JP6824975B2 - Aobgl11ホモログを用いたステビオールおよびステビオール配糖体の製造方法 - Google Patents
Aobgl11ホモログを用いたステビオールおよびステビオール配糖体の製造方法 Download PDFInfo
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Description
また、ステビオールについては、認知機能の改善効果などが知られている。
さらに、酵母等を利用して、ステビオールを出発物質とし、ステビオールを配糖化してステビオール配糖体を得る工程においても、ステビオールは有用である。培地中にステビオールを添加すれは、酵母は菌体内に取り込むことが可能であるため、ステビオール配糖化酵素遺伝子を菌体内に発現させた酵母を、ステビオールを含む培地で培養すると、当該酵母は菌体内にステビオールを取り込んで配糖化することができる。一方、ステビオール配糖体を培地中に添加しても酵母は菌体内に取り込むことができず、さらなる配糖化はできないことが分かっている。このように、酵母細胞内への取り込みに際しては、ステビオール配糖体よりステビオールの方が望ましく、ステビオールの需要がある。
以上のように、麹菌を含むアスペルギルス属糸状菌はステビオール配糖体加水分解活性を有する酵素遺伝子を有していることが示唆されてはいたものの、酵素活性を担う酵素やそれをコードする遺伝子についての報告はない。
それ以外の生物でも、ステビオール配糖体を加水分解する活性を有することが報告されている。例えば、クラビバクター属細菌が、ルブソシドの19位グルコシルエステル結合を分解するが13位グルコシド結合は分解しない酵素を有することが開示されている(特許文献2)。また、Flavobacterium johnsonae由来のβ−グルコシダーゼに、ステビオール配糖体を分解する活性(13位β−グルコシド結合と19位グルコシルエステル結合を加水分解する活性)があることが報告されている(非特許文献8)。
また、Penicillium decumbens由来のナリンゲナーゼに、ステビオシドからルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオールモノグルコシドを経てステビオールに加水分解する酵素があり、この酵素は分子量121kDaのタンパク質でpH2.3−6.0、温度40−60℃で安定な酵素であることが報告されている(非特許文献9)。
しかしながら、これらはいずれもステビオール配糖体を加水分解する活性を見出してはいるものの、その活性を担う遺伝子については特定されていない。
さらに、麹菌には、β−グルコシダーゼ様活性を有するGH3ファミリー酵素やGH5ファミリー酵素をコードすると考えられる遺伝子が多数存在しており、酵素活性が検出できても、どの遺伝子がその活性を担っているかを特定するのは容易ではない。
さらに、反応条件を選択することで、ステビオール配糖体のうち、13位に結合した分岐三糖またはソホロースの加水分解反応や、19位に結合した分岐三糖の加水分解反応が抑制されることを見出した。また、13位のグルコシド結合よりも、19位のグルコシルエステル結合を優先して切断することを見出した。
[1]
以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるタンパク質と、第1のステビオール配糖体を反応させて、前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合、のうち少なくとも1つを加水分解する工程を含む、ステビオールおよび/または第2のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第1及び第2のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法:
(a)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜83個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質。
[2]
前記第1のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドB,レバウジオシドA、レバウジオシドC、レバウジオシドD、レバウジオシドE、レバウジオシドFおよびレバウジオシドM、ズルコシドA、ステビオール配糖体B、ステビオール配糖体C、ステビオール配糖体Dからなる群より選択される、前記[1]に記載の方法。
[3]
前記第2のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドB、ステビオール配糖体A、ステビオール配糖体B、ステビオール配糖体C、ステビオール配糖体Dからなる群より選択される、前記[1]または[2]に記載の方法。
[4]
前記第1のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる前記[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]
前記有機溶媒がアセトニトリルである、前記[4]に記載の方法。
[6]
前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合または13位の側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)より19位のグルコシルエステル結合または19位の側鎖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)を優先して切断する工程を含む、前記[1]〜[5]のいずれか一項に記載の製造方法。
[7]
前記第1のステビオール配糖体が、13位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および/または、19位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第1のステビオール配糖体を加水分解工程は、下記(1)〜(5)から成る群より選択されるいずれか1つ以上の工程を含む、前記[1]〜[6]のいずれか一項に記載の製造方法、
(1)分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程;
(2)アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程;
(3)13位の分岐三糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)よりも、19位の分岐三糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)を優先して切断する工程;
(4)13位の二糖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)よりも、19位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)および19位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程;
