JPS6312300A - ジンセノサイド−Ｒｄの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は人参サポニンのひとつであるジンセノサイド−
Ｒｄの工業的に有利な製造方法に関する。

従来の技術 近年、オタネニンジン（Ｐａｎａｘ　ｇｉｎｓｅｎｇ　
Ｃ，Ａ、Ｍｅｙｅｒ）などの薬用人参に含まれる成分の
研究が盛んに行なわれ、薬用人参の有効成分として各種
の人参サポニンが単離されている。これらの人参サポニ
ンのうちノンセッサイド−ｎｄ（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄ
ｅ　−Ｒｄ）　（以下化合物（１）と略称することらあ
る）およびジンセノサイド−Ｒｈ＋（ｇｉｎｓｅｎｏｓ
ｉｄｅ−Ｒｈ＋Ｘ以下化合物（Ｉｔ）と略称することも
ある）は薬用人参中の主要な有効成分に属するが、それ
らの薬理作用は解叫、されつつあり、ともに鎮痛、鎮静
作用、循環器及び代謝改善作用その他多くの有用な薬理
作用を持つことがわかってきた。ジンセノサイド−Ｒｄ
とジンセノサイド−Ｒｂ１とを比較するとこれらの薬理
作用の薬理活性はジンセノサイド−ｆｌｄの方がジンセ
ノサイド−Ｒｂ１よりも強いことが示されている。とこ
ろがオタネニンジン中のジンセノサイドーＲｄの含量は
非常に少く、しかもオタネニンジンは極めて高価であり
、オタネニンジンを抽出してジンセノサイド−Ｒｄを製
造する方法は工業的に全く不利である。したがって工業
的有利にジンセノサイド−Ｒｄを得る方法の開発が望ま
れていた。

一方、アマチャヅル（Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ　ｐｅｎｔ
ａｐｈｙｌｌｕｍＭａｋｉｎｏ）はアジア−帯に自生す
る蔓性多年生植物である。アマチャヅルからはジペノサ
イド類（ギノザボニン類）とよばれる各種のサポニンが
単離されているが、最近、前記のジンセノサイド−Ｒｄ
がジンセノサイド−Ｒｈ、とともにアマチャヅルから単
離された［薬学雑誌、第１０３巻、１７３頁（１９８３
年）：特開昭５６−１２７３９９］。しかしアマチャヅ
ル中のノンセッサイド−Ｒｄの含量は極めて少なく、ア
マチャヅルの主サポニンはジペノサイド■（ｇｙｐｅｎ
ｏｓｉｄｅ　Ｖ、）（以下化合物（Ｉ［Ｉ）と略称する
こともある）である。

発明が解決しようとする問題点 ジンセノサイド−Ｒｄ、　　ジンセノサイド−Ｒｂ１お
よびジペノサイド■の化学名・構造式は次のとおりであ
る。

１１υ Ｒ化学名 ジンセノ　　　　Ｈ２０（Ｓ）−ブロトパナキサジオー
サイドーＲｄ　　　　　　　　　　　　ルー３−０−［
β−Ｄ−グルコピラノ（化合物（Ｉ））　　　　　　　
　　シル（１−２）−β−Ｄ−グルコピラノサイド］−
２０−０−β−Ｄ−グルコピラノサイド ジンセノ　　　　　β−Ｄ−グルコ　　２０　（Ｓ）−
プロトパナキサジオーサイド−Ｒｂ、　　　　ピラノシ
ル　　ルー３−０−［β−Ｄ−グルコピラノ（化合物（
■））　　　　　　　　　　シル（１−２）−β−Ｄ−
グルコピラノサイド］−２０−０−［β−Ｄ−グルコピ
ラノシル（ｌ→６）−β−Ｄ−グ ノペノサ　　　　α−Ｌ−ラムノ　　２０（Ｓ）−ブロ
トパナキサジオーイド■　　　　　　ピラノシル　　ル
ー３−０−　［β−〇−グルコピラノ（化合物（■））
　　　　　　　　　　シル（１−２）−β−Ｄ−グルコ
ピラノサイド］−２０−０−［α−Ｌ−ラムノピラノシ
ル（ｌ→６）−β−Ｄ−グ 上記の構造式から明らかなように本発明の目的化合物で
あるノンセッサイド−Ｒｄは、ジンセノサイド−Ｒｈ　
＋　、ジペノサイド■と互いに非常によく似た構造を有
していて、ジンセノサイド−Ｒｂ１またはノペノサイド
■からノンセッサイド−Ｒｄへと化学的に誘導すること
は可能と考えられた。即ち上記構造式のＲ−０結合すな
わちノンセッサイド−Ｉｔ　ｂ　ｔの２０位のゲンチオ
ビオシル部分の末端β−Ｄ−グルコサイド結合またはジ
ペノサイド■の２０位のルチノシル部分のα−Ｌ−ラム
ノサイド結合を選択的に切断すればジンセノサイド−Ｒ
ｄが得られると考えられた。ところがジンセノサイド−
Ｒｂ、およびジペノサイド■にはこのＲ−０結合部分以
外にも加水分解を受けうる部分、即ちグルコサイド結合
部分が各々３ケ所あり、このＲ−０部分のみを選択的に
加水分解することが課題であった。通常の条件下で酸加
水分解をジンセノサイド−Ｒｂｌまたはジペノサイド■
に対して行なっても目的とするジンセノサイド−Ｒｄは
全く得られなかった。

