JP2013529899A - ジンセノサイド成分を増加させた新規な加工人参または加工人参抽出物の製造方法 - Google Patents

ジンセノサイド成分を増加させた新規な加工人参または加工人参抽出物の製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】
加工人参または加工人参抽出物を製造する方法、詳しくは、ジンセノサイドの含有量を増加させた加工人参または加工人参抽出物を製造する方法を提供すること。
【解決手段】サポニン分解酵素を製造した後、サポニン分解酵素と有機酸による加水分解を用いて微量ジンセノサイド成分を増加させ新規な加工人参または加工人参抽出物を製造し、これから製造された加工人参または加工人参抽出物を含む抗癌補助剤組成物または薬学組成物を提供する。
【選択図】図1

Description

本発明は、サポニン分解酵素を製造した後、製造されたサポニン分解酵素と有機酸による加水分解を用いて、微量のジンセノサイド成分が増加した新規な加工人参または加工人参抽出物の製造方法、及び、これから製造された加工人参抽出物を含む抗癌補助剤組成物に関する。

人参は植物分類学上、五加皮科人参属に属する多年生宿根草であって、約11種があり、高麗人参(Panax Ginseng C. A. Meyer)が代表的に薬効が優れるものと知られている。人参は、水蔘、白蔘、紅参、山蔘、長腦蔘、尾蔘、元蔘などを全て含む最も広い概念である。人参は、中国などの漢方医学で非常に価値の高い医薬品として用いられてきた天産物素材であって、数多い医書に人参の薬効が収録されている。
しかしながら、実際に長い利用の歴史にもかかわらず臨床研究を通じた科学的な糾明は足りない状態である。それにもかかわらず、現代医学が紹介された今でも人参の人気が落ちることなく、健康機能食品のうちの不動の一位を占めていることは、長い間の臨床歴史が認める薬効を表し、副作用が少なく、安全度の高い生薬という理由であろう。
人参の主な機能性成分は植物界のさまざまなサポニンのうち、人参サポニンのみを特別に区分して命名したジンセノサイドと呼ばれる人参サポニンである。人参成分のうち、サポニンは、抗癌、抗アレルギー、抗炎症の他に、中枢抑制及び精神安定、鎮痛、記憶力改善、肝傷害保護、蛋白質及び脂質合成促進、抗糖尿、抗ストレス、抗酸化活性物質生成促進、免疫調節、血小板凝集抑制、抗老化作用などの薬理効能がある。

サポニンは置換基に結合された糖(glucose、arabinose、rhamnose)の種類と数によって多様なジンセノサイドに区分されるが、経口摂取後、生体消化酵素によりほとんど分解されず(非特許文献1)腸内細菌によって20(S)−O−β−プロトパナキサジオール20−O−β−D−グルコピラノシド、20(S)−プロトパナキサジオール、及び20(S)−プロトパナキサトリオールに分解された後、吸収される(非特許文献2)。
しかしながら、腸内微生物の構成は個人差が大きいので、サポニンの吸収は個人差によって変わることがある。

一方、現在知られたところによれば、人参の薬理効能を表す主成分であるジンセノサイドRb1、Rb2、及びRcなどのサポニンが知られている。
しかしながら、実質的に抗癌作用または癌細胞の転移を抑制、または抗アレルギー作用に関する成分は、人参が極少量含まれていているコンパウンドK(comp K)、ジンセノサイドRh1、Rh2、Rg3のサポニンであることと知られている。置換基にグルコースが一分子結合されたジンセノサイドRh2、コンパウンドKは、抗癌、抗アレルギー、抗炎症効果に優れると共に、糖鎖の結合が多くないで親水性が低いので腸内吸着及び吸収率に優れる。したがって、人参の抗癌作用、抗アレルギー作用及び免疫増強作用などのための使用のためには、上記人参に全く含まれていないとか、極少量含まれていているコンパウンドK、ジンセノサイドRh2、Rh1、Rg3などのサポニン成分の含有量を増加させて使用することが好ましい。

最近、人参に全く含まれていていないとか、極少量含まれていている人参有効性分(ジンセノサイド)の含有量の増加と体内吸収の容易性のために、微生物を用いて人参を発酵する方法、人参に酵素を処理する方法、または人参を酸加水分解する方法などが試みられている。
例えば、硫酸または塩酸を用いて吸収されやすい酸糖化人参を作る方法(特許文献1)、超高圧を用いた人参の有効性分を増大させ、紅参の特異的なジンセノサイドを含有する人参加工方法(特許文献2)、人参または紅参にキムチ乳酸菌を接種し、有機酸を処理する段階を含む発酵人参または発酵紅参の製造方法(特許文献3)、人参をアスペルギルスで発酵した後、澱粉分解酵素及び蛋白質分解酵素に分解することを特徴とする機能性及び官能性に優れる人参発酵液の製造方法(特許文献4)、ラクトバチラスカゼイハセガワ菌株で人参の内の配糖体成分を分解して得た分解物を含む発酵人参(特許文献5)、多様なラクトバチラス菌株で人参を発酵してサポニン分解物を含む発酵人参(特許文献6)などが開示されている。