(5)13位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、19位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。
[8]
宿主細胞に、以下の(a)〜(e)からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を、前記第1のステビオール配糖体と接触させて、前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および/または側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)を加水分解する工程を含む、ステビオールおよび/または第2のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第1及び第2のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法:
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜83個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[9]
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記[8]に記載の方法。
[10]
前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、前記[8]または[9]に記載の方法。
[11]
前記第1のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドA、レバウジオシドB、レバウジオシドC、レバウジオシドD、レバウジオシドE、レバウジオシドFおよびレバウジオシドM、ズルコシドA、ステビオール配糖体B、ステビオール配糖体C、ステビオール配糖体Dからなる群より選択される、前記[8]〜[10]のいずれか一項に記載の方法。
[12]
前記第2のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドB、ステビオール配糖体A、ステビオール配糖体B、ステビオール配糖体C、ステビオール配糖体Dからなる群より選択される、前記[8]〜[11]のいずれか一項に記載の方法。
[13]
前記第1のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる、前記[8]〜[12]のいずれか一項に記載の方法。
[14]
前記有機溶媒がアセトニトリルである、前記[13]に記載の方法。
[15]
前記第1のステビオール配糖体が、13位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および/または、19位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第1のステビオール配糖体を加水分解する工程は、下記(1)〜(5)から成る群より選択されるいずれか1つ以上の工程を含む、前記[8]〜[14]のいずれか一項に記載の製造方法、
(1)分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程;
(2)アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程;
(3)13位の分岐三糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)よりも、19位の分岐三糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)を優先して切断する工程;
(4)13位の二糖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)よりも、19位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)および19位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程;
(5)13位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、19位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。
[16]
以下の(a)〜(e)からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、ステビオールおよび/またはステビオール配糖体の製造方法
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜83個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[17]
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記[16]に記載の方法。
[18]
前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、前記[16]または[17]に記載の方法。
具体的には、レバウジオシドB(rebB)やステビオールビオシド(steB)、ステビオールモノシド(steM)を生成することができる。
さらに、本発明の方法ではラムノシド結合を加水分解しないので、ステビオール配糖体の混合物に本酵素を作用させることで、ラムノシドを有する配糖体を特異的に得ることもできる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2016年5 月25日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2016-104404号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明は、以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるタンパク質(以下、「本発明のタンパク質」という)と、13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも1つを有する第1のステビオール配糖体を反応させて、当該第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する工程を含む、ステビオールおよび/または第2のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第1及び第2のステビオール配糖体は互いに異なる、方法を提供する。一実施形態において、ステビオール配糖体の13位のグルコシド結合より19位のグルコシルエステル結合が優先的に切断される。また、一実施形態において、本発明は反応液に有機溶媒を含むステビオールおよび/またはステビオール配糖体の製造方法を提供する。また、一実施形態において、本発明は反応液にアセトニトリルを含むステビオールおよび/またはステビオール配糖体の製造方法を提供する。
(b)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜83個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質