本発明者らは酸加水分解よりも選択性のより高い酵素的
加水分解法に着目して種々検討したところ、ある種の酵
素を使用し、特定のｐｕおよび特定の温度を選んで反応
を行うことにより、ジンセノサイド−Ｒｈ　＋またはジ
ペノサイド■を効率よく、目的とするノンセッサイド−
１’ｔｄに誘導することに成功して本発明を完成した。

問」点を解決するための手段 本発明はジペノサイドＶおよび／またはジンセノサイド
−Ｒｂ、にラムノシダーゼおよび／またはグルコシダー
ゼを作用させることを特徴とするジンセノサイド−Ｒｄ
の製造方法に関するものである。

本発明方法によれば、ジンセノサイド−Ｒｄはジペノサ
イド■にラムノシダーゼを作用させるか又はジンセノサ
イド−Ｒｈ、にグルコシダーゼを作用させることによっ
て製造される。

本発明で用いられる原料（基質）のジペノサイドＶ、ジ
ンセノサイド−Ｒｂ、はそれぞれ単離されたものでもよ
いし、またそれらの混合物であってもよい。工業的には
ジペノサイド■、ジンセノサイド−Ｒｈ、およびジンセ
ノサイド−Ｒｄを含むアマチャヅル抽出物、もしくはジ
ンセノサイド−Ｒｂ。

およびジンセノサイド−Ｒｄを含むオタネニンジン抽出
物をそのまま原料（基質）とするのが有利であるが、前
記したようにオタネニンジンが高価であるのに対してア
マチャヅルは安価に入手できることから、アマチャヅル
抽出物を原料（基質）とするのが最も有利である。本発
明方法によればジペノサイドＶおよび／またはジンセノ
サイド−Ｒｈ。

はジンセノサイド−Ｒｄに変換されるが、出発物質中に
含まれるジンセノサイド−Ｒｄは何ら変化しない。アマ
チャヅル抽出物もしくはオクネニンジン抽出物を原料（
基質）として用い、本発明方法の酵素的加水分解反応を
行うとジンセノサイド−ｎｄに富んだエキスが得られ、
これをたとえばクロマトグラフィー、結晶化、再結晶な
どの通常の分離、精製手段に付すことにより容易にジン
セノサイド−Ｒｄが単品として得られる。本発明方法に
よればアマチャヅル抽出物もしくはオタネニンノン抽出
物からジンセノサイド−Ｒｄを抽出１分離。

精製する従来の方法よりもはるかに容易に、しかも多量
のジンセノサイド−Ｒｄを単離することができる。

本発明に用いられる酵素はラムノシダーゼおよび／また
はグルコシダーゼである。これらの酵素はジペノサイド
■のラムノサイド結合および／またはジンセノサイド−
Ｒｂ、のグルコサイド結合を切るものであって、具体的
にはラムノシダーゼはジペノサイド■の２０位のルチノ
シル部分のα−し一ラムノサイド結合を切断し、グルコ
シダーゼはジンセノサイド−Ｒｈ、の２θ位のゲンチオ
ビオシル部分の末端β−Ｄ−グルコサイド結合を切断す
るための酵素である。したがって本発明に用いられるラ
ムノシダーゼはジペノサイド■に活性のあるラムノシダ
ーゼであればどのようなラムノシダーゼでも利用できる
。また本発明に用いられるグルコシダーゼはジンセノサ
イド−Ｒｂ１に活性のあるグルコシダーゼであればどの
ようなグルコシダーゼをも使用することができる。両酵
素はそれぞれ精製された単一の酵素を用いてもよいし、
また両酵素を混合したものでもよい。基質がジペノザイ
ド■またはアマチャヅル抽出物の場合はラムノシダーゼ
もしくは両酵素（ラムノシダーゼ及びグルコシダーゼ）
の混合したものを、基質がジンセノサイド−Ｒｈ、また
はオタネニンジン抽出物の場合はグルコシダーゼもしく
は両酵素の混合したものを使用する。しかしながら精製
された単一の酵素を得るには一般に多大の労力と費用を
要する。

