JPH10276775A - グリコシルエステル分解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 グリコシルエステル結合を分解する活性が非
常に高く、またグリコシルエーテル結合よりグリコシル
エステル結合により特異性を示すグリコシルエステル分
解酵素の提供。 【解決手段】 βーグルコシダーゼ活性を併せ持つグリ
コシルエステル分解酵素およびクラビバクター属細菌に
よるその生産方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なグリコシルエ
ステルのエステル結合を分解する活性の優れたグリコシ
ルエステル分解酵素およびその生産方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】天然の配糖体には、各種テルペノイド、
ステロイド、キノン類やフラボノイド、リグナン、青酸
配糖体、辛子配糖体、抗生物質などが知られている。こ
れらの配糖体は酸もしくはアルカリ処理または酵素処理
によって加水分解されて、糖とアグリコンに分解され
る。この配糖体の酵素による分解は食品加工・食品工業
においても利用されており、その具体的な例としては、
グレープフルーツや夏みかんに含まれ、苦みを示すナリ
ンジンの酵素分解（ナリンジナーゼ）による苦みの除去
や、ワインに含まれる芳香化合物テルペンの揮発性の強
化（テルペンと糖が結合した複合糖鎖では芳香を放つこ
とはできない）などがある。上記のように糖がエーテル
結合でアグリコンに結合した配糖体の酵素分解（配糖体
→糖＋アグリコン）は多く知られているが、糖がエステ
ル結合でアグリコンに結合（グリコシルエステル結合）
した配糖体の酵素分解（配糖体→糖＋アグリコン）は、
パン酵母およびＲｈｉｚｏｐｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ
によるステビオシドの加水分解（日本農芸化学会誌、ｖ
ｏｌ．６３，Ｎｏ．６，ｐｐ．１１１９〜１１２１，
１９８９）、およびＨｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ（カタ
ツムリ）の消化管ホモジネート起源のヘリカーゼおよび
土壌バクテリアによるステビオシドの加水分解（農業生
物資源研究所報告第４号、１９〜６４（１９８８））が
知られている程度であった。しかしながら、これらの微
生物または酵素によるグリコシルエステルの分解活性は
それほど高いものではなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明はグリコシルエ
ステル分解活性の優れたグリコシルエステル分解酵素お
よびその生産方法を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記課題は、β−グルコ
シダーゼ活性を併せ持つグリコシルエステル分解酵素、
およびβ−グルコシダーゼ活性を併せ持つグリコシルエ
ステル分解酵素を生産する能力を有するクラビバクター
属細菌を栄養培地に培養し、培養物から生成した該グリ
コシルエステル分解酵素を採取することを特徴とする該
グリコシルエステル分解酵素の生産方法によつて解決さ
れた。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明者らは実用的なグリコシル
エステル分解酵素を得るために、まず、市販のエステラ
ーゼ、リパーゼ、β−グルコシダーゼ、セルラーゼなど
１０数種の酵素からスクリーニングを行った。その結
果、ローザイム（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｃ．製）など
の一部の市販酵素でグルコシルエステル分解活性を示す
ことが分ったが、その活性は極々僅かなものであること
を確認した（参考例１）。そこで、土壌からグルコシル
エステル分解酵素を生産する菌株のスクリーニングを行
ったところ、グルコシルエステル結合を著しく分解する
菌株を得ることができた。本発明は、グリコシルエステ
ル結合の分解活性の優れた菌株および酵素を新たに見出
すことに成功したものであり、このようにグリコシルエ
ステル結合を著しく分解する菌株および酵素は従来全く
知られておらず新規である。

【０００６】本発明のグリコシルエステル分解酵素は、
β−グルコシダーゼ活性の指標とされるｐ−ニトロフェ
ニル−β−グルコシド、サリシン、フェニル−β−グル
コシドなどのエーテル結合を加水分解するのでβ−グル
コシダーゼの一種でもある。本発明のグリコシルエステ
ル分解酵素は、より限定的にはグルコシルエステル分解
酵素である。本発明のグリコシルエステル分解酵素は、
さらには基質であるグルコシルエステルがグルコシルエ
ーテル結合をも有する場合には、グルコシルエステル結
合により特異的に作用するという性質を有する。例え
ば、本発明のグリコシルエステル分解酵素をグルコシル
エステル結合とグルコシルエーテル結合とを併せ持つス
テビオール配糖体に作用させると、グルコシルエステル
結合をより特異的に加水分解する。具体的には例えば、
後述の実施例２で得られた酵素は、ルブソシドではグル
コシルエステル結合のみを加水分解し、レバウディオシ
ドＡではグルコシルエステル結合をより特異的に加水分
解する（実施例３および４）。なお、本発明のグリコシ
ルエステル分解酵素による加水分解反応は可逆的である
と考えられ、したがって本酵素はグリコシルエステル結
合の合成や転移反応にも利用することができると考えら
れる。