ここで、グリコシド結合とは糖と糖または糖と別の有機化合物が脱水縮合して形成する共有結合のことを意味し、グリコシド結合のなかでもグルコースの1位の炭素との結合をグルコシド結合、ラムノースの1位の炭素との結合をラムノシド結合、キシロースの1位の炭素との結合をキシロシド結合という。
ある実施態様では、前記第1のステビオール配糖体が、13位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および/または、19位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、本願発明は、下記(1)〜(5)から成る群より選択されるいずれか1つ以上の切断を行うことができる。
(1)分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合に対する優先的な切断;
(2)アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースに優先的な切断;
(3)13位の分岐三糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)よりも、19位の分岐三糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)に対する優先的な切断;
(4)13位の二糖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)よりも、19位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)および19位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合に対する優先的な切断;
(5)13位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、19位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合に対する優先的な切断
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸;
C群:アスパラギン、グルタミン;
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸;
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン;
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン;
G群:フェニルアラニン、チロシン。
上記表において、「Glc」はグルコースを示し、「Glc−」は、モノグルコシド結合(R1位)またはモノグルコシルエステル結合(R2位)を含むことを示す。「Rha」および「Xyl」はそれぞれラムノースおよびキシロースを表す。R1位またはR2位に結合している糖鎖が分岐三糖の場合、アグリコンであるステビオールと結合している1つのグルコースに更に2つのグルコースが結合しており、一方の結合がβ1,2結合であり、もう一方はこれに分岐してβ1,3結合していることを表す。また、「側鎖」とはステビオールに結合した糖または糖鎖を意味する。
ステビオールおよび/または本発明のステビオール配糖体は、適切な溶媒(水等の水性溶媒、またはアルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒)による抽出、酢酸エチルやその他の有機溶媒:水の勾配、高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー(Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC)等の公知の方法によって精製することができる。
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃、または0.2xSSC、0.1%SDS、60℃、または0.2xSSC、0.1%SDS、62℃、または0.2xSSC、0.1%SDS、65℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
(i)宿主細胞内で転写可能なプロモーター;
(ii)該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド;および
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
形質転換で用いられる宿主は、13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも1つを有するステビオール配糖体を生成するものであれば好ましい。ステビアやテンチャのように、元来少なくとも1つの13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合および/または側鎖内のグリコシド結合を有するステビオール配糖体を生成する植物だけではなく、本来13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合および/または側鎖内のグリコシド結合を有するステビオール配糖体を生成しない細胞または生物に少なくとも1つの13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合および/または側鎖内のグリコシド結合を有するステビオール配糖体の生成に必要な遺伝子を導入したものを宿主として用いることができる。「13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも1つを有するステビオール配糖体の生成に必要な遺伝子」は、例えば、WO2011/093509などに記載のステビオールやステビオール配糖体合成活性を有する遺伝子が挙げられる。
本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させ、細胞を破砕することにより本発明のタンパク質を得ることができる。本発明のタンパク質を作用させることで、本発明のステビオール配糖体および/またはステビオールを生成することもできる。
具体的には、本発明の形質転換細胞に由来する酵素を、13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも1つを有するステビオール配糖体と接触させることによりステビオールを生成することができる。また、反応液中にアセトニトリルのような有機溶媒を添加することで、13位に結合した分岐三糖または二糖や、19位に結合した分岐三糖の加水分解反応は抑制され、優先して13位のモノグルコシド結合や19位のに結合した二糖内のグリコシド結合や19位のグルコシルエステル結合やが切断されたステビオール配糖体が生成する。本発明のタンパク質は、酵母で発現させた場合にも麹菌で発現させた場合と同等の活性を示すことが実施例においても確認されている。