韓国特許出願第2000−58997号 韓国特許公開第2003−87250号 韓国特許公開第2006−1834号 韓国特許公開第2003−61756号 韓国特許公開第2006−74970号 韓国特許公開第1998−40224号

Hasegawa, H. et al., Microbial Ecololgy in Health and Disease、12、85-91、2000 Hasegawa, H. et al., Planta Medica, 62, 453-457, 1996

上記のように人参に全く含まれていないとか、極少量含まれていている人参ジンセノサイドの含有量の増加と体内吸収の容易性のために微生物を用いて人参を発酵する方法、人参に酵素を処理する方法、または人参を酸加水分解する方法などが試みられているが、今まで高付加価値の人参製品を開発生産できない惜しみがある。これは、特定成分を強化するために高エネルギーを使用して量産するに当たって、効率性の問題、さまざまな微生物で発酵する場合、標準有効性分の含有量が一定に生産できないという問題点などがある。

本発明の目的は、人参のジンセノサイド組成を変化させることにある。

本発明の更に他の目的は、人参のジンセノサイドのうち、Rg3及びRh2の含有量を高めることにある。

本発明の更に他の目的は、人参内の有効成分を効果的に抽出し出す方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、ジンセノサイド含有量、好ましくはRg3及びRh2成分の高い人参抽出物及びこれを含む抗癌補助剤組成物を提供することにある。

本発明に従う加工人参または加工人参抽出物の製造方法は、(a)アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)を人参及びふすまで構成された培地に接種するステップ、(b)上記ステップ(a)の菌を培養するステップ、(c)上記ステップ(b)の培養物を精製するステップ、(d)上記ステップ(c)の精製物から酵素を分離するステップ、(e)人参または紅参に上記ステップ(d)の酵素を添加するステップ、(f)上記ステップ(e)の添加物を発酵するステップ、(g)上記ステップ(f)の発酵物を分離するステップ、(h)上記ステップ(g)の上澄液を濃縮するステップ;(i)上記ステップ(h)の濃縮物を有機酸で反応するステップ、及び(j)上記ステップ(i)の反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥するステップを含む加工人参または加工人参抽出物の製造方法である。

本発明の更に他の態様によれば、(a)アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)を人参及びふすまで構成された培地に接種するステップ、(b)上記ステップ(a)の菌を培養するステップ、(c)上記ステップ(b)の培養物を精製するステップ、(d)上記ステップ(c)の精製物から酵素を分離するステップ、(e)人参または紅参に上記ステップ(d)の酵素を添加するステップ、(f)上記ステップ(e)の添加物を発酵するステップ、(g)上記ステップ(f)の発酵物を分離するステップ、(h)上記ステップ(g)の上澄液を濃縮するステップ、(i)上記ステップ(h)の濃縮物を有機酸反応するステップ、及び(j)上記ステップ(i)の反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥するステップを含むジンセノサイドの含有量、より好ましくはRg3及びRh2含有量を増加させることを特徴とする。

本発明に従う加工人参または加工人参抽出物の製造に使われる人参の原産地は特別に限定されず、例えば、国内産、米国産、日本、ヒマラヤ、ベトナム、及び中国産を全て使用することができ、紅参の場合、紅尾参と紅参根を使用することができる。

また、本発明に従う加工人参または加工人参抽出物の製造に使われる人参の形態は、人参または紅参、人参または紅参の抽出粉末、及びエキス形態でありうる。上記抽出物は、熱水抽出法、酒精抽出法、及び混合抽出法により製造できる。上記において、人参または紅参の粉末化程度は特別に限定されず、例えば、人参または紅参抽出粉末の粉末化程度は粒子サイズが30〜150mesh位になるようにすることができる。上記エキスは減圧蒸留法や薄膜蒸留法により製造することができる。

本発明で使われる上記人参は、人参の根、葉、及び幹のうちから選択されたものであることがあり、紅参は紅尾参及び紅参根のうちから選択されたものを使用することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

上記(a)ステップで使われた菌はアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)であって、生物資源センターから分譲されたACTC6985である。上記(a)ステップの培地は人参粉末とふすまが1:1〜1:5重量比(g/g)、好ましくは1:3割合が維持できるように培地割合を合せた後、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)を接種する。アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)接種は、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)胞子懸濁液の胞子数が培地g当たり5×10胞子数になるように接種し、初期水分含有量を50〜80%に維持し、好ましくは65%を維持する。

上記(b)ステップで、培養温度は25〜40℃に、好ましくは30℃に維持し、培養時間は3〜7日間培養する時、サポニン分解酵素の生産量が最高潮に達した。

上記(c)と(d)ステップは、菌株の培養が終われば、0.02M酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加した後、培地をワットマンガラスマイクロファイバーフィルタ(Watman glass microfiber filter)で濾過した後、胞子を完全に除去するために、酵素が含まれた0.22μmボトルトップフィルタ(bottle top filter)でまた一度濾過してくれた。集められた濾過液は限外濾過膜(ultrafilteration)を実施して混合酵素液を精製し、この時に使われた濾過膜のカットオフ(cutoff)は100KDaであった。このように得られた濃縮された精製サポニン分解酵素液で人参または紅参を発酵することもでき、または精製された酵素液に酒精などを添加してサポニン分解酵素を分離することができる。即ち、精製されたサポニン分解酵素液に酒精を添加して蛋白質を沈殿させてサポニン分解酵素を塊りにて得ることができ、または酵素液をそのまま凍結乾燥して粉末でも得ることができる。