【０００７】本発明のグリコシルエステル分解酵素の基
質であるグリコシルエステルは糖とカルボン酸であるア
グリコンよりなるが、糖としては還元糖、例えば単糖
（グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトー
スなどのヘキソース、アラビノース、キシロース、リボ
ースなどのペントースなど）、還元糖であるオリゴ糖
（マルトース、イソマルトース、ラクトース、マルトト
リオース、イソマルトトリオース、パノースなど）など
が挙げられる。

【０００８】カルボン酸であるアグリコンとしては種々
のものが挙げられる。例えば、完全な分類ではなく内容
的に重複する場合もあるが、ギ酸、酢酸、プロピオン
酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アクリ
ル酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、トラネキ
サム酸、ε−アミノカプロン酸、塩化カルニチン、また
はリポ酸などのビタミン類などの脂肪酸系化合物；グリ
シン、アラニン、バリン、ロイシン、プロリン、ヒドロ
キシプロリン、アスパラギン酸、リジン、チロキシン、
リオチニン、葉酸、カイニン酸、アミノプテリン、γ−
アミノ酪酸などのアミノ酸およびこれらのアミノ酸で構
成されるペプチドまたはタンパク質よりなるアミノ酸系
化合物；乳酸、グリセリン酸、酒石酸、クエン酸、リン
ゴ酸などのヒドロキシ酸系化合物；グリオキシル酸、オ
ピアン酸、フタルアルデヒド酸などのアルデヒド酸系化
合物；ピルビン酸、レブリン酸、ジオキシ酒石酸、ケト
グルコン酸などのケトン酸系化合物；安息香酸、フタル
酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、フェノール酸類（没食子
酸、サリチル酸、オルセリン酸など）、ニコチン酸など
のビタミン類、インドメタシン、メフェナム酸などの芳
香族系化合物；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘ
パリンなどのムコ多糖類；デヒドロコール酸、ウルソデ
ヒドロコール酸などのステロイド系化合物、ペニシリ
ン、セファロスポリンなどのβ−ラクタム系化合物；ス
テビオシド、レバウディオシドＡ、ルブソシドなどの、
エステル結合を有する、カウレン系ジテルペン化合物、
特にステビオール配糖体のアグリコンであるカルボン酸
などが挙げられる。

【０００９】本発明のグリコシルエステル分解酵素の基
質であるグリコシルエステルは、上記したような糖とカ
ルボン酸であるアグリコンとがグリコシルエステル結合
してできたエステルであるが、グルコシルエステルであ
ることが好ましい。ここで、本発明でグルコシルはグル
コースのアノマー性ＯＨを除いた基のみならず、グルコ
ースをアノマー末端構成糖とするオリゴ糖のアノマー性
ＯＨを除いた基をも意味するものとする。本発明のグリ
コシルエステル分解酵素の基質であるグリコシルエステ
ルのより好ましい例は、グルコシルエステル結合を持つ
ステビオール配糖体（例えばルブソシド、ステビオシ
ド、レバウディオシドＡ、ステビオールモノグルコシド
エステルなど）である。

【００１０】本発明のグリコシルエステル分解酵素の具
体的な例として、以下の酵素学的性質を有するグリコシ
ルエステル分解酵素が挙げられる： （１）作用 β−グルコシダーゼ活性を示し、グルコシルエステルを
加水分解する。すなわち、ｐ−ニトロフェニル−β−グ
ルコシドのエーテル結合を加水分解すると等モルのｐ−
ニトロフェノールとグルコースとを生成すると共に、グ
ルコシルエステルに作用させると、等モルのグルコース
またはグルコースをアノマー末端構成糖とするオリゴ糖
とアグリコンであるカルボン酸とを生成する。 （２）基質特異性 ｐ−ニトロフェニル−β−グルコシド、ルブソシド、ス
テビオシドおよびレバウディオシドＡには作用するが、
ステビオールモノシドおよびゲンチオビオースには作用
しない。 （３）至適ｐＨ ７〜８ （４）ｐＨ安定性 ｐＨ６〜１０で安定 （５）至適温度 ４０〜４５℃ （６）温度安定性 ４０℃以下で安定 （７）分子量 ＳＤＳ電気泳動およびゲルろ過ＦＰＬＣにより測定した
値は共に約６５，０００。