「形質転換細胞に由来する酵素」は、形質転換細胞を用いて調製され、本発明のタンパク質を含むものであれば限定されないが、例えば、形質転換細胞自体、形質転換細胞の粉砕物自体、形質転換細胞の培養上清自体、およびこれらの精製物である。そこで、本発明は、宿主細胞に、以下の(a)〜(e)からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を、13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合のうち少なくとも1つを有する第1のステビオール配糖体と接触させて、当該第1ステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)のうち少なくとも1つを加水分解する工程を含むステビオールおよび/または第2のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第1及び第2のステビオール配糖体は互いに異なる、方法を提供する。
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜83個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質タンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシドの結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
麹菌ゲノムデータ(PRJNA28175)より、β−グルコシダーゼホモログを探索し、菌体内β‐グルコシダーゼのホモログであるAO090701000244(CDS配列:配列番号1、推定アミノ酸配列:配列番号2、ORF配列:配列番号3、ゲノムDNA配列:配列番号4)を見出した。これをAOBGL11としてクローン化することにした。
AOBGL11をクローニングするために、以下のプライマーを設計した。
AOBGL11−F:
5´‐ATGCCTCGTCTAGACGTCGAGAA‐3´(配列番号7)
AOBGL11−R:
5´‐TCACAGACCCAACCAGTAGCGA‐3´(配列番号8)
ゲノムDNAを鋳型として、プライマーAOBGL11−FとAOBGL11−Rを用いて、KOD−plus(東洋紡)でPCRを行った。得られた約2.57kbpのDNA断片を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(インビトロジェン)を使ってクローン化し、プラスミドpCR−AOBGL11gを得た。
麹菌用ベクターpUNA(酒類総合研究所)を制限酵素SmaIで消化して得られたDNA断片と、プラスミドpCR−AOBGL11gを制限酵素EcoRIで消化し末端をBlunting Kit(タカラバイオ)によって平滑化して得られた約2.57kbpのDNA断片を連結し、プラスミドpUNA−AOBGL11gを得た。
麹菌の形質転換は以下のとおり実施した。
宿主として、Aspergillus oryzae niaD300株(酒類総合研究所)を使用した。宿主株をPDAプレートに植菌し、30℃でおよそ1週間培養した。分生子懸濁液を得るために、0.1% tween80, 0.8% NaClを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、0.1% tween80, 0.8% NaClで洗浄し、滅菌水に懸濁した。
分生子をCDプレート(1Lあたり、NaNO3 6g、KCl 0.52g、KH2PO4 1.52g、グルコース 10g、1M MgSO4 2ml、Trace element solution(1Lあたり、FeSO4・7H2O 1g、ZnSO4・7H2O 8.8g、CuSO4・5H2O 0.4g、NaB4O7・10H2O 0.1g、(NH4)6Mo7O24・4H2O 0.05g ) 1ml、アガー 20g(pH6.5))に塗布し、パーティクルデリバリー法により、DNAの導入を行った。PDS−1000/He(バイオラッド)を使って、パーティクル:タングステンM−10、ラプチャーディスク:1100psi、距離:3cmとした。形質転換株として、CDプレートで生育するものを選抜した。プラスミドpUNA−AOBGL11gにより形質転換して得られた形質転換株をBGL11−1株、コントロールベクターpUNAにより形質転換して得られた形質転換株をC−1株とした。
BGL11−1株またはC−1株をCDプレートに植菌し、30℃で7日間培養し、分生子を形成させた。分生子懸濁液を得るために、0.1% tween80, 0.8% NaClを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、0.1% tween80, 0.8% NaClで洗浄し、滅菌水に懸濁し、分生子懸濁液としたこの分生子懸濁液を酵素生産用液体培地(1Lあたり、マルトース 100g、バクトトリプトン 1g、酵母エキス 5g、NaNO3 1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.5g、FeSO4・7H2O 0.01g) に植菌し、30℃で2日間振とう培養を行った。ミラクロスによりろ過して菌体を集めた。得られた湿菌体 約4gを液体窒素で凍結し、乳鉢ですりつぶした。すりつぶした菌体を50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)に懸濁し、よく混合した後、遠心分離した。得られた上清を、アミコンウルトラ−15 50k(メルク)で、限外ろ過により濃縮し、0.1% CHAPSを含む50mM リン酸ナトリウムバッファーpH7.0(バッファーA)で置換することにより、約1mlの粗酵素液を得た。
粗酵素液のタンパク質濃度は、プロテインアッセイCBB溶液(5倍濃縮)(ナカライテスク)を用いて定量した。その結果、BGL11−1粗酵素液 6.46mg/ml、C−1粗酵素液4mg/mlであった。
pNP−β−Glcの分解活性を検討した。粗酵素液10μL、0.2M リン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)50μL、20mM pNP−β−Glc水溶液 50μL、水を加えてトータル200μLとし、37℃で反応させた。なお、BGL11−1粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を0.1% CHAPSを含む50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)バッファーで100倍に希釈したものを用いた。pNP−β−Glc が加水分解して遊離したp−ニトロフェノール(pNP)に基づく1分間あたりの405nmの吸光度変化(Δ405)は、BGL11−1粗酵素液で0.244、C−1粗酵素液で0.000であった。
以上のことからも、AOBGL11pがβ−グルコシダーゼ活性を担っていることが示唆された。
なお、BGL11−1粗酵素液はバッファーAで5000倍希釈したもの(タンパク質濃度 1.3μg/ml)を使用した。
基質として、レバウジオシドM、レバウジオシドD、レバウジオシドA、ステビオシド、ルブソシドを用いた。
ステビオール配糖体はHPLCまたはLC−MSで分析した。
HPLCの分析条件は以下のとおりである。
カラム:コスモシール5C18−AR−II 4.6mmI.D.x250mm(ナカライテスク)
移動相:A;アセトニトリル、B; 10mM リン酸ナトリウムバッファー(pH2.6)