上記(e)と(f)ステップで使われた人参または紅参は前述した人参または紅参粉末、人参または紅参抽出エキス、または濃縮粉末に上記サポニン分解酵素を人参または紅参粉末、人参または紅参抽出エキスまたは濃縮粉末重量の5〜20%を添加した後、適当な発酵温度25〜60℃、好ましくは30〜35℃で6〜24時間の間培養し、好ましくは人参または紅参エキス1kgを30Lの水を入れて懸濁した後、50gの酵素を添加する。

上記(g)ステップで、人参または紅参の発酵物に酒精を添加してサポニン分解酵素を沈殿して濾過(濾過紙0.8μm)または遠心分離してサポニン分解酵素を分離し、上澄液のみ集めて50℃で濃縮する。

上記(i)ステップで発酵された人参または紅参に有機酸を添加し、40〜80℃で2〜18時間の間反応させる。上記の有機酸には特別に限定されるものではないが、アセト酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、及び酒石酸など、またはこれらの混合物を使用することができ、有機酸はステップ(h)濃縮物に精製水を添加して10%濃度の濃縮物溶液に製造した後、製造された濃縮物溶液の1〜50%(w/w)濃度で、好ましくは5〜25%(w/w)濃度で有機酸を添加する。

上記(h)と(j)ステップで、有機酸反応物の中和時、水または食品添加物である酸中和剤の使用が可能である。そして、有機酸反応物の濃縮は50℃で進行し、水または酒精を添加した後に濾過して濃縮することができ、有機酸反応物を一般的な精製過程であるレジン(resin)及び溶媒分画、即ちブタノールやエチルアセテートなどを使用して精製した後、濃縮を進行することもできる。

また、本発明の製造方法により製造されたジンセノサイドRg3及びRh2の含有量が増加した加工人参または加工人参抽出物は、従来の臨床で使用している抗癌剤と併用して使用時、上昇的な抗癌効果と共に抗癌剤により引き起こされる骨髄、血球細胞、肝または腎臓に対する毒性予防及び治療用薬学組成物及び抗癌補助剤を提供する。上記抗癌剤には、シスプラチン、カルボプラチン、パラプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ドキソルビシン、タキソール、タムオキシフェン、カムトベル、アドルシル、グリベック、エトフォシド、ゾメタ、オンコビン、ルプロン、ゲムザ、5−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカンなどが該当する。

上記本発明の製造方法により製造されたジンセノサイドRg3及びRh2の含有量が増加した加工人参または加工人参抽出物は、既存の抗癌剤1重量部に対して0.1ないし1000重量部に併用して使用することが好ましい。その含有量が上記範囲内の場合には、既存の抗癌剤の上昇的抗癌効果と共に抗癌剤により引き起こされる毒性を効果的に減少させることができる。

本発明に従う加工人参または加工人参抽出物の製造方法を利用すれば、ジンセノサイドの含有量が格段に増加した人参または人参抽出物が得られる。

本発明に従う加工人参または加工人参抽出物の製造方法を利用すれば、ジンセノサイドのうち、特にRg3とRh2が同時に含有量が増加した加工人参または加工人参抽出物が得られる。

本発明では、サポニン分解酵素のみで発酵された人参と有機酸工程のみ実施した加工人参と本発明の方法により実施した加工人参のジンセノサイドRg3とRh2の含有量を比較した結果、サポニン分解酵素と有機酸工程のみ進行した加工人参よりサポニン分解酵素工程と有機酸工程とが共になされた加工人参がジンセノサイドRg3及びRh2含有量が格段に高いことを確認することができる(表1)。

一方、上記サポニン分解酵素はアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)を人参とふすま培地で培養して得た酵素であって、上記技術は酵素で人参サポニン糖基を変化させて稀少な人参サポニンを製造する方法(韓国特許公開10−1999−45180号)などに既に公知された技術である。また、黴はβ−グルコシダーゼ(β-glucosidase)、α−アラビノシダーゼ(α-arabinosidase)、α−ラムノシダーゼ(α-rhamnosidase)の活性が高く、その他にプロテアーゼ(protease)、セルロース(cellulose)等、人参または紅参のような参を発酵させることに助けになる酵素を分泌することと知られている。
しかしながら、従来の技術は人参または紅参を発酵する場合、ジンセノサイド成分が一定に変化されないで発酵されたジンセノサイド成分が一定に生産されないという短所がある。