【００１１】本発明のグリコシルエステル分解酵素のさ
らに具体的な例として、実施例にその取得および酵素学
的性質ついての分析を示す、上記（１）〜（７）の酵素
学的性質に加え以下の酵素学的性質を有するグリコシル
エステル分解酵素が挙げられる： （８）等電点 ｐＨ４．６ （９）阻害剤 ＨｇおよびｐＣＭＢにより活性が著しく
阻害される。

【００１２】本発明のグリコシルエステル分解酵素は、
β−グルコシダーゼ活性を併せ持つグリコシルエステル
分解酵素を生産する能力を有するクラビバクター属細菌
を栄養培地に培養し、培養物から生成した該グリコシル
エステル分解酵素を採取することによって生産される。
生産に使用される微生物としてはクラビバクター属に属
し、上記グリコシルエステル分解酵素産生能を有する微
生物であればいずれの微生物でも良い。具体的には、ク
ラビバクター・ミシガネンセ（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ
ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ）に属し、上記グリコシル
エステル分解酵素産生能を有する微生物、さらに具体的
にはクラビバクター・ミシガネンセＣ２９３が挙げられ
る。

【００１３】Ｃ２９３株は、糖質からの酸産生能、有機
酸の利用能、でんぷん類の加水分解能、硫化水素の産生
能などの生化学的性質がバージェース・マニュアル・オ
ブ・システマティック・バクテリオロジー ｖｏｌ．２
（１９８６）に記載されたコリネバクテリウム・ミシ
ガネンセ（後にクラビバクター・ミシガネンセに変更さ
れた）の生化学的性質と一致したこと、およびＮＣＩＭ
Ｂ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎ
ｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｓｃｏｔｌ
ａｎｄ）におけるＭＩＤＩデータベースによる菌体脂肪
酸組成の相同性検索から、Ｃ２９３株がコリネバクテリ
ウム（クラビバクター）・ミシガネンセと同定されたこ
とから、クラビバクター・ミシガネンセと同定した。ク
ラビバクター・ミシガネンセＣ２９３は通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６１
３１として寄託されている。

【００１４】本発明に使用する栄養培地としては炭素
源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要
とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然
培地、合成培地のいずれでも良い。炭素源としてはグル
コース、マルトース、フラクトース、スクロース、デン
プン、デキストリン、グリセリンなどの炭水化物などが
用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、グルタミン酸などのアミノ酸、尿酸などの無機有機
窒素化合物が用いられる。窒素源としてはペプトン、ポ
リペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆
粉、大豆粕、乾燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタ
ブルプロテインなどの窒素含有天然物も使用できる。無
機物としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、
硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシ
ウムなどが用いられる。その他にビオチン、チアミンな
どの微量栄養素を必要に応じ使用する。

【００１５】培養法としては液体培養法（振盪培養法も
しくは通気攪拌培養法）が良く、工業的には通気攪拌培
養法が最も適している。培養温度は５〜４５℃の範囲で
行うことができるが、３０〜４０℃が好適である。ｐＨ
は６．５〜７．５が好適である。培養期間は培養条件に
よって変ってくるが、通常１５〜７２時間程度であり、
グリコシルエステル分解酵素の生成が確認されたとき、
好ましくは生成が最大に達したときに培養を停止する。

【００１６】このようにして得られた培養物から本発明
のグリコシルエステル分解酵素を取得するには、まず遠
心分離法やろ過法などにより培養物を培養液画分と菌体
画分に分画する。グリコシルエステル分解酵素は菌体内
酵素なので、菌体を粉砕し、この無細胞抽出液を出発原
料として、限外ろ過、塩析、透析、溶媒沈殿、イオン交
換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル
ろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等
電点クロマトグラフィーなどの周知の単離・精製方法の
単独あるいは任意の組合せに付すことにより、グリコシ
ルエステル分解酵素の精製標品を得ることができる。

【００１７】なお、以下の参考例および実施例において
酵素のグリコシルエステル分解活性は以下のようにして
測定した（目的によってはいずれかの条件（例えばｐ
Ｈ、温度、時間等）を変えて行った）。１０ｍＭの基質
を含有する水溶液１００μｌに酵素を含有する５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌを添加し、４０
℃で２０分間反応させた。０．１Ｎ水酸化ナトリウム１
５０μｌを加えて酵素反応を停止し、０．１Ｎ酢酸ナト
リウム１５０μｌを加えて中和した。ついで、遊離した
グルコースを酵素法で測定した。すなわち、この反応終
了液（５００μｌ）に、グルコース検査試薬（ダイヤカ
ラー・ＧＣ（東洋紡））５００μｌを加え、４０℃で３
０分間反応させた後、５５８ｎｍでの吸光度を分光光度
計を用いて測定し、該測定値から反応液中の生成グルコ
ース量を測定した。生成したグルコースの量から、１分
間に１μｍｏｌの基質を分解する酵素量を求め、これを
１単位（ｕｎｉｔ）とした。