B conc.70%→30% 40分 linear gradient
流速:1ml/分
温度:40℃
検出:UV 210nm
カラム:mtakt SM−C18 4.6 x 250 mm
移動相:A;0.5% 酢酸、B; メタノール
B conc. 10%(0分−5分)→70%(20分)→100%(25分−30分)→10%(31分―40分)
流速:0.4ml/分
基質 50μg/ml、BGL11粗酵素液(タンパク質濃度6.5mg/ml) 20μl、 50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、全量を100μlとし、37℃で24時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したSep−PakC18(Waters)に供し、続いて20%アセトニトリルで洗浄したあと、50%アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、100μLの水で再溶解し、HPLCに供した。基質がrebMの場合はLC−MSにも供した。
rebMを基質とした場合には、主な生成物としてステビオールが検出され、中間体としてrebD、stv、rebBが検出された(図3 A)。rebD(図4 A)、rebA(図5 A)、stv、rubを基質とした場合にも主な生成物はステビオールであった。
なお、コントロールとしてC−1粗酵素液でも同様の反応を行ったがいずれの基質も加水分解されず、生成物は検出できなかったことから、上記ステビオール配糖体加水分解活性はAOBGL11pによるものであると考えられた。
基質 50μg/ml、酵素液 20μl、 50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、0%または8%アセトニトリル、全量を100μlとし、37℃で24時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したSep−PakC18(Waters)に供し、続いて20%アセトニトリルで洗浄したあと、50%アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、100μLの水で再溶解し、HPLCに供した。
rebMは、反応液中に8%アセトニトリルを添加した場合、ほとんど分解されなかった(図3 C)。
rebDとrebAは、8%アセトニトリルを添加した場合でも、加水分解されrebBを生じたが、ステビオールは検出されなかった(図4B、図5B)。
stvは8%アセトニトリルを添加した場合でも、加水分解されsteBを生じ、24時間の反応で基質は検出できなかった。steBは、さらにステビオールにまで加水分解されていたが、その量はわずかであった。
Rubは24時間の反応で加水分解され、ステビオールを生じた。24時間反応で基質は検出できなかった。
基質 50μg/ml、BGL11粗酵素液(タンパク質濃度6.5mg/ml) 20μl、 50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、全量を100μlとし、50℃で24時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したSep−PakC18(Waters)に供し、続いて20%アセトニトリルで洗浄したあと、50%アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、100μLの水で再溶解し、HPLCに供した。
rebMは加水分解されなかった。
rebDとrebAは一部加水分解され、rebBを生じたが、さらに加水分解された生成物は検出されなかった。
Stvは一部加水分解され、steBが生成したが、さらに加水分解された生成物は検出できなかった。
Rubは一部加水分解され、steMとステビオールが生成した。
(1)ステビオール配糖体をステビオールに加水分解する。中間生成物の存在から、糖を1つずつ加水分解すると考えられる。
(2)ステビオール19位に付加された糖をステビオール13位に付加された糖よりも優先して加水分解する。
(3)分岐三糖は反応条件によっては加水分解されない。
レバウディオ JM(守田化学工業株式会社、図6A)とステビロンS−100(守田化学工業株式会社、図6B)をAOBGL11pで加水分解した。
反応条件は、レバウディオ JM 1mg/ml(図8)または10mg/ml(図7)、またはとステビロンS−100 1mg/ml(図9)、酵素液 20μl、 50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、0%、4%または8%アセトニトリル、全量を100μlとし、37℃で24時間反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したSep−PakC18(Waters)に供し、続いて20%アセトニトリルで洗浄したあと、50%アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、100μLの水で再溶解し、HPLCに供した。
BGL11−1株を酵素生産用培地10mlで培養し、ろ過により菌体を集めた。菌体を液体窒素で凍結し、乳鉢で菌体をすりつぶしてから、RNeasy(QIAGEN)でトータルRNAを抽出した。SuperScript Double−Stranded cDNA Synthesis Kit(ライフテクノロジーズ)により、cDNAを合成した。これを鋳型として、プライマーAOBGL11−FとAOBGL11−Rを用いて、KOD−plus(東洋紡)でPCRを行った。得られた約2.52kbpのDNA断片を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(インビトロジェン)を使ってAOBGL11のcDNAをクローン化し、プラスミドpCR−AOBGL11cDNAを得た。塩基配列を確認したところ、CDS配列は配列番号1の通りであった。AOBGL11のゲノムDNA配列とCDS配列を比較したものを図10に示す。
プラスミドpCR−AOBGL11 cDNAをEcoRIで消化して得られた約2.52kbpのDNA断片を、酵母発現ベクターpYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221-1228,1995)のEcoRIサイトに挿入し、AOBGL11がベクターpYE22mのGAPDHプロモーターから発現する向きに挿入されたものを選抜し、pYE−AOBGL3cとした。形質転換の親株として、S.cerevisiaeのEH13−15株(trp1,MATα)(Appl.Microbiol.Biotechnol.,30,515-520,1989)を用いた。
プラスミドpYE22m(コントロール)、pYE−AOBGL11(AOBGL11発現用)をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、EH13−15株を形質転換した。形質転換株は、SC−Trp(1Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO)6.7g、グルコース20g、およびアミノ酸パウダー(アデニン硫酸塩1.25g、アルギニン0.6g、アスパラギン酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0.6g、ロイシン1.8g、リジン0.9g、メチオニン0.6g、フェニルアラニン1.5g、セリン11.25g、チロシン0.9g、バリン4.5g、スレオニン6g、ウラシル0.6gを混合したもの)1.3gを含む)寒天培地(2%アガー)上で生育するものを選抜した。