本発明においては粗製の酵素すなわち粗酵素であっても
、本発明の目的にかなった活性を汀するラムノシダーゼ
および／またはグルコシダーゼを含んでいるものであれ
ば使用可能である。さらには、本発明の目的にかなった
活性を有するラムノシダーゼおよび／またはグルコシダ
ーゼを含む菌体培養液を使用してもよい。本発明の方法
によるジンセノサイド−Ｒｄの製造方法においては、基
質としてアマチャヅル抽出物を、酵素として粗酵素らし
くは菌体培養液を使用するのが工業的見地から最も有利
である。本発明の酵素的加水分解反応は通常１）ＩＩ約
４ないし７．温度約４０ないし６５℃で行なわれるが、
より好ましいｐｌｌおよびより好ましい温度は後記する
ように基質と酵素の組み合せによる。

本発明の目的にかなう粗酵素としては市販の粗酵素が便
宜に用いられる。市販の粗酵素としてはたとえば「可溶
性へスベリジナーゼ」（田辺製薬社製）があげられる。

この可溶性へスペリノナーゼはりペノサイド■に対して
活性なラムノシダーゼのほかにグルコシダーゼをも含む
粗酵素であるが、たとえばジペノサイド■またはアマチ
ャヅル抽出物の水溶液に可溶性へスペリジナーゼを加え
好ましくは緩衝液中、り１１６．８ないし７．温度５０
ないし６０℃に維持すると高収率でジンセノサイド−Ｒ
ｄが産生ずる。緩衝液としては公知の７タル酸緩衝液、
リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などが用いられる。「可溶性
へスペリジナーゼ」は本発明においてジペノサイド■を
ノンセッサイド−Ｒｄに変換するのに特に適した酵素で
ある。

本発明の目的にかなう菌体培養液は、微生物のうちとり
わけ真菌類（例、かび類、酵母）をＬ−ラムノースまた
はα−Ｌ−ラムノサイド結合を含む物質を炭素源とする
培地で以下に述べるように培養し、ついでジペノサイド
■および／またはジンセノサイド−Ｒｂ、をジンセノサ
イド−Ｒｄに収率良く変換しうる真菌類を選抜すること
により得られる。この菌体培＃液中にはグルコシダーゼ
のほか、ジペノサイドＶに対して活性なラムノシダーゼ
が蓄積されており、この菌体培養液をそのまま酵素源と
して利用して、ジペノサイドＶおよび／またはジンセノ
サイド−Ｒｈ、をジンセノサイド−Ｒｄに変換すること
ができる。このような菌体培養液にジペノサイド■また
はアマチャヅル抽出物を加え、ｌ）Ｉ＋約４ないし７．
ＩＡ度約４０ないし６５℃、好ましくはｐｉ約５ないし
７．温度約４０ないし５５℃に保つと高収率でジンセノ
サイド−Ｒｄが生成する。また該菌体培養液にジンセノ
サイド−Ｒｂ１またはオタネニンジン抽出物を加え、ｐ
ｉｆ約４ないし７．温度約４０ないし６５℃、好ましく
はｐｌ約４ないし６．温度約４０ないし５５℃に保つと
高収率でジンセノサイド−Ｒｄが生成する。

α−Ｌ−ラムノサイド結合を含む物質としてはラムノシ
ル基を含む貧糖類（２〜４糖類）もしくはラムノシル基
を含む配糖体が用いられ、前者としてはルナノース。ネ
オヘスペリドースなどが、後者としてはヘスベリジン、
ルチン、ナリンジンなどが例示される。

本発明の目的にかなう菌体培養液を得るための真菌類の
培養においては、Ｌ−ラムノースまたはα−Ｌ−ラムノ
サイド結合を含む物質を炭素源として約０　、１〜ｌ　
Ｏｍｇ／ｍｌ好ましくは約０．５〜３ｍｇ／ｍｌを含有
する以外に、本発明の目的にかなう菌体培ａｅＬが得ら
れる範囲で通常微生物の培養に用いられる窒素源、無機
塩類等を含有した液体培地が用いられる。このような窒
素源としては例えばペプトン、尿素、硫安、塩安、硝安
等の有機物および無機物が適宜必要に応じて単独もしく
は組合せて用いられる。またカリウム、ナトリウム。

マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、マンガン。

コバルト、銅、燐酸等の塩類が無機塩類として適宜使用
される。これら窒素源、無機塩類の添加濃度は、本発明
の目的にかなう菌体培養液が得られる限り特に限定され
るものではなく、通常の発酵法で用いられる添加ａ度範
囲より適宜遣損されろ。

培捏は通常振盪または通気攪拌等の好気的条件下に行う
のがよく、培養温度は通常約２０〜４０℃が好んで用い
られる。培養中のｐＨは通常約５．０〜７．５、好まし
くは約５．５〜６．０に維持するのがよい。この際１）
Ｈの調整はたとえば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリ
ウムなど好ましくはそれらの水溶液（約５〜４０重量％
、好ましくは約３０〜４０重量％の水溶液）あるいは緩
衝液を加えて行うと良い結果を与える。

以上の様な条件下で通常約２日からｌＯ日日間ましくは
約４日から７日間培養し、得られる培養液より本発明の
目的にかなう菌体培養液を選抜する。この選抜は、ジペ
ノサイド■および／またはジンセノサイド−Ｒｈ　＋の
ジンセノサイド−Ｒｄへの変換率の良いものを標準とし
行うことができる。

たとえば、まず上記の方法で得られる培養夜釣２ｍｌに
ｐｌ−Ｉ４．ｏ　〜８．０のリン酸緩衝液などを１〜１
０ｍ１好ましくは３〜５ｍｌを加える。次にノペノサイ
ド■またはジンセノサイド−Ｒｈ、をアルコール類（た
とえばメタノール、エタノール、プロパツール、イソプ
ロパツール、ブタノールなどの炭素数１〜４のアルコー
ル類）１〜ｌに１０〜３０ｍｇ好ましくけ約２０ｍｇを
溶かした溶液を０．０５〜０．２＋ｎｌ好ましくは約０
．１ｍｌ加えろ。そして３０〜８０℃で１０〜３０時間
好ましくは１５〜２０時間維持し、ジペノサイド■また
はジンセノサイド−Ｒｈ、の残存量が少なくジンセノサ
イド−Ｒｄの蓄積量の多いものを、本発明の目的にかな
う菌体培養液として選抜する。化合物（［）、（ＩＩ）
、（Ｉ）の培養液中の量は、たとえば高速液体クロマト
グラフィーなどにより測定することができる。なお、上
記の選抜に漏れた培養液の菌を用いて、上記した培養、
選抜を１回以上繰り返すことによって、ジペノサイド■
および／またはジンセノサイド−Ｒｂ、をジンセノサイ
ド−Ｒｄに高収率で変換しうる菌体培養液を得ることも
できる。

具体的にはジペノサイド■および／またはジンセノサイ
ド−Ｒｈ、をノンセッサイド−Ｒｄに変換しうる菌体培
養液はたとえば以下の手順により探索、調達される。

（１）硫酸アンモニウム６．０ｇ、硫酸マグネシウム・
７水和物１．０ｇリン酸２水素カリウム２．０ｇ、酵母
エキス１．ｏｇを水２．０Ｑに溶解した培地（以下、基
本培地という）に炭素源としてＬ−ラムノースまたは上
記のようなα−１４−ラムノサイド結合を含む物質を１
ｍｇ／ｍｌとなるように加え、最後にｐｉ約５．７にし
て培養液を用意する。

（２）培養液に被検菌を植えつけ、２８℃で１週間。

！ｌａ盪培養する。

（３）培養液を綿栓ろ過したのち、ろ液を２ｍｌずつ４
本の試験管に分注したのち、２本ずつに分け、各群にそ
れぞれｐＨ７、ｏまｒこはｐｕｓ、ｏのリン酸緩衝液３
ｍｌを加え、ジペノサイド■のメタノール溶液（１０ｍ
ｇ／ｍ１）Ｏ，１ｍｌを添加し、ｐｌ＋７．０と５．０
の緩衝液を加えた試験管１本ずつを、６０℃に１８時間
維持する。また残りの２本の試験管は３５℃て同様に反
応させる。

（４）ジペノサイド■をノンセッサイドーＲｈ、に置き
かえて、（３）項の手順を行なう。

（５）　（３）および（４）項の反応液を高速液体クロ
マトグラフィーに付し、ジペノサイド■またはジンセノ
サイド−Ｒｈ　＋の残存量が少なく、かつ望ましくはジ
ンセノサイド−Ｒｄの蓄積量の多い菌（菌体培養液）を
選抜する。

