオールを製造する方法。
(a)配列番号3または4のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号3または4のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号3または4のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質;
(d)配列番号7または8のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(e)配列番号7または8のアミノ酸配列において、1〜77個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ1,2グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質;
(f)配列番号7または8のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ1,2グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質。 - 少なくとも1つの13位のモノグルコシド結合および/または19位のモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体が、レバウジオシドA、レバウジオシドD、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルから選択される1つ以上のステビオール配糖体である、請求項12に記載の方法。
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