選抜したC−Y株とAOBGL11−Y株を、1Mリン酸カリウムバッファーを1/10量添加したSC−Trp液体培地10mLに1白金耳植菌し、30℃、125rpmで2日間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離により、培養上清と菌体に分けた。培養上清は、アミコンウルトラ−15 50k(メルク)で限界ろ過に濃縮して0.1% CHAPSを含む50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)でバッファー置換し、約1mlの培養上清濃縮液を得た。
菌体は、50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)、0.1%CHAPS溶液 1mlに懸濁して、ガラスビーズにて菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を菌体破砕液とした。
培養上清濃縮液または菌体破砕液を20μlとり、2% X‐β‐Glc/DMF溶液を1μl添加し、室温で5分間反応させたところ、AOBGL11−Y株由来の菌体破砕液のみ青色を呈し、X−β−Glc活性を有することが示唆された。
pNP−β−Glcの分解活性を検討した。粗酵素液10μL、0.2M リン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)50μL、20mM pNP−β−Glc水溶液 50μL、水を加えてトータル200μLとし、37℃で反応させた。なお、BGL11−1粗酵素液は活性が高かったため、粗酵素液を0.1% CHAPSを含む50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)バッファーで100倍に希釈したものを用いた。pNP−β−Glc が加水分解して遊離したp−ニトロフェノール(pNP)に基づく1分間あたりの405nmの吸光度変化(Δ405)は、AOBGL11−Y粗酵素液で0.068、C−Y粗酵素液で0.000であった。
C−Y株とAOBGL11−Y株の菌体破砕液のステビオール配糖体の加水分解活性を検討した。
基質 50μg/ml、酵素液 20μl、 50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.0)、全量を100μlとし、50℃で反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したSep−PakC18(Waters)に供し、続いて20%アセトニトリルで洗浄したあと、50%アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、100μLの水で再溶解し、HPLCに供した。
一方、AOBGL11−Y株由来の菌体破砕液で反応した場合、以下の表に示す基質と生成物が得られた。
一方、反応液中に8%アセトニトリルを添加すると以下の表に示す基質と生成物が得られた。。
このように、AOBGL11は、酵母で発現させた場合にも麹菌で発現させた場合と同等の活性を示すことがわかった。
レバウジオシドC(rebC) 50μg/ml、BGL11粗酵素液 20μl、 50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、全量を100μlとし、37℃で24時間反応させた。粗酵素液は、タンパク質濃度6.5mg/mlのもの(原液、C)、1/1000希釈したもの(B)、限外ろ過により約20倍濃縮したもの(C)をそれぞれ用いた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したSep-PakC18(Waters)に供し、続いて20%アセトニトリルで洗浄したあと、50%アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、100μLの水で再溶解し、HPLC、LC−MSに供した。結果を図12に示す。
レバウジオシドF(rebF)50μg/ml、BGL11粗酵素液(タンパク質濃度6.5mg/ml) 20μl、 50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、全量を100μlとし、37℃で1時間(図13B)または24時間(図13C)反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄したあと水で平衡化したSep-PakC18(Waters)に供し、続いて20%アセトニトリルで洗浄したあと、50%アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、100μLの水で再溶解し、HPLC、LC−MSに供した。結果を図13および以下の表に示す。
Claims (18)
- 以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるタンパク質と、第1のステビオール配糖体を反応させて、前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合、のうち少なくとも1つを加水分解する工程を含む、ステビオールおよび/または第2のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第1及び第2のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法:
(a)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜83個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質。 - 前記第1のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドB,レバウジオシドA、レバウジオシドC、レバウジオシドD、レバウジオシドE、レバウジオシドFおよびレバウジオシドM、ズルコシドA、ステビオール配糖体B、ステビオール配糖体C、ステビオール配糖体Dからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドB、ステビオール配糖体A、ステビオール配糖体B、ステビオール配糖体C、ステビオール配糖体Dからなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒がアセトニトリルである、請求項4に記載の方法。