ここに、本発明ではアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)で培養後、限外濾過膜(ultrafilteration)を実施した酵素からベータ−グルコシダーゼ(β-glucosidase)、アルファ−ラムノシダーゼ(α-rhamnosidase)があることを確認し、またベータ−グルコシダーゼ(β-glucosidase)、アルファ−ラムノシダーゼ(α-rhamnosidase)が重量費比(g/g)で3:1から8:1で混合された酵素であり、酵素活性度(activity)が限外濾過膜の実施前より2倍以上向上したことを確認した。限外濾過膜の透過酵素2と透過しない酵素1の活性をTLCで確認した結果、限外濾過膜の透過酵素の場合、F2を生成して有機酸反応によりRh2に転換されたが、限外濾過膜が透過しない酵素は化合物K(com K)をより多く生成してRh2に転換される量が少ないことを確認した後、本発明を完成させた(図4)。

即ち、本発明はアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)から発現された混合酵素物でジンセノサイドRh2がより多く発現できる酵素を精製する方法により酵素の活性度が高まり、ベータ−グルコシダーゼ(β-glucosidase)とアルファ−ラムノシダーゼ(α-rhamnosidase)の割合が一定のサポニン分解酵素を生産することによって、ジンセノサイド成分の変化調節が可能であるので、標準化した加工人参または加工人参抽出物の生産が可能になった。これによって、本発明はジンセノサイドRg3及びRh2が同時に増加し、一定の量のRg3とRh2が含まれた加工人参または加工人参抽出物を製造できる標準製造方法を提供して、従来の技術の問題点である発酵に従うジンセノサイドの変化率を予測できなかった問題点を解決しながらRg3とRh2が同時に増加した加工人参または紅参を製造することができる。

また、それぞれのサポニン分解酵素を精製して使用する場合、酵素精製時間及び費用がたくさん発生する問題点があるが、本発明はサポニン分解酵素の一定の割合生産が可能であり、精製段階が簡便であるので量産が容易で、かつ精製歩留まりが高いので生産コストも低めることができる効果がある。また、さまざまな微生物で混合して発酵する場合、他の微生物との交差汚染の問題点があるが、本発明は単一黴菌であるアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)を使用して交差汚染を防ぐことができる。

また、本発明は人参または紅参を発酵させるためにサポニン分解酵素を生産し、これを使用して人参または紅参を発酵させた後、有機酸を添加して加水分解する過程を経て発明を完成するようになった。これと関連した従来技術には、キムチ乳酸菌を用いた発酵人参または発酵紅参の製造方法(韓国特許出願10−2005−94311号)により人参または紅参をキムチ乳酸菌で発酵し、有機酸処理して発酵人参または紅参を製造する方法を開示しているが、上記従来技術により製造された発酵人参または紅参にはRh2がほとんど含まれていず、Rg3やはり少量含まれることを確認することができる(図5、6)。

ここに、本発明ではこのような問題点を解決してサポニン転換酵素を限外濾過膜で精製した後、人参または紅参を発酵するようにし、有機酸の添加によりRg3とRh2が同時に増加する加工人参または加工紅参製造方法を完成することができた。

本発明に従う加工人参または加工紅参抽出物は、好ましくは、加工人参にはジンセノサイドRg3及びRh2を0.05%〜1%含有していて、加工人参抽出物のうち、人参濃縮液または紅参濃縮液を使用して製造された加工人参抽出物にはジンセノサイドRg3及びRh2の含有量が0.5〜5%、人参濃縮液粉末または紅参濃縮液粉末を使用して製造された加工人参抽出物にはジンセノサイドRg3及びRh2の含有量が0.5%〜30%、その他、人参サポニンまたは紅参サポニン成分を精製して製造した人参加工抽出物にはジンセノサイドRg3及びジンセノサイドRh2の含有量が30〜50%の量で含有していることを特徴とする。

また、本発明の製造方法により製造されたジンセノサイドRg3及びRh2の含有量が増加した加工人参または加工紅参抽出物は、従来の臨床で使用している抗癌剤と併用して使用時、上昇的な抗癌効果と共に、抗癌剤により引き起こされる骨髄、血球細胞、肝または腎臓に対する毒性予防効果を有する。

人参エキスの酵素反応物と有機酸反応物に従うサポニン成分変化スペクトル 標準品Reを本発明酵素で反応させた時、Rg1が生成されることが確認を通じてアルファ−ラムノシダーゼ(α-rhamnosidase)があることを確認することができるスペクトル 標準品Rg3を本発明酵素で反応させた時、Rh2が生成されることを確認を通じてベータ−グルコシダーゼ(β-glucosidase)があることを確認することができるスペクトル 本発明(c)、(d)ステップの限外濾過膜の透過酵素2と透過しない酵素1の活性をTLCで確認した結果、限外濾過膜の透過酵素の場合、F2を生成して有機酸反応によりRh2に転換されたが、限外濾過膜を透過しない酵素は化合物K(Com K)をより多い生成してRh2に転換される量が少ないことを確認する薄層クロマトグラフ(TLC) 本発明と従来技術とのRg3生成比較スペクトル 本発明と従来技術とのRh2生成比較スペクトル