（６）　（５）項で成績不良の菌については、新しい培
養液に植えつぎさらに１週間振盪培養を行なったのち、
（３）〜（５）項の手順を繰り返す。

（７）　（６）項までの操作を施してもなお成績不良の
菌についてはさらに１週間ずつ３回にわたって植えつぎ
を行ない、各回毎に選抜を行なう。

（８）選抜された菌は上記（１）の液体培地７ｍｌに約
１％の寒天を加えた固体培地に植えつけ、２０〜３５℃
好ましくは約３０℃で７日間培養したのち、約５℃の冷
所に保存する。

次に、保存菌株を再び上記（１）の液体培地を用いて上
記（２）の条件で１週間培養したのち、得られる本発明
の目的にかなう菌体培養液を綿栓ろ過し、そのろ液を試
験管に分注して、最適反応条件を検討する。すなわちろ
液２ｍｌにジペノサイドＶまたはノンセッサイド−Ｒｂ
、のメタノール溶液（濃度：１０ｍｇ／ｍ１）Ｏ，１ｍ
ｌを加え、さらにｐＨ４，０，５，０゜６．０または７
．０のリン酸緩衝液３ｍｌを添加してから、３５℃、４
５℃、５０℃、５５℃または６０℃に１８時間維持した
のち、反応液を高速液体クロマトグラフィーに付しジペ
ノサイド■またはジンセノサイド−Ｒｂｌが最も効率良
く加水分解され、かつジンセノサイド−Ｒｄの蓄積量の
多い条件を設定する。

以上の手順によって、選抜された菌から得た菌体培養液
を用い、ｐＨおよび温度を調整することによりジペノサ
イド■またはジンセノサイド−Ｒｂ。

から容易にジンセノサイド−Ｒｄを製造することができ
るし、また、アマヂャヅル抽出物またはオタネニンジン
抽出物からジンセノサイド−Ｒｄに富んだエキスが得ら
れる。

本発明に用いられる上記の菌体培養液を与えるに適した
真菌類としてはたとえば、クリプトコツカス　アルビダ
ス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌｂｉｄｕｓ）（Ｉ
　Ｆｏ　　０３７８）、クリプトコツカス　ラウレンテ
ィー（旺１ａｕｒｅｎｔｉｉ）（Ｉ　Ｆ　ＯＯ６０９）
／Ｓンセヌラ　ムノコラ（ｌｌａｎｓｅｎｕｌａ　ｍｕ
ｓｉｃｏｌａ）（Ｉ　Ｆ　Ｏ１３８３）、アスペルギル
ス　アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ
Ｘ　［Ｐ　Ｏ４０３３）、アスベルギルスカーボナリウ
ス（Ａ、ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓＸ　Ｉ　ＦＯ４０３８
）、アスペルギルス　ニガー　バリエータス　フアーメ
ンタリウス（Ａ、ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｒｉｕｓ）（ＩＰｏ　　４０６Ｂ）、アスペルギル
ス　オーレウスパリエータス　ミノ−（Ａ、ａｕｒｅｕ
ｓ　ｖａｒ、ｍ１ｎｏｒ）（ＩＦ０４１１８’）などが
あげられるが、前記したように、本発明の目的にかなっ
た活性を有するラムノシダーゼおよび／またはグルコシ
ダーゼを含む菌体培養液を与えつる菌であればいかなる
菌でもよい。とりわけ、クリプトコツカス（Ｃｒｙｐｔ
ｏｃｏｃ９互）またはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
）またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属
に属する菌を培養して、培地にラムノシダーゼおよび／
またはグルコシダーゼを生成蓄積せしめた菌体培養液が
本発明で繁用されてもよい。

上ε己　ＩＦＯ０３７８，ＩＦＯ０６０９，１１；’０
　１３８３．ＩＦＯ４０３３，ＩＦＯ４０３８、ＩＦＯ
４０６８，ＩＰｏ　　４１１８株は財団法人発酵研究所
に寄託され、該発酵研究所発行のリスト・オブ・カルチ
ャーズ第７版　１９８４年（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　　ｆ
ｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、０ｓａｋａ、Ｌｉ５
ｔ　　ｏｒ　　Ｃｕｔｔｕｒｅｓ、１９８／、５ｅｖｅ
ｎｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）に掲載されている。

作用および効果 本発明方法により鎮痛、鎮静作用、循環器及び代謝改善
作用その他多くの有用な薬理作用を持つノンセッサイド
−１’ｔｄを従来方法よりも容易に高収率、高純度でか
つ安価に製造することができる。