- 前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合または13位の側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)より19位のグルコシルエステル結合または19位の側鎖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)を優先して切断する工程を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記第1のステビオール配糖体が、13位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および/または、19位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第1のステビオール配糖体を加水分解工程は、下記(1)〜(5)から成る群より選択されるいずれか1つ以上の工程を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の製造方法、
(1)分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程;
(2)アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程;
(3)13位の分岐三糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)よりも、19位の分岐三糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)を優先して切断する工程;
(4)13位の二糖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)よりも、19位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)および19位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程;
(5)13位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、19位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。 - 宿主細胞に、以下の(a)〜(e)からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素を、前記第1のステビオール配糖体と接触させて、前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および/または側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)を加水分解する工程を含む、ステビオールおよび/または第2のステビオール配糖体の製造方法であって、前記第1及び第2のステビオール配糖体は互いに異なる、前記方法:
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜83個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項8に記載の方法。
- 前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、請求項8または9に記載の方法。
- 前記第1のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールモノグルコシルエステル、ルブソシド、ステビオールビオシド、ステビオシド、レバウジオシドA、レバウジオシドB、レバウジオシドC、レバウジオシドD、レバウジオシドE、レバウジオシドFおよびレバウジオシドM、ズルコシドA、ステビオール配糖体B、ステビオール配糖体C、ステビオール配糖体Dからなる群より選択される、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のステビオール配糖体が、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドB、ステビオール配糖体A、ステビオール配糖体B、ステビオール配糖体C、ステビオール配糖体Dからなる群より選択される、請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のステビオール配糖体を反応させる工程が有機溶媒の存在下で行われる、請求項8〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒がアセトニトリルである、請求項13に記載の方法。
- 前記第1のステビオール配糖体が、13位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシド結合し、および/または、19位に分岐三糖、二糖、またはグルコース単糖がグルコシルエステル結合したものであり、かつ、前記第1のステビオール配糖体を加水分解する工程は、下記(1)〜(5)から成る群より選択されるいずれか1つ以上の工程を含む、請求項8〜14のいずれか一項に記載の製造方法、
(1)分岐三糖よりも、二糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)またはグルコース単糖のグルコシド結合またはグルコシルエステル結合を優先して切断する工程;
(2)アグリコンに結合したグルコースに、さらにキシロースとグルコースが、もしくはラムノースとグルコースが結合した場合にはグルコースを優先して切断する工程;
(3)13位の分岐三糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)よりも、19位の分岐三糖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)を優先して切断する工程;
(4)13位の二糖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)よりも、19位の分岐三糖または二糖内のグリコシド結合(ラムノシドを除く)および19位グルコース単糖とのグルコシルエステル結合を優先して切断する工程;
(5)13位のグルコース単糖のグルコシド結合よりも、19位のグルコース単糖のグルコシルエステル結合を優先して切断する工程。 - 以下の(a)〜(e)からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、ステビオールおよび/またはステビオール配糖体の製造方法
(a)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜83個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号1の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ前記第1のステビオール配糖体の13位のグルコシド結合、19位のグルコシルエステル結合、および側鎖内のグリコシド結合(ラムノシド結合を除く)、のうち少なくとも1つを加水分解する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項16に記載の方法。
- 前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母、形質転換細菌または形質転換植物である、請求項16または17に記載の方法。
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