JP2827417B2 - デメチルアロサミジン及びその製造法 - Google Patents

デメチルアロサミジン及びその製造法

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  • Saccharide Compounds (AREA)
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なアロサミン誘導体及びそれを有効成
分とする抗真菌剤又はキチナーゼ阻害剤に関する。
〔従来の技術〕
キチンは真菌剤の細胞壁の主成分であり(G.W.Gooday
and A.Trinci,Symposia of the Society for General
Microbiology,30,207−251,1980)、真菌が分裂・増殖
を繰り返す過程では、キチンの整合のとれた合成と分解
とが行われていると考えられている(G.W.Gooday et a
l.“Chitin in Nature and Technology"pp83−91,Edite
d by R.A.A.Muzzarelli et al.,Prenum Press.,New Yor
k,1986)。
一方、キチンは虫の表皮の主成分であり、昆虫が脱皮
・成長していく過程では、やはりキチンの合成と分野と
が巧みに制御されていることが知られている(K.J.Kram
er et al.“Comprehensive Insect Physiology Biochem
istry and Pharmacology"vol.3,p75,Edited by G.A.Ker
kut and L.I.Gilbert,Pergamon Press,Inc.,New York,1
985)。
さて、このキチンの生合成および分解の反応は、主に
キチン合成酵素(キチンシンターゼ)およびキチン分解
酵素(キチナーゼ)という2種類の酵素により各々調節
されていることが知られている。
従って、これらの酵素の阻害剤は、新しいタイプの抗
真菌剤あるいは昆虫成長制御剤(殺虫剤)となりうるこ
とが期待される。
実際に、このうちのキチンシンターゼに対する阻害剤
の一つであるポリオキシン(polyoxin)は、農業用抗真
菌剤として実用化されており、又、in vivoにおける昆
虫の脱皮阻害作用も報告されている(E.Cohen and J.E.
Cashida,Pestic.Biochem.Physiol.,17,301−306,198
2)。
一方、キチナーゼに対する阻害剤は、現在までにアロ
サミジン(allosamidin)が発見されているのみである
(S.Sakuda et、al.,J.Antibiotics.40,296−300,198
7)。アロサミジンは、昆虫由来のエンド型キチナーゼ
を強力に阻害することから、殺虫、殺ダニ剤としての開
発が期待されている(特開昭62−207294号公報)。
〔発明が解決しようとする課題〕
しかし、アロサミジンは真菌由来のキチナーゼに対し
ては弱い阻害活性しか示さず、抗真菌剤としての開発は
困難と考えられた。
〔課題を解決するための手段〕
そこで、本発明者等は、真菌由来のキチナーゼに対す
る阻害物質を天然物より広く検索した結果、ある種のア
ロサミジン生産菌により生産される下記式(I)の化合
物が、極めて強い阻害活性を示すことを見出した。
式(I)の化合物はアロサミジンの−N(CH3
メチル基が1個とれて−NHCH3に変っているほかはアロ
サミジンと同一の構造を有しているところからデメチル
アロサミジン(Demethyl allosamidin)と命名された。
本発明のデメチルアロサミジンを生産する微生物とし
てはストレプトミセス・エスピー(Streptomyces sp.)