【００１８】

【実施例】次に本発明を実施例および参考例により具体
的に説明する。 参考例１ 市販酵素のグルコシルエステル分解活性について 市販酵素として、ローザイムＨＰ１５０（Ｇｅｎｅｎｃ
ｏｒ Ｉｎｃ．）、セルラーゼＹ−ＮＣ（ヤクルト）、
セルロシンＡＣ４０（阪急バイオインダストリー）、セ
ルラーゼ（長瀬）、オリエンターゼＯＮＳ（阪急バイオ
インダストリー）、ビスコザイムＬ（ノボ）、セルラー
ゼ（シグマ）、キタラーゼ（ケイアイ化成）、セルラー
ゼＴＣ（セルバ）、セルラーゼオノズカ３Ｓ（ヤクル
ト）、セルラーゼＴアマノ（天野）、タカジアスターゼ
（三共）およびβ−グルコシダーゼ２種（シグマ：Ｃａ
ｌｄｏｃｅｌｌｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｕｍお
よびＡｌｍｏｎｄ起源）を用い、基質としてグルコシル
エステル結合を有するルブソシド（１０ｍＭ）を用い
た。酵素濃度は固形の酵素の場合は２０ｍｇ／ｍｌに、
液体の酵素の場合は５０μｌ／ｍｌとした。グルコシル
エステル分解活性は、各酵素と基質とを等量混合し、４
０℃で１時間反応させ、ルブソシドのグルコシルエステ
ル結合が加水分解されたときに生じるステビオールモノ
シドをＨＰＬＣで定量して求めた。

【００１９】ＨＰＬＣ条件 カラム：ＹＭＣ−Ｐａｋ ＡＱ−３０３、移動相：３５
％アセトニトリル（ｐＨ２．０）、流速：１．０ｍｌ／
ｍｉｎ、検出：ＵＶ２１３ｎｍ、試料注入量：１０μｌ ローザイムなどの一部の酵素に分解活性が極々僅かに確
認された（表１）が、他の市販の酵素では全く分解され
なかった。

【００２０】

【表１】

【００２１】＜分解が全く認められなかった市販酵素＞ （糖質関連酵素）セルラーゼＹ−ＮＣ（ヤクルト）、セ
ルラーゼ（長瀬）、ビスコザイムＬ（ノボ）、キタラー
ゼ（ケイアイ化成）、セルラーゼＴＣ（セルバ）、セル
ラーゼオノズカ３Ｓ（ヤクルト）、セルラーゼＴアマノ
（天野）、タカジアスターゼ（三共）およびβ−グルコ
シダーゼ２種（シグマ） （脂質関連酵素）エステラーゼ（シグマ）、エステラー
ゼＡＣ４０９（長瀬）、アセチルエステラーゼ（シグ
マ）、ペクチンエステラーゼ（シグマ）、リパーゼ（ノ
ボ）、リパーゼ（田辺）、リパーゼＯＦ（名糖）および
リパーゼ（シグマ）

【００２２】実施例１ グルコシルエステル分解酵素生産菌株のスクリーニング グルコシルエステル分解酵素のスクリーニングは、グル
コシルエステル結合を有するステビオシド、レバウディ
オシドＡ、ルブソシドなどのステビオール配糖体を基質
として行った。すなわち、これらを唯一の炭素源とする
培地で生育する微生物を単離し、エステル分解活性を薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびＨＰＬＣで調べ
た。これらのスクリーニングによってグルコシルエステ
ル分解活性を有するクラビバクター属細菌を得ることが
できた。

【００２３】（薄層クロマトグラフィー）ステビオシ
ド、ルブソシド、レバウディオシドＡなどのグルコシル
エステル結合を有するステビオール配糖体の溶液に菌体
または無細胞抽出液を加え、４０℃で反応させ、反応液
を薄層クロマトグラフィーで分析した。薄層クロマトグ
ラフィーは、シリカゲル６０プレコートプレート（蛍光
指示薬不含、メルク社製）を用い、クロロホルム：メタ
ノール：水＝１０：５：０．５（ｖ／ｖ）の溶媒系で、
上昇法によって行った。検出は、プレートに硫酸：メタ
ノール＝１：１（ｖ／ｖ）を噴霧した後、プレートを１
１０℃に５分保つことによって行った。 （ＨＰＬＣ）１０ｍＭのルブソシド溶液に無細胞抽出液
を加え、４０℃で１時間反応させた反応液１０μｌをＨ
ＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣは、ＯＤＳ系のカラム Ｙ
ＭＣ−ｐａｃ ＡＱ−３０３（ワイエムシイ社製；４．
６×２５０ｍｍ）を用い、３５％（ｖ／ｖ）アセトニト
リル、１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、ＵＶ２１３ｎｍで
検出した。