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の権利範囲はこれら実施例のみに限定されるものではない。

(実施例1:人参を用いた加工人参の製造)
人参粉末250g、ふすま750gを入れて、121℃、1.5気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水2Lを入れて混合した後、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)懸濁液(5×10胞子/培地重さg)を28℃で7日間培養する。培養が完了すれば、0.02M酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜(100KDa以上)を使用して濾過濃縮して酵素液60gを得る。人参200gに酵素液30gを添加して28℃で18時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物200gに2Lの精製水を加えた後、クエン酸250gを添加し、50℃で18時間の間攪拌した。反応が完了すれば、70%の酒精を添加し濾過、濃縮して200gの加工人参を得た。

(実施例2:人参濃縮液を用いた加工人参濃縮液の製造)
人参粉末250g、ふすま750gを入れて、121℃、1.5気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水2Lを入れて混合した後、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)懸濁液(5×10胞子/培地重さg)を接種し、28℃で7日間培養する。培養が完了すれば、0.02M酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加し混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜(100KDa以上)を使用して濾過濃縮して酵素液60gを得る。人参濃縮液200gに酵素液30gを添加して28℃で18時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物200gに2Lの精製水の添加後、クエン酸250gを添加し、50℃で18時間の間攪拌した。反応が完了すれば、70%酒精を添加し濾過、濃縮して190gの加工人参濃縮液を得た。

(実施例3:人参濃縮液粉末を用いた加工人参濃縮液粉末の製造)
人参粉末250g、ふすま750gを入れて、121℃、1.5気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水2Lを入れて混合した後、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)懸濁液(5×10胞子/培地重さg)を接種し、28℃で7日間培養する。培養が完了すれば、0.02M酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜(100KDa以上)を使用して濾過濃縮して酵素液60gを得る。人参濃縮液粉末200gに酵素液30gを添加して28℃で18時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物200gに精製水2Lを添加し、酢酸250gを添加し、50℃で8時間の間攪拌した。反応が完了すれば、70%酒精を添加し濾過、濃縮、乾燥して195gの加工人参濃縮液粉末を得た。

(実施例4:紅参を用いた加工紅参の製造)
人参粉末250g、ふすま750gを入れて、121℃、1.5気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水2Lを入れて混合した後、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)懸濁液(5×10胞子/培地重さg)を接種し、28℃で7日間培養する。培養が完了すれば、0.02M酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜(100KDa以上)を使用して濾過濃縮して酵素液60gを得る。紅参200gに酵素液30gを添加して28℃で18時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物200gに精製水2Lを加えて、酢酸250gを添加し、50℃で8時間の間攪拌した。反応が完了すれば、70%酒精を添加し濾過、濃縮、乾燥して195gの加工紅参を得た。

(実施例5:紅参濃縮液を用いた加工紅参濃縮液の製造)
人参粉末250g、ふすま750gを入れて、121℃、1.5気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水2Lを入れて混合した後、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)懸濁液(5×10胞子/培地重さg)を接種し、28℃で7日間培養する。培養が完了すれば、0.02M酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜(100KDa以上)を使用して濾過濃縮して酵素液60gを得る。紅参濃縮液200gに酵素液30gを添加して28℃で18時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物200gに精製水2Lを加えて、クエン酸250gを添加し、50℃で18時間の間攪拌した。反応が完了すれば、70%酒精を添加し濾過、濃縮して190gの加工紅参濃縮液を得た。

(実施例6:紅参濃縮液粉末を用いた加工紅参濃縮液粉末の製造)
人参粉末250g、ふすま750gを入れて、121℃、1.5気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水2Lを入れて混合した後、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)懸濁液(5×10胞子/培地重さg)を接種し、28℃で7日間培養する。培養が完了すれば、0.02M酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜(100KDa以上)を使用して濾過濃縮して酵素液60gを得る。紅参濃縮液粉末200gに酵素液30gを添加して28℃で18時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物200gに精製水2Lを加えて、酢酸250gを添加し、50℃で8時間の間攪拌した。反応が完了すれば、70%酒精を添加し、濾過、濃縮、乾燥して195gの加工紅参濃縮液粉末を得た。

(実施例7:人参濃縮液粉末を用いた精製した加工人参抽出物の製造)
人参粉末250g、ふすま750gを入れて、121℃、1.5気圧下で高圧蒸気滅菌器で滅菌する。滅菌された培地に滅菌水2Lを入れて混合した後、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)懸濁液(5×10胞子/培地重さg)を接種し、28℃で7日間培養する。培養が完了すれば、0.02M酢酸ナトリウム緩衝溶液を添加して混合した後、培地を濾過する。濾過された培養液を限外濾過膜(100KDa以上)を使用して濾過濃縮して酵素液60gを得る。人参濃縮液200gに酵素液30gを添加して28℃で18時間培養した後、酒精を添加して酵素を沈殿、上澄液を濃縮する。上記濃縮物200gに2Lの精製水を加えて、酢酸250gを添加し、50℃で8時間の間攪拌した。反応が完了すれば、70%酒精を添加し、濾過、濃縮、乾燥して195gの加工人参濃縮液粉末を得て、レジンを使用して精製して10gの加工人参抽出物を得た。