AJ 9463(FERM P−10642,FERM BP−2801)が一例として
挙げられる。この菌は放射菌の同定のために使用される
ISP3培地で好気的に生育し、気菌糸を形成し、胞子のう
を形成せず、基生菌糸は形成するが基生菌糸は分断しな
い。基菌糸は長い胞子鎖を形成する。胞子柄は輪生しな
い。細胞壁中にLL−ジアミノピメリン酸を含有し、特徴
的な糖は存在せず、リン脂質はP II型である。以上の菌
学的性質により、本菌株をストレプトミセス属に属する
1菌株ストレプトミセス・エスピー(Streptomyces S
P.)と同定した。
デメチルアロサミジンを製造するには、同物質生産
菌、例えばストレプトミセス・エスピーFERM P−10642,
FERM BP−2801を適当な培地に培養し、その培養物から
同物質を採取することにより行われる。
培養方法は原則的には一般微生物の培養方法に準ずる
が、通常は液体培地による深部培養が有利である。培養
に用いられる培地としては、生産菌が利用できる栄養源
を含有するものであればよい。すなわち、炭素源として
はグルコース、フラクトース、澱粉、デキストリン等が
用いられ、窒素源としては肉エキス、カゼイン、グルテ
ン、酵母エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカ
ー、尿素、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が
用いられる。このほか、例えばリン酸水素ナトリウム、
硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等の無機塩も必要に
応じて用いることができる。培養にあたり、発泡のはげ
しいときにはシリコン化合物、高級アルコール、植物油
等消泡剤を少量添加すればよい。
培養温度は20〜35℃が良く、特に27℃前後が最も好ま
しい。培養時間は1〜10日間程度が良いが、培養条件に
より適宜変更することができる。
培養により生成したデメチルアロサミジンは主として
菌体内に蓄積されるので、一般には遠心分離、濾過等の
手段により分離した菌体から一般に抗生物質の単離に用
いられる手段によって分離、精製される。例えば、メタ
ノール、n−ブタノール等低級アルコールによる溶媒抽
出法、シリカゲル、硅藻土、アビセル、アルミナ等を使
用する吸着カラムクロマトグラフィー、トーヨーパール
HW40(東洋曹達(株)製のゲル濾過用担体)等を使用す
るゲル濾過法、各種イオン交換クロマトグラフィー、オ
クタドデシル化(ODS)されたシリカゲルを担体とする
逆相分配カラムクロマトグラフィー及びHPLC、更には向
流分配法、結晶、再結晶等の精製手段を順次又は適宜組
み合わせて行うことにより単離、精製することができ
る。
こうして、単離精製されたデメチルアロサミジンは、
真菌由来のキチナーゼに対し、強力な阻害活性を有して
おり、デメチルアロサミジン単位重量あたりの阻害活性
は、アロサミジンのそれと比較して100倍程度強いもの
である。
また、デメチルアロサミジンは、フザリウム属をはじ
めとする各種真菌類の生育過程に影響を与え異常形態を
引き起こす。
一方、デメチルアロサミジンの細胞毒性は低く、マウ
ス腹水乳ガン細胞やヒト白血病細胞に対しては、これら
の培養液中にデメチルアロサミジン1mg/mlを添加しても
何ら生育阻害は認められなかった。
本発明のデメチルアロサミジンを抗真菌剤又はキチナ
ーゼ阻害剤として利用する際には抗生物質等の一般の製
剤化手段を利用することができる。形態も溶液、乳液、
懸濁液、ペースト、粉末等のいずれであってもよい。
なお、デメチルアロサミジンを適当な条件下、例え
ば、4N塩酸中100℃で4時間加水分解することにより、
下記式を有する化合物デメチルアロサミゾリン(Demeth
ylallosamizoline)が得られる。真菌のキチナーゼに対
するデメチルアロサミジンとアロサミジンの阻害活性の
大きな違いは、この部分に由来し、このものも抗真菌剤
の合成原料として有用である。
〔実施例〕 (1)デメチルアロサミジンの製造 グルコース(12g)、肉エキス(1.2g)、ペプトン
(2.4g)、酵母エキス(1.2g)及び水(1.2)からな
る培地(pH7.2)を調製し、500ml容三角フラスコ12本に
100mlずつ分注した。
120℃で20分間滅菌したのち、ストレプトミセスSP.AJ
9463(FERM P−10642,FERM BP−2801)の斜面培養菌体