【００２４】実施例２ グルコシルエステル分解酵素の精製 グルコシルエステル分解活性を示す菌株、クラビバクタ
ー・ミシガネンセＣ２９３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１３
１）からグルコシルエステル結合の分解を示す酵素の精
製を行った。ペプトン、酵母エキス、無機塩類などを含
む培地（表２）で培養（２７℃、２日間）後、菌体をフ
レンチプレスで粉砕した。この無細胞抽出液を出発原料
として、ストマイ処理、硫安分画、Ｑ−セファロース、
セファクリルＳ−１００およびエーテルセファロースの
各クロマトグラフィーを行い、ネイティブポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よび焦点電気泳動など各種電気泳動で単一の蛋白バンド
を示す精製酵素標品を得た。なお、各操作段階での酵素
活性の測定は、基質としてレバウディオシドＡを用い、
前述のグリコシルエステル分解活性測定法に従って行っ
た。

【００２５】

【表２】

【００２６】ステップ１；ストマイ処理（除核酸） フラスコ培養した菌体をフレンチプレスで破壊して調製
した無細胞抽出液に、２０％のストレプトマイシン溶液
を最終濃度１．５％になるまで加え、沈殿物を遠心分離
によって除去した後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で透析を行った（Ａ液）。 ステップ２；硫安塩析 Ａの溶液に固形硫安を３５％飽和となるまで加え、１６
時間経過してから沈殿物を遠心分離によって除去した。
この上清に固形硫安を５０％飽和となるまで加え、１６
時間経過してから沈殿物を遠心分離によって回収した。
この沈殿物を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０
ｍｌに溶解し、同緩衝液に対して透析を行った（Ｂ
液）。

【００２７】ステップ３；Ｑ−セファロースカラムクロ
マトグラフィー（イオン交換処理） ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−
セファロースＦＦ（ファルマシア製、２．５×１８ｃ
ｍ）にＢの溶液をかけた。０〜１．０ＭのＮａＣｌ（５
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））の直線系濃度勾配
によって酵素を溶出した（流速２８ｍｌ／ｈｒ）。溶出
液は７．８ｍｌずつ分画し、各フラクションのグルコシ
ルエステル分解活性をレバウディオシドＡを基質として
測定した。活性画分を合わせて透析チューブに入れ、粉
末ポリエチレングリコール（＃２０００）をチューブ外
壁に付着させることによって活性画分中の水分を吸水さ
せることによって濃縮を行った（Ｃ液）。 ステップ４；セファクリルＳ−１００カラムクロマトグ
ラフィー（ゲルろ過処理） ０．１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化させたセファクリルＳ−１００ＨＲ
（ファルマシア製、１．６×１４０ｃｍ）にＣ液をかけ
て酵素を溶出した（流速８．２ｍｌ／ｈｒ）。溶出液は
４．１ｍｌずつ分画し、ステップ３と同様に各フラクシ
ョンの活性を測定して活性画分を回収した（Ｄ液）。

【００２８】ステップ５；エーテルセファロースカラム
クロマトグラフィー（疎水クロマト処理） Ｄ液に１．０Ｍになるように固形の硫安を加えた。１．
０Ｍの硫安を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
で平衡化させたエーテルトヨパール６５０Ｍ（東ソー
製、１．５×１４ｃｍ）に１．０Ｍの硫安を含むＤ液を
かけた。１．０〜０Ｍの硫安（５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０））の直線濃度勾配によって酵素を溶出し
た（流速１５ｍｌ／ｈｒ）。溶出液は３．０ｍｌずつ分
画し、ステップ３と同様に各フラクションの活性を測定
して活性画分を回収した。活性画分を５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、ステップ３における
と同様な手法によりポリエチレングリコール（＃２００
０）によって濃縮を行った。

【００２９】実施例３ 精製酵素のグルコシルエステル分解活性 実施例２として示したグルコシルエステル分解酵素の精
製標品のグルコシルエステル結合の分解について調べ
た。 （薄層クロマトグラフィー）ルブソシド、ステビオシ
ド、レバウディオシドＡなどのグルコシルエステル結合
を有するステビオール配糖体の溶液（１０ｍＭ）に本精
製酵素を加え、４０℃で１時間反応させた。反応液２．
５μｌを薄層クロマトグラフィーで分析した。薄層クロ
マトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０プレコー
トプレート（蛍光指示薬不含、メルク社製）を用い、ク
ロロホルム：メタノール：水＝１０：５：０．５（ｖ／
ｖ）の溶媒系で、上昇法によって行った。検出は、プレ
ートに硫酸：メタノール＝１：１（ｖ／ｖ）を噴霧した
後、プレートを１１０℃に５分保ち、検出されるスポッ
トの位置を標品のそれと比較することによって行った。
上記薄層クロマトグラフィーの結果、ルブソシドではグ
ルコシルエステル結合が分解されてステビオールモノシ
ドが最終生成物として蓄積した。またステビオシド、レ
バウディオシドＡでは１９位のグルコシルエステル結合
以外に１３位の糖残基間の結合も分解され、最終生成物
としてステビオールモノシドが蓄積した。なお、ルブソ
シド、ステビオシドおよびレバウディオシドＡのいずれ
の場合も、アグリコンであるステビオール骨格とグルコ
ースとの間のエーテル結合は分解されなかった。