実施例 以下の実施例によって本発明をより具体的に説明するが
、本発明はこれらの実施例によって制限されるものでは
ない。

実施例１ ジベノサイドＶ　　２ｍｇおよび「可溶性へスペリジナ
ーゼ」（田辺製薬社製）５０ｍｇを０．０２５Ｍリン酸
緩衝′？＆５ｍｌに加え、第１表に表示したｐＩＩおよ
び温度に調節して１８時間維持したのち、その５μ２を
高速液体クロマトグラフィー“に付し、原料とジンセノ
サイド−ｎｄの含量を測定した結果を第１表に示した。

（表１中の％は理論値に対する比率を示す。下記表２〜
９においても同じ） またジペノサイドＶのかわりにジンセノサイド−ｎｂ、
を基質にして同様の操作を行なった場合の結果を第２表
に示した。

第１表 第２表 １高速液体クロマトグラフィーの条件（以下の実施例に
おいても同じ） 固定相、　ＴＳＫゲル０ＤＳ−１’２０Ｔ（東洋ソーダ
製、φ４．６ｘ　２５０ｍｍ） 移動相；アセトニトリル−水（３６＋６４．ｖ／ｖ）、
流速１．２ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２０３ｎｍ、保持時
間ジンセノサイド−Ｒｂ、約８．５分、ジペノサイド■
約１５．５分、ジンセノサイド−Ｒｄ約２１．３分。

実施例２ ジペノサイドＶ　　−７，１２ｇ、　　ジンセノサイド
−１’（ｂ、　　１．２３ｇおよびジンセノサイド−Ｒ
ｄ　　Ｏ，８１ｇを含むアマチャヅル地上部の抽出物１
２３ｇを水１２に溶かし、実施例１で使用した「可溶性
へスペリジナーゼＪ　５００ｇを加え、さらに０．２Ｍ
リン酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ７，０に調整したの
ち２４時間６０℃に維持した。

反応液を７日間、２℃の冷所に静置して、１３．４ｇの
帯白色の沈澱物を得た。本沈澱物をリクロブレブ（Ｌｉ
Ｃｈｒｏｐｒｅｐ）　ＲＰ−８（商品名、メルク社製）
のカラムクロマトグラフィーに付し、６５％（Ｖ／Ｖ）
水性メタノールで溶出してジンセノサイド−Ｒｄ７．０
１ｇおよびジンセノサイド−ｆｌｂ、１．０３ｇを得た
。

なお、本実施例のアマチャヅル地上部の抽出物はアマチ
ャヅル地上部の乾燥物２ｋｇにメタノールＩＱＲを加え
て２時間加熱還流し、メタノール抽出液を１９まで減圧
濃縮した。ついで水２９と酢酸エチル２Ｑを加えて分配
し、その水層部を分けとって減圧濃縮・乾固することに
より得られたものを使用した。

実施例３ Ｌ−ラムノース１２００ｍｇを含む基本培地１２００ｍ
１を０．２Ｍリン酸緩衝液でｐＨ５，７に調整したのち
、アスベルギルスニガーバリエータスフアーメンタリウ
ス（Ｉ　Ｐｏ　　４０６　Ｂ）を植えつけ、２８℃で７
日間振盪培養した。菌体培養液を綿栓ろ過したろ液を４
ｍｌずつに分け、それぞれをリン酸緩衝液で第３表に表
示したｐＩＩに調整したのち、ジペノサイド■またはジ
ンセノサイド−Ｒｈ＋　４ｍｇを加え第３表に表示した
温度で１８時間反応させた。反応液を高速液体クロマト
グラフィーに付し、その結果を第３表に示した。

（以下余白） 実施例３の条件で調製したＩＦＯ４０６８の上記菌体培
養液を用いる場合、第３表の結果からジペノサイド■を
ジンセノサイド−Ｒｄに変換するにはｐＨを７程度にす
るかまたは温度を４０ないし４５℃程度にするのが最も
好ましいことがわかる。また、ジンセノサイド−Ｒｂ、
をジンセノサイド−Ｒｄに変換するにはｌ）Ｈを５程度
に温度を４５ないし５５℃程度にするのが最も好ましい
ことがわかる。

実施例４ ヘスベリジン６００ｍｇを含む基本培地６００ｍ１を０
．２Ｍリン酸緩衝液でｐＨ５，７に調整したのち、アス
ペルギルスカーボナリウス（ＩＦｏ　　４０３８）を植
えつけ２８℃で７日間１１ｉｆｆｉ培養した。菌体培養
液について以下実施例３と同様に処理しその結果を第４
表に示した。