を1白金耳ずつ接種し、28℃で3日間振盪培養し、種母
液を得た。一方、上記組成の培地60を調製し、100
容培養タンクに注入し、120℃で30分間滅菌した。これ
に、上記種母液1.2を加え、27℃で5日間培養した。
この時の撹拌速度は200rpm、通気速度は60/minであっ
た。このようにして得られた培養物に、セライトを加え
た後ヌッチェを用いて濾過し、菌体とセライトの混合物
を得た。これにメタノール(8)を加え、よく撹拌し
た後一晩静置した。これを濾過し、メタノール抽出液を
得た。これを約1まで減圧濃縮した後、蒸留水を添加
し、全体の液量を6にした。この全量を活性炭カラム
(600ml容量)に吸着させ、蒸留水(1.8)で洗った
後、10%エタノール(3)、25%エタノール(3
)、50%エタノール(3)で順次溶出した。活性は
主として25%エタノール溶出区に回収された。この区分
を約2に減圧濃縮した後、酢酸を加え、液のpHを3.8
に調製した。この液を50mM酢酸アンモニウム/酢酸(pH
5.0)で平衡化したSP−Sephadex C−25陽イオン交換カ
ラム(160ml容量)に吸着させ、同緩衝液で一段階溶出
を行い、8mlづつ分画した。各フラクションについて、
活性を測定し、比活性の弱いフラクションNo.55〜64
と、比活性の強いフラクションNo.65〜75の2区分に分
画した。このうちNo.55〜64の成分は、FABMS、NMR等の
各種物理化学的性状からアロサミジンであることが確認
された。一方、No.65〜75の区分は、少量の活性炭によ
り脱塩した後、減圧濃縮し、次いで弱陽イオン交換カラ
ムAsah−ipak ES−502Cを用いた高速液体クロマトグラ
フィー(移動相;10mM酢酸アンモニウム/アンモニア(p
H8.9)、流速;1.0ml/min)により精製した。220nmの紫
外部吸収により検出し、保持時間(tR)7.0分および8.8
分の2つのピークを分取し凍結乾燥した。このうちtR8.
8分の物質は、各種物理化学的性状からアロサミジンで
あることが確認された。一方のtR7.0分の物質は、各種
イオン交換カラムを用いたHPLC上で単一のピークを与
え、下記の物理化学的諸性状から、式(I)で表される
デメチルアロサミジンであることが確認された。
(1)外 観;白色粉末 (2)分子式;C24H40N4O14 (3)FABMS;m/z 609(M+H)+,グリセロール・マト
リックス (4)紫外線吸収スペクトル;末端吸収(0.1N酢酸中) (5)1H−NMRスペクトル;第1図に示す通り(600MHz,
D2O+AcOD) (2)デメチルアロサミジンのキチナーゼ阻害活性の測
定 上記のようにして製造された、式(I)のデメチルア
ロサミジンは、真菌由来のキチナーゼに対し、強力な阻
害活性を有していた。
(i)キチナーゼ酵素液の調製法 2の坂口フラスコに0.1%digitonin(和光純薬)、
0.1%β−mercaptoethanolを含む25mM MES(半井化学薬
品)緩衝液1とパン酵母200g(鐘淵化学工業)を入れ
30℃、120spmで2時間振盪した。遠心分離(0℃、10mi
n、12,000g)により菌体を除去、得られた上清を限外濾
過(TOYO LUTRAFILTER UP−20)により200mlまで濃縮し
た。濃縮後にクエン酸緩衝液(0.15Mクエン酸+0.15Mク
エン酸ナトリウム、pH3.0)400mlを加え、生じた沈澱を
遠心分離(0℃、10min、12,000g)により除いた、上清
を再び限外濾過(UP−20)により40mlまで濃縮した。そ
の濃縮液を4℃で保存しassay時のキチナーゼ酵素液と
して用いた。
(ii)酵素基質の調製法 キトサン(PFANSTIEHL LABORATORIES INC.)0.5gに10
%酢酸10mlを徐々に加え、乳鉢で練り込みゲル状とし
た。室温で一夜放置後、メタノール45mlをよくかき混ぜ
ながら加えた後、ガーゼで濾過し、得られた濾液に3Hラ
ベルの無水酢酸0.75ml(NET018A10 ACETIC ANHYDRIDE 5
mCi)を加えた。生成した寒天状のキチンをホモジナイ
ザーですりつぶし、ガラスフィルター(Whatman GF/B)
上に集め、クエン酸緩衝液(pH3.0)10mlに懸濁した。
このキチン懸濁液(2.3μCi/ml chitin s−uspension)
をアッセイ時の基質として用いた。