【００３０】（ＨＰＬＣ）１０ｍＭのルブソシド溶液に
本精製酵素を加え、４０℃で経時的に反応させた。反応
液１０μｌをＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣは、ＯＤＳ
系のカラム ＹＭＣ−ｐａｃ ＡＱ−３０３（ワイエム
シイ社製；４．６×２５０ｍｍ）を用い、３５％（ｖ／
ｖ）アセトニトリル（ｐＨ２．０）、１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎで溶出し、ＵＶ２１３ｎｍで検出した。ＨＰＬＣの結
果、ルブソシドの経時的な減少に伴い、ルブソシドのグ
ルコシルエステル結合が分解されたときに生じるステビ
オールモノシドの経時的な増加が認められた。

【００３１】（構造解析）反応生成物の分取は、分取用
のＯＤＳ系のカラム（２１．５×３００ｍｍ）を用い、
３５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（ｐＨ２．０）、１．
０ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、ＵＶ２１３ｎｍで検出して行
い、分取した反応生成物をＪＯＥＬ ＪＮＭ−ＥＸ２７
０ ｓｐｅｃｔｏｍｅｔｅｒを用いて構造解析（Ｃ−Ｎ
ＭＲ）を行った。ＨＰＬＣでルブソシドの分解を確認し
たが、ルブソシドのグルコースが外れた生成物は保持時
間でしか見ていない。そこで本当にグルコシルエステル
結合が切れたものができているか（エーテル結合が切れ
ていないか、骨格が壊れていないか）をＣ−ＮＭＲによ
る構造解析で確認した。

【００３２】実施例４ 精製酵素のグルコシルエステル分解活性 実施例２として示したグルコシルエステル分解酵素の精
製標品のグルコシルエステル結合およびグルコシルエー
テル結合の分解について調べた。すなわち、レバウディ
オシドＡ、レバウディオシドＢ、ステビオシド、ステビ
オールビオシド、ルブソシドまたはステビオールモノシ
ドを基質として、遊離してくるグルコースを経時的に測
定した。結果を図１に示す。図１から明らかなごとく、
ステビオール骨格にグルコシルエーテル結合のみを持つ
レバウディオシドＢ、ステビオールビオシドおよびステ
ビオールモノシドでは、グルコースは全くもしくはほと
んど遊離してこなかった。これに対して、ステビオール
骨格にグルコシルエステル結合とグルコシルエーテル結
合とを併せ持つレバウディオシドＡ、ステビオシドおよ
びルブソシドでは、グルコースが遊離してくると共に、
生成物はＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）によりグル
コシルエステル結合が加水分解されてカルボキシル基に
なった化合物であることが確認された。以上により本酵
素は、グルコシルエステル結合とグルコシルエーテル結
合とを併せ持つステビオール配糖体に作用させると、グ
ルコシルエステル結合をより特異的に加水分解する特徴
を有することが判明した。

【００３３】実施例５ 本酵素の酵素学的性質 実施例２で得た精製酵素標品の酵素学的性質を調べた。 （１）作用 上記実施例から明らかなごとく、ステビオシド、ルブソ
シドおよびレバウディオシドＡのグルコシルエステル結
合を加水分解する。上記のことから、本酵素は、グリコ
シルエステル、特にグルコシルエステルを加水分解する
ものと推定される。すなわち、例えばグルコシルエステ
ルに作用させると、等モルのグルコースまたはグルコー
スをアノマー末端構成糖とするオリゴ糖とアグリコンで
あるカルボン酸とを生成するものと推定される。本酵素
はさらにｐ−ニトロフェニル−β−グルコシドのエーテ
ル結合を可逆的に加水分解する。既述のごとく、この反
応性はβ−グルコシダーゼ活性の指標であり、この酵素
がβ−グルコシダーゼであることを示す。