実施例４の条件で調整したＩＦｏ　　４０３８の上記菌
体培養液を用いる場合、第４表の結果からジペノサイド
■をジンセノサイド−Ｒｄに変換するにはｐＨを７程度
に温度を４５ないし５５℃程度にするのが最も好ましい
ことがわかる。またジンセッサイド＝Ｒｈ　＋をノンセ
ッサイド−Ｒｄに変換するにはｐＨを５ないし６程度に
温度を５５ないし６０℃程度にするのが最も好ましいこ
とがわかる。

実施例５ ジペノサイドＶ　　１６７．７ｍｇ、ジンセノサイド−
Ｒｂｌ　　８０．９ｍｇおよびジンセノサイド−Ｒ６６
７，１ｍｇを含むアマチャヅル地上部の抽出物５．０ｇ
を水１５ＩＩｌｌに溶かし、さらに実施例３で得た菌体
培養液３５０ｍ１を加えたのち、０．２Ｍリン酸緩衝液
でｐＨ５，０に調整して反応液を作り、１３時間、４５
℃に維持したのち高速液体クロマトグラフィーで各サポ
ニン含量を測定した。反応液中のジンセノサイド−ｒ（
ｄは２２０４ｍｇ、またジンセノサイド−Ｒｂｌは１５
．８ｍｇで、ジペノサイド■は検出されなかった。

なお、本実施例のアマチャヅル地上部の抽出物はアマチ
ャヅル地上部の乾燥物１００ｇにメタノール５００ｍ１
を加えて２時間加熱還流しメタノール抽出液を５０ｍ１
まで威圧濃縮した。ついで水１００ｍ１と酢酸エチル１
００ｍ１を加えて分配し、その水層部を分けとって減圧
ａ縮、乾固することにより得られたものを使用した。

実施例６ 実施例５で基質として用いたのと同じアマチャヅル地上
部の抽出物を水１５ｍ１に溶かし、実施例４で得た菌体
培養液３５０ｍ１を用いてＩ）Ｒ７，Ｏ，反応温度５５
℃で実施例４と同様に反応を行なった。反応液中のジン
セノサイド−Ｒｄは２００．５ｍｇ、またジンセノサイ
ド−Ｒｂ、は６４　、８ｍｇであったがジペノサイド■
は検出されなかった。

実施例７ ノンセッサイドーＲｂ１　３０５ｍｇおよびノンセッサ
イド−ｒｉｄ　２５ｍｇを含む薬用人参の担サポニン分
画２ｇを水５０ｍ１に溶かし、実施例３で得た菌体培養
液３５０ｍ１を加えたのちｐｉｆ　５．０．反応温度５
０℃に維持した。１５時間後の反応液中のジンセノサイ
ド−Ｒｄは２９０．６ｍｇ、ジンセノサイド−Ｒｂ、は
６．３ｍｇであった。

なお、本実施例の粗サポニン分画は乾燥薬用人参２ｋｇ
にメタノール１０ｇを加え、２時間加熱還流し、メタノ
ール抽出液を１９．まで減圧濃縮した。

ついで水２Ｑおよびブタノール３Ｑを加え、ブタノール
可溶部を分けとり、減圧濃縮、乾燥（ｌｏｏｇ）するこ
とにより得られたものを使用した。

実施例８ ヘスベリジンｅｏｏｍｇを含む基本培地６００ｍ１をＩ
Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ５，７に調整したのち、クリ
プトコツカス　アルビダス（ＩＦｏ　　０３７８）を植
えつけ２８℃で７日間振盪培養した。菌体培養液につい
て以下実施例３と同様に処理しその結果を第５表に示し
た。

実施例８の条件で調整したＩＦＯ０３７８の上記菌体培
養液を用いる場合、第５表の結果からジペノサイド■を
ジンセノサイド−Ｒｄに変換するにはｐＨを７程度にす
るか、または温度を４０℃程度にするのが最も好ましい
ことがわかる。

第５表 実施例９ ヘスベリジン６０ｈ＋ｇを含む基本培地６００ｍ１をＩ
Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ５，７に調整したのち、クリ
プトコツカス　ラウレンティー（ＩＦｏ　　０６０９）
を植えつけ２８℃で７日間振盪培養した。

菌体培養液について以下実施例３と同様に処理し、その
結果を第６表に示した。

実施例９の条件で調整したＩＦｏ　　０６０９の上記菌
体培養液を用いる場合、第６表の結果からジペノサイド
Ｖをジンセノサイド−Ｒｄに変換するにはｐＨを７程度
にするか、または温度を４０℃程度にするのが最も好ま
しいことがわかる。