(比較例1:サポニン分解酵素のみで発酵した加工人参濃縮液粉末の製造)
実施例3のように実験し、かつ酢酸溶液をいれる有機酸反応を除外して加工人参濃縮液粉末を得た。

(比較例2:有機酸のみで反応した加工人参濃縮液粉末の製造)
実施例3のように実験し、かつ酵素処理を除外して加工人参濃縮液粉末を得た。人参濃縮液粉末200gに2Lの精製水を加えて、酢酸250gを添加し、50℃で8時間の間攪拌した。反応が完了すれば、70%の酒精を添加し、濾過、濃縮、乾燥して195gの加工人参濃縮液粉末を得た。

(比較例3:精製しないサポニン分解酵素で反応した加工人参濃縮液粉末の製造)
実施例3のように実験し、かつ限外濾過膜透過工程で精製しないサポニン分解酵素と有機酸反応により加工人参濃縮液粉末を得た。

本発明に従う加工人参または加工人参抽出物のサポニン含有量の変化は、以下の表1に示した。

(実験例1:サポニン分解酵素の確認)
500mgの標準品Rg3と50mgの標準品Re試料を各々20mMアセト酸ナトリウム緩衝溶液に入れて、本発明のサポニン分解酵素を25mg添加した後、32℃で22時間恒温攪拌する。それぞれの酵素反応物にブタノールを入れて層分離した後、ブタノール層を濃縮した後、HPLCで確認した。HPLC分析条件は、以下の通りである。
1) 機器:Shiseido nanospace SI−2
2) コラム:Capcell Pak C18 UG80 4.6×150mm(5μm)
3) 流速:1.00mL/min
4) UV wavelength:203nm
5) コラム温度:40℃
6) 注入量:20μL
7) 移動相:(1)Re分析:20%アセトニトリル(Acetonitrile)
(2)Rg3分析:40%アセトニトリル(Acetonitrile)と60%アセトニトリル(Acetonitrile)を40分間濃度勾配した。

実験の結果、標準品Reを本発明の酵素で反応させた時、Rg1が生成されることを確認することができ、これは本発明のサポニン分解酵素にアルファ−ラムノシダーゼ(α-rhamnosidase)があることを確認することができた。また、同一な実験として、Rg3の標準品で本発明の酵素と反応した時、Rh2が生成されることを確認することができ、これは本発明のサポニン分解酵素にベータグルコシダーゼが存在することを確認することができた(図2、3)。

(実験例2:サポニン分解酵素のTLC確認)
サポニン分解酵素を培養して限外濾過膜を通過した酵素2と通過しない酵素1を各々25mgを取って50mgの標準品Rb1と各々反応した後、TLC結果を確認した。展開溶媒は、CHCl3:MeOH:H2O=7:2.5:0.5であり、発色試薬は5%硫酸−アニスアルデヒド(Anisaldehyde)溶液を製造して確認した(図4)。

(実験例3:サポニン分解酵素の割合決定)
本発明のサポニン分解酵素を重量対体積比で50%となる硫酸アンモニウムを4℃で徐々に添加しながらよく攪拌してくれた。上記酵素液を12000xGで30分間遠心分離して沈殿物のみを集めて上記沈殿物を0.01Mの酢酸ナトリウム緩衝溶液に溶かし、同一緩衝溶液で透析した。この透析された酵素液をDEAE−セルロース(cellulose)コラムを通過させて酵素がコラムに吸着されるようにし、0.01molの塩化カリウムを入れて分離した。分離されたそれぞれの酵素分画のうち、酵素活性がある分画のみを確認して比較的精製されたベータ−グルコシダーゼとアルファ−ラムノシダーゼのみを収得して割合を定めた(表2)。

(実験例4:急性毒性試験)
実施例2で得た加工人参濃縮液を精製水に溶解させて各々100、300、500mg/mLの濃度になるようにしてマウス投与用試料溶液とした。6週齢の健康な雌雄マウス(ICR系)を使用して試料溶液投与前5時間絶食させた後、雄雌各々5頭ずつを1つの群にして試料投与量が各々0.5g/kg、1g/kg、及び2g/kgになるように試料溶液を10mL/kgずつ経口投与した。一方、対照群には同量の精製水のみを投与した。また、試験期間中には実験動物が飼料及び水を自由に摂取できるようにした。全ての実験動物に対して試料溶液に対して溶液投与直後、30分間は継続的に、試験期間中には1日1回ずつ臨床症状を観察し、体重は投与直前と投与後1、3、7、及び14日目に特定した。体重変化に対して対照群と投与群との差はstudents t-testを使用して分析した。

試験期間の間、全体動物のうち、斃死した動物は1件も発生しなくて、白ねずみに対する加工人参抽出液の50%致死量(LD50)は2g/kgより大きいことと表れた。また、試料投与群は対照群と比較して試料投与により引き起こされたものと思われる症状が全く観察できなかったし、体重の差も全く表れなかった。さらに、観察期間の終了後、剖検時にも肉眼で臓器の異常は全く観察できなかった。以上の結果を総合して見ると、本発明による加工人参または加工紅参は非常に安全性に優れることか分かる。