【００３４】（２）分子量および等電点 ＳＤＳ電気泳動およびゲルろ過ＦＰＬＣによって分子量
を調べたところ、約６５，０００であった。ＳＤＳ電気
泳動はＬａｅｍｍｌｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏ
ｌ．２２７，ｐｐ．６８０（１９７０））に従って行っ
た。分子量マーカーにはホスホリラーゼＢ（分子量９
４，０００）、牛血清アルブミン（分子量６７，００
０）、オボアルブミン（分子量４３，０００）、炭酸脱
水酵素（分子量３０，０００）、トリプシンインヒビタ
ー（分子量２０，１００）およびα−ラクトアルブミン
（分子量１４，４００）を用いた。ゲルろ過ＦＰＬＣカ
ラムにはファルマシア社製のカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
２００ ＨＲ １０／３０）を用い、１００ｍＭのリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）を移動相として、０．５ｍｌ／
ｍｉｎの流速で実施した。分子量マーカーには、チログ
ロブリン（分子量６７０，０００）、γ−グロブリン
（分子量１５８，０００）、オボアルブミン（分子量４
４，０００）、ミオグロビン（分子量１７，０００）お
よびシアノコバラミン（分子量１，３５０）を含むバイ
オ・ラッド社製の分子量測定用キットを用いた。本酵素
の等電点はｐＨ４．６であった。等電点の測定には、バ
イオ・ラッド社製の等電点電気泳動用装置（モデル１１
１ミニ１ＥＦ）を用いて行い、両性担体はファルマシア
社製のアンフォライン（ｐＨ３．５〜１０）を用いた。

【００３５】（３）ｐＨおよび温度の影響 本酵素のｐＨに対する安定性は５℃において行った。種
々のｐＨの緩衝液中に酵素を１５時間置いた後、レバウ
ディオシドＡとｐ−ニトロフェニル−β−グルコシドを
基質としてグルコシルエステル分解活性を測定した。こ
の条件では、本酵素はｐＨ６〜１０の間で安定であった
（図２）。温度安定性を調べるために本酵素を、ｐＨ
７．０の５０ｍＭのリン酸緩衝液中で種々の温度に１０
分間保持した後、グルコシルエステル分解活性を測定し
たところ、４０℃以下で安定であり（図３）、４０〜５
０℃のときに最も活性が高かった（図４）。至適ｐＨを
決定するために種々のｐＨの５０ｍＭリン酸緩衝液中
で、４０℃における本酵素のグルコシルエステル分解活
性を測定したところ、ｐＨ７〜８において最も活性が高
かった（図５）。

【００３６】（４）金属および試薬の影響 本酵素に対する種々の金属および試薬の影響は以下のよ
うにして調べた。各金属イオンおよび試薬を最終濃度１
ｍＭになるように本酵素溶液に加え、４０℃で２時間イ
ンキュベートした後、残存活性を測定した（表３）。本
酵素は、Ｈｇやｐ−クロロメルクリ安息香酸によって酵
素活性が阻止されたが、それ以外の金属イオンや試薬で
は酵素活性に有意な影響はなかった。

【００３７】

【表３】

【００３８】（５）基質特異性 基質特異性は、β−グルコシダーゼ基質であるｐ−ニト
ロフェニル−β−グルコシド、フェニル β−グルコシ
ドおよびサリシン、β結合を有するソホロビオース、セ
ロビオース、ゲンチオビオースなどのグルコビオース、
ルブソシド、レバウディオシドＡ、ステビオールモノシ
ドなどのステビオール配糖体を基質として、これらの分
解活性について調べた（表４）。本酵素は、β−グルコ
シダーゼ基質のｐ−ニトロフェニル−β−グルコシドを
最も良く分解た。β結合を持ったグルコビオースでは、
ソホロビオースはごく僅かに、セロビオースは極々僅か
に分解されたが、ゲンチオビオースは全く分解されなか
った。ステビオール配糖体では、１３位のグルコース残
基間の結合よりも１９位のグルコシルエステル結合がよ
り特異的に分解された。すなわち、ルブソシドではグル
コシルエステル結合のみが分解されてステビオールモノ
シドが蓄積した。レバウディオシドＡでは１９位のグル
コシルエステル結合のみならず１３位の糖残基間の結合
も分解され、最終生成物としてステビオールモノシドが
蓄積したが、アグリコンであるステビオール骨格とグル
コースとの間のエーテル結合は分解されなかった。さら
にステビオールモノシドは分解されなかった。

【００３９】

【表４】

【００４０】

【発明の効果】本発明のグリコシルエステル分解酵素は
グリコシルエステル結合を分解する活性が非常に高く、
さらにはグルコシルエステル結合とグルコシルエーテル
結合とを併せ持つ化合物に作用させると、グルコシルエ
ステル結合をより特異的に加水分解する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で得られたグルコシルエステル分解酵素
のステビオール配糖体の分解作用を示す。