第６表 実施例１０ ヘスベリジン６００ｍｇを含む基本培地６０ｈ＋１をＩ
Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ５，７に調整したのち、クリ
プトコッカスラウレンティ−（ＩＰＯ０６０９）を植え
つけ２８℃で７日間振盪培養した。菌体培養液を綿栓ろ
過したのち、ジペノサイドＶ４．４５ｇ、ジンセノサイ
ド−Ｒｈ、　　２．０５ｇおよびジンセノサイド−Ｒｄ
　１．３２ｇを含むアマチャヅル地上部の抽出液１２０
ｍ１を加え、さらにＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨ７，０
に調整してから、４０℃で７５時間かくはんを続けた。

反応液をアンバーライトＸＡＤ−２（米国ローム　アン
ド　ハース社製）０．５Ｑを充填したカラムに通導し、
サポニンを吸着せしめた担体を水２Ｑ、ついで４０％（
Ｖ／Ｖ）メタノール２Ｑで洗浄したのち、６０％（Ｖ／
Ｖ）メタノール２ρで溶出した。溶出液を減圧下に濃縮
乾固し、黄褐色粉末１０ｇを得た。これを４５％（ｖ／
ｖ）メタノール５０ｍ１に溶解し、０ＤＳ−Ｑ３（和光
紬薬製）５００ｇを充填したカラムに通導し５５％（Ｖ
／Ｖ）メタノールｔＩ２で洗浄したのち、６２．５％（
ｖ／ｖ）メタノールで溶出し、ジンセノサイド−Ｒｄ　
３．１２ｇ（純度９４％）、ジンセノサイド−Ｒｈ、　
１．８５ｇ（純度９１％）およびジベノサイドＶ　２．
４１ｇ（純度９０％）を得た。

なお、本実施例のアマチャヅル地上部の抽出液は、アマ
チャヅル地上部の乾燥物２５０ｇにメタノール２Ｑを加
え１時間加熱還流しメタノール液を５０ｍ１まで減圧層
線した後、水７０ｍ１と酢酸エチル１００ｍ１を加えて
分配し、その水溶部を分けとったものである。

実施例１１ ルチン６００ｍｇを含む基本培地６００ｄを０．２Ｍリ
ン酸緩衝液でＩ）８５．７に調整したのち、アスペルギ
ルス　カーボナリウス（Ｉ　Ｆ’　０４０３８）を植え
つけ、２８℃で７日間振盪培養した。菌体培養液を実施
例３と同様に処理しその結果を第７−表及び第８表に示
した。

実施例１１の条件で調製したＩＦｏ　　４０３Ｂの上記
菌体培養液を用いる場合、第７表の結果からジペノサイ
ド■をジンセノサイド−Ｒｄに変換するにはｐＨ６〜７
程度に、温度を４０ないし６０℃程度にするのが最も好
ましいことがわかる。

また第８表の結果からジンセノサイド−Ｒｄ　＋をジン
セノサイド−Ｒｄに変換するにはｐＨを４ないし６程度
に温度を４０℃程度にするのが最も好ましいことがわか
る。

第７表。

実施例１２ Ｌ−ラムノース６００ｍｇを含む基本培地６０〇−を０
．２Ｍリン酸緩衝液でｐＨ５，７に調整したのち、ハン
セヌラ　ムシコラ（ＩＦｏ　　１３８３）を植えつけ２
８℃で７日間振盪培養した。菌体培養液について実施例
３と同様に処理しその結果を第９表に示した。

（以下余白） 実施例１２の条件で調製したＩＦＯ１３８３の上記菌体
培ｆ１ｍを用いる場合、第９表の結果からジペノサイド
■をジンセノサイド−Ｒｄに変換するにはｐＨを７程度
に温度を４０℃毘度にするのが最も好ましいことがわか
る。また、ジンセノサイド−Ｒｈ、をジンセノサイド−
Ｒｄに変換する場合もｐ）Ｉを７程度に温度を４０℃程
度にするのが最も好ましいことがわかる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ジペノサイドＶおよび／またはジンセノサイド−
   Ｒｂ＿１にラムノシダーゼおよび／またはグルコシダー
   ゼを作用させることを特徴とするジンセノサイド−Ｒｄ
   の製造方法
2. （２）アスペルギルス、ハンセヌラまたはクリプトコッ
   カス属に属し、ラムノシダーゼおよび／またはグルコシ
   ダーゼを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、
   培養物中にラムノシダーゼおよび／またはグルコシダー
   ゼを生成せしめる方法によりラムノシダーゼおよび／ま
   たはグルコシダーゼを製造することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の製造方法。
3. （３）ｐＨ約４ないし７、温度約４０ないし６５℃の条
   件下で反応させることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の製造方法。