(実験例5:抗癌補助剤組成物の製造及び効果)
実験動物は体重20±2gの6週齢の雌Balb/c−nu/nuマウスをオリエント株式会社から供給を受けて、温度23±1℃、相対湿度55±15%、及び12時間間隔で明暗が調節される動物飼育室で飼育させ、一週間の間、飼料(株式会社オリエント)を自由に摂取させ順化させた後、肉眼的な症状を観察した。一週間の間順化させたBalb/c−nu/nuマウスにHT−29(1×10cells/mouse)細胞を100μlずつ横腹皮下に移植させた後、肉眼で観察した。腫瘍のサイズが200mm3に到達したマウスをランダムにグループを分けた後、薬物投与を始めた。体重及び腫瘍サイズ(tumor volume)は週2回測定し、腫瘍サイズ(tumor volume)の測定はバーニヤカリパス(vernier calipers)を使用して長径(length)と短径(width)を測定した。測定した腫瘍サイズ(tumor volume)は次のような数式により算出し、これを試験終了日まで一定に実施した。
*Tumor volume(mm3)=lxwx0.5
(Tumor volume=腫瘍サイズ、l=長径、w=短径)

全ての実施例、比較例、及びさまざまな人参関連濃縮液は、100mg/kgBWの容量で蒸溜水(DW)に希釈して調製した後、経口投与針(sonde)を使用して経口に強制投与した。投与容量は投与当日に測定した体重に従って200μl/20g投与するように算出し、試験物質の投与時間は1日1回、午前10時頃に一括的に投与した。FOLFOX療法は5-fluorouracil(5-FU)/leucovorin(LV)+Oxaliplatin(Ox)=16:5:1mg/kg BWの濃度で0.9%のNaCl溶液3mgに溶かした後、測定した体重に従って1回/日で初期週5回腹腔投与した(以下の表3はFOLFOX及び比較例投与方法及び投与容量を表した)。

マウスの犠牲前、内靜脈叢でヘパリン処理したキャピラリ(heparinized capillary)(Chase instruments Co.)により採血してEDTA(K3)が入っている試験管(Sherwood medical Co.)に取って、roll
mixerで混化した後、WBC(white blood cell)、RBC(red blood cell)、PLT(platelet)をコールターカウンター(Coulter counter)で測定した。コールターカウンター(Coulter counter)は使用前に4Cplus液でWBC、RBC、PLT値を標準溶液に合うように補正した後、血液を分析した。また、心臓で分取した血液は直ちに3,000rpm、4℃で10分間遠心分離して血清を得た。採取した血清を用いて直ちにAST(aspartate aminotransferase)、ALT(alanine
aminotransferase)、血中尿素窒素(blood urea nitroden)、そしてクレアチニン(creatinine)は24時間以内に定量した。以下の表4に、HT−29大腸癌細胞株を異種移植したBalb/C nude miceでFOLFOXと本発明の加工人参抽出物の併用時、上昇的な抗癌効果を表した。
表4からわかるように、HT−29大腸癌細胞株に異種移植したBalb/C nude miceでのFOLFOXと本発明の実施例などを投与した時の上昇的な併用効果を確認した。FOLFOX(5−Fu/LV+Ox=16:5:1mg/kg BW)処理方法は、細胞を移植した後、腫瘍(tumor)のサイズ(volume)が200mm3に到達した時、マウスをランダムにグループを分けて、初期5日間連続して腹腔投与した。薬物群は、一括的に100mg/kg BWの濃度で毎日口腔投与した。4週間投与した結果、FOLFOXグループはコントロール(control)グループに比べて42.7%の癌成長抑制率を表した。
これに反して、FOLFOXと本発明の実施例を併用投与したグループである実施例2は、74.6%、実施例3は80.2%、実施例6は77%に癌成長抑制率が上昇的に格段に増加したが、これは本発明の製造方法により製造されていない通常の人参濃縮液や人参濃縮液粉末、紅参濃縮液粉末を処理したグループ及び比較例2(58.7%抑制)の条件に比べて格段に優れる抗癌効果を表した。

以下の表5は、HT−29大腸癌細胞株を異種移植したBalb/C nude miceでFOLFOXと加工人参抽出物の併用時、血液生化学的分析結果を表したものであって、本実験では薬物などを4週間投与した後、血液生化学的分析を実施した。その結果、FOLFOX投与グループは、WBC、RBC、PLT全てコントロール(control)グループに比べて格段に劣ったことを確認することができた。それに反して、FOLFOXと本発明の実施例を併用投与したグループでは、FOLFOXにより劣った血液学的数値が回復する傾向を確認することができ、これは本発明の製造方法により製造されていない通常の人参濃縮液や人参濃縮液粉末、紅参濃縮液粉末を処理したグループと比較例2の回復率に比べて優れる血液生化学的数値の回復結果を表した。