(iii)キチナーゼ阻害活性測定法 エフペンドルフチューブにキチナーゼ酵素液90μ、
3H−キチン懸濁液10μを入れ37℃、3時間反応させ
た。この時ブランクとしては酵素液90μのかわりにク
エン酸緩衝液(pH3.0)90μを用いて同様に反応し
た。反応後10%トリクロロ酢酸100μを加え、その反
応液をガラスフィルター(Whatmann GF/B)を通し、得
られた濾液にシンチラント溶液10mlを加えそのradio ac
tivity(dpm)を測定し、その値のブランクとの差をキ
チナーゼ活性とした。シンチラント溶液はオムニフラワ
ー(0m−niflour)4g(第一化学)をトルエ500mlに溶解
したものにトリトンX−100(半井化学薬品)500mlを加
え調製した。
アロサミジン、デメチルアロサミジン添加の際は、両
方とも0.1N酢酸溶液に溶かし、上記反応系にそれぞれの
濃度のものを10μづつ加えた。ブランク及び阻害剤を
加えないものにも0.1N酢酸10μを加え上記反応を行っ
た。
阻害活性は下式で計算した。
A;阻害剤を添加しない時のキチナーゼ活性(dpm) B;阻害剤を添加した時のキチナーゼ活性(dpm) いずれの測定も3連で行い、その平均値を求めた。
(iv)測定結果 第1表に示す通りであった。
(3)デメチルアロサミジンの糸状菌の生育に及ぼす影
響 糸状菌の培養液にデメチルアロサミジンを添加し、そ
の影響を調べた。
まず、フザリウム・ニバレ(Fusarium nivale)ATCC
−42308をPDA培地(日水製薬社製)で前培養し、胞子を
形成させた。これを、生理食塩水に懸濁させ、滅菌した
綿に通して、菌糸を含まない胞子懸濁液を得た。
これを、デメチルアロサミジン(0.80μg/ml,0.16μg
/ml)添加培地及びデメチルアロサミジン無添加の培地
(コントロール)に一定量づつ接種し、その後の培養に
おける経時変化を観測した。観測は、一定時間毎にサン
プリングを行い、顕微鏡写真を撮り、これより菌糸長及
び分岐度を測定した。菌糸の分岐度は、菌糸の分岐間隔
の平均である。なお、培養はいずれも綿栓付き試験管
(直径11mm)中に、培地(酵母エキス0.03%、麦芽エキ
ス0.03%(以上Difco社製)、ポリプペトン0.05%(大
五栄養社製)、グルコース0.1%)を1mlづつ張り込み、
28℃、120strokes/minにて行った。
32時間後の菌糸長と分岐度は、第2表に示す通りであ
った。すなわち、デメチルアロサミジンの添加におい
て、菌糸長が明らかに増加しており、分岐度が減少して
いた。特に菌糸の先端において、分岐度の減少が顕著で
あった。
(4)デメチルアロサミジンの細胞毒性 (i)ダルベッコ改変MEM培地に10%の牛胎児血清を加
えた培地中に、マウス腹水乳ガン細胞FM3Aを1×105個/
ml存在させ、これにデメチルアロサミジンが1mg/mlにな
るように添加して37℃で4日間静置培養させた。
培養したマウス腹水乳ガン細胞FM3Aを顕微鏡で観察し
たが、生育阻害は全く認められなかった。
(ii)FRMI 1640培地に10%の牛胎児血清を加えた培地
中に、ヒト白血病細胞K562を1×105個/ml存在させ、こ
れにデメチルアロサミジンが1mg/mlになるように添加し
て37℃で4日間静置培養させた。
培養したヒト白血病細胞K562を顕微鏡で観察したが、
生育阻害は全く認められなかった。
〔発明の効果〕
本発明の化合物は真菌由来のキチナーゼに対する阻害
作用が極めて高い。従って、薬効の大きな抗真菌剤及び
キチナーゼ阻害剤を提供することができる。またこの化
合物は発酵生産されるところから容易に大量生産するこ
とが可能である。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の化合物の1H−NMRスペクトルを示す図
である。

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】下記式で表わされる化合物
  2. 【請求項2】請求項(1)に記載の化合物を有効成分と
    する抗真菌剤又はキチナーゼ阻害剤
  3. 【請求項3】ストレプトミセス属に属する請求項(1)
    に記載の化合物を生産する菌を培養して、培養物から当
    物質を採取することを特徴とする請求項(1)に記載の
    化合物の製法
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