【図２】本発明で得られたグルコシルエステル分解酵素
のｐＨ安定性を示す。

【図３】本発明で得られたグルコシルエステル分解酵素
の温度安定性を示す。

【図４】本発明で得られたグルコシルエステル分解酵素
の至適温度を示す。

【図５】本発明で得られたグルコシルエステル分解酵素
の至適ｐＨを示す。

【符号の説明】

図１〜５において、基質として使用したＲｅｂＡ、Ｒｅ
ｂＢ、Ｓｔｅ、ＳｔｅＢ、Ｒｕｂ、ＳｔｅＭおよびｐＮ
ＰＧはそれぞれレバウディオシドＡ、レバウディオシド
Ｂ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ルブソシ
ド、ステビオールモノシドおよびｐ−ニトロフェニル−
β−グルコシドを示す。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 β−グルコシダーゼ活性を併せ持つグリ
   コシルエステル分解酵素。
2. 【請求項２】 グリコシルエステルがグルコシルエステ
   ルである請求項１記載のグリコシルエステル分解酵素。
3. 【請求項３】 グルコシルエステル結合とグルコシルエ
   ーテル結合とを併せ持つ化合物に作用させると、グルコ
   シルエステル結合をより特異的に加水分解する請求項１
   または２記載のグリコシルエステル分解酵素。
4. 【請求項４】 グルコシルエステル結合とグルコシルエ
   ーテル結合とを併せ持つ化合物が、ステビオール配糖体
   である請求項３記載のグリコシルエステル分解酵素。
5. 【請求項５】 下記の酵素学的性質を有する請求項１な
   いし４のいずれかに記載のグリコシルエステル分解酵
   素： （１）作用 β−グルコシダーゼ活性を示し、グルコシルエステルを
   加水分解する。すなわち、ｐ−ニトロフェニル−β−グ
   ルコシドのエーテル結合を加水分解すると等モルのｐ−
   ニトロフェノールとグルコースとを生成すると共に、グ
   ルコシルエステルに作用させると、等モルのグルコース
   またはグルコースをアノマー末端構成糖とするオリゴ糖
   とアグリコンであるカルボン酸とを生成する。 （２）基質特異性 ｐ−ニトロフェニル−β−グルコシド、ルブソシド、ス
   テビオシドおよびレバウディオシドＡには作用するが、
   ステビオールモノシドおよびゲンチオビオースには作用
   しない。 （３）至適ｐＨ ７〜８ （４）ｐＨ安定性 ｐＨ６〜１０で安定 （５）至適温度 ４０〜４５℃ （６）温度安定性 ４０℃以下で安定 （７）分子量 ＳＤＳ電気泳動およびゲルろ過ＦＰＬＣにより測定した
   値は共に約６５，０００。
6. 【請求項６】 下記の酵素学的性質を有する請求項１な
   いし４のいずれかに記載のグリコシルエステル分解酵
   素： （１）作用 β−グルコシダーゼ活性を示し、グルコシルエステルを
   加水分解する。すなわち、ｐ−ニトロフェニル−β−グ
   ルコシドのエーテル結合を加水分解すると等モルのｐ−
   ニトロフェノールとグルコースとを生成すると共に、グ
   ルコシルエステルに作用させると、等モルのグルコース
   またはグルコースをアノマー末端構成糖とするオリゴ糖
   とアグリコンであるカルボン酸とを生成する。 （２）基質特異性 ｐ−ニトロフェニル−β−グルコシド、ルブソシド、ス
   テビオシドおよびレバウディオシドＡには作用するが、
   ステビオールモノシドおよびゲンチオビオースには作用
   しない。 （３）至適ｐＨ ７〜８ （４）ｐＨ安定性 ｐＨ６〜１０で安定 （５）至適温度 ４０〜４５℃ （６）温度安定性 ４０℃以下で安定 （７）分子量 ＳＤＳ電気泳動およびゲルろ過ＦＰＬＣにより測定した
   値は共に約６５，０００。 （８）等電点 ｐＨ４．６ （９）阻害剤 Ｈｇおよびｐ−クロロメルクリ安息香酸
   により活性が著しく阻害される。
7. 【請求項７】 クラビバクター属細菌によって生産され
   る請求項１ないし６のいずれかに記載のグリコシルエス
   テル分解酵素。
8. 【請求項８】 請求項１ないし６のいずれかに記載のグ
   リコシルエステル分解酵素を生産する能力を有するクラ
   ビバクター属細菌を栄養培地に培養し、培養物から生成
   した該グリコシルエステル分解酵素を採取することを特
   徴とする該グリコシルエステル分解酵素の生産方法。