以下の表6は、HT−29大腸癌細胞株を異種移植したBalb/C nude miceでFOLFOXと加工人参抽出物の併用時、腎臓毒性及び肝毒性変化分析結果を表したものであって、本実験では薬物などを4週間投与した後、腎臓機能を評価する指標となるBUN(血中尿素窒素)、クレアチニン及び肝毒性指標であるASTとALT分析を実施した。その結果、FOLFOXグループはBUN、クレアチニン(Creatinine)、AST、及びALT全てコントロール(control)グループに比べて留意的に増加して腎臓毒性及び肝の毒性が格段に増加したことを確認することができ、これに反して、FOLFOXと実施例とを併用投与したグループでは、FOLFOXにより高まった腎臓毒性及び肝毒性の数値がだいぶ回復する傾向を確認することができ、これは本発明の製造方法により製造されていない通常の人参濃縮液や人参濃縮液粉末、紅参濃縮液粉末を処理したグループと比較例2の回復率に比べて優れるに腎臓毒性及び肝毒性が回復する結果を確認することができた。

人参の薬理効能は多い研究を通じて明らかになっていて、製品開発も単純抽出あるいは加工方法から外れて人参を発酵と接続させた技術の以外に2000年以後、多様な人参加工技術が続出した。しかしながら、このような多様な技術開発の努力にもかかわらず、高付加価値の人参製品は生産されていない。これは、量産するに当たって効率性の問題、標準化した生産方法確立の不足などを挙げることができる。人参の代表的な製品として、ドイツのベーリンガーインゲルハイムのファーマトンは人参の単純抽出工程により生産された製品であるにもかかわらず、年500億ドル以上の売上げを上げているが、ファーマトンの場合、標準化した生産工程によりジンセノサイド成分が一定に含まれた製品を生産しているためである。
このように製品の標準化した生産方法は非常に重要であるが、本発明ではジンセノサイドRg3とRh2が同時に強化された加工人参または加工人参抽出物を標準化した生産工程により製造する方法を完成し、また、これから製造された加工人参または加工人参抽出物を含む抗癌補助剤組成物を提供して高付加価値の人参製品開発に応用できるようにしたため、産業上有用である。

Claims (11)

  1. (a)アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)を人参及びふすまで構成された培地に接種するステップと、
    (b)前記ステップ(a)の菌を培養するステップと、
    (c)前記ステップ(b)の培養物を限外濾過膜(ultrafilteration)で精製するステップと、
    (d)前記ステップ(c)の精製物から酵素を分離するステップと、
    (e)人参、紅参、人参抽出物、または紅参抽出物に、前記ステップ(d)の酵素を添加するステップと、
    (f)前記ステップ(e)の添加物を発酵するステップと、
    (g)前記ステップ(f)の発酵物を分離するステップと、
    (h)前記ステップ(g)の上澄液を濃縮するステップと、
    (i)前記ステップ(h)濃縮物をアセト酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、及び酒石酸からなる群から選択された一種以上の有機酸で反応するステップと、
    (j)前記ステップ(i)反応物を中和及び濾過、精製、濃縮、乾燥するステップと、を有し
    ジンセノサイドRg3及びRh2の含有量を増加させた
    ことを特徴とする加工人参または加工人参抽出物の製造方法。
  2. 前記(a)ステップのアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)接種が、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)胞子懸濁液の胞子数を培地重さg当たり5×10胞子になるようにする接種であり、初期水分含有量を50〜80%に維持する
    請求項1に記載の製造方法。
  3. 前記(c)ステップで使われる限外濾過膜が、カットオフ(cutoff)100KDaの濾過膜である
    請求項1に記載の製造方法。
  4. 前記(c)、(d)ステップの酵素が、ベータ−グルコシダーゼとアルファラムノシダーゼが3:1から8:1重量比で生成される酵素である
    請求項1に記載の製造方法。
  5. 前記(e)ステップの酵素添加が、前記ステップ(d)の酵素を人参、紅参、人参抽出物または紅参抽出物の重さの5〜20%添加である
    請求項1に記載の製造方法。
  6. 前記(i)ステップで、前記有機酸濃度は前記ステップ(h)の濃縮物に精製水を添加して10%の濃縮物溶液に製造した後、前記濃縮物溶液を1〜50%(w/w)にし、反応時間は2〜18時間であり、反応温度は40〜80℃である
    請求項1に記載の製造方法。
  7. 前記(f)ステップの発酵が、発酵温度25〜60℃で6〜24時間の培養である
    請求項1に記載の製造方法。
  8. 請求項1ないし7のいずれかに記載の製造方法により製造され、ジンセノサイドRg3及びRh2の含有量を増加させた
    ことを特徴とする加工人参または加工人参抽出物。
  9. 請求項8に記載のジンセノサイドRg3及びRh2の含有量が増加した加工人参または加工人参抽出物を、有効性分として含有する
    ことを特徴とする抗癌補助剤組成物。
  10. 前記抗癌補助剤組成物が抗癌剤と併用されるものである
    請求項9に記載の薬学組成物。
  11. 前記抗癌剤が、シスプラチン、カルボプラチン、パラプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ドキソルビシン、タキソール、タムオキシフェン、カムトベル、アドルシル、グリベック、エトフォシド、ゾメタ、オンコビン、ルプロン、ゲムザ、5−フルオロウラシル、ロイコボリン、イリノテカンからなる群から選択された一種以上のものである
    請求項10に記載の薬学組成物。
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