JPH0358792A - デメチルアロサミジン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なア口サミン誘導体及びそれを有効成分
とする抗真菌剤又はキチナーゼ阻害剤に関する。

〔従来の技術〕

キチンは真菌類の細胞壁の主或分であり（Ｇ．Ｗ．Ｇｏ
ｏｄａｙ　　ａｎｄ　　Ａ．Ｔｒｉｎｃｉ，　　Ｓｙｍ
ｐｏｓｉａ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｓｏｃｉｅｔｙｆｏ
ｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　３
０，　２０７−２５１．　１９８０）、真菌が分裂・増
殖を繰り返す過程では、キチンの整合のとれた合或と分
解とが行われていると考えられている（Ｇ．ｌ＋Ｉ．　
Ｇｏｏｄａｙ　ｅｔ　ａｌ．　”Ｃｈｉｔｉｎ　ｉｎＮ
ａｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　ｐｐ８
３−９１，　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｒ．Ａ．　Ａ．　Ｍ
ｕｚｚａｒｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌｅｎｕｍ　
Ｐｒｅｓｓ．，　ＮｅｕＹｏｒｋ，　１９８６）。

一方、キチンは虫の表皮の主或分であり、昆虫が脱皮・
或長していく過程では、やはりキチンの合戒と分解とが
巧みに制御されていることが知られている（Ｋ．Ｊ，　
Ｋｒａｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓ　
ｉｖｅＩｎｓｅｃｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏ１ｏｇｙ
　　ｖｏｌ．３，　ｐ７５，　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｇ
．Ａ．Ｋｅｒｋｕｔ　ａｎｄ　Ｌ．Ｉ．Ｇｉｌｂｅｒｔ
，　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ＋１９８５）。

さて、このキチンの生合戒および分解の反応は、主にキ
チン合或酵素（キチンシンターゼ）およびキチン分解酵
素（キチナーゼ）という２種類の酵素により各々調節さ
れていることが知られている。

従って、これらの酵素の阻害剤は、新しいタイプの抗真
菌剤あるいは昆虫或長制御剤（殺虫剤）となりうること
か期待される。

実際に、このうちのキチンシンターゼに対する阻害剤の
一つであるポリオキシン（ｐｏｌｙｏｘｉｎ）は、農業
用抗真菌剤として実用化されており、又、ｉｎ　ｖｉｖ
ｏにおける昆虫の脱皮阻害作用も報告されている（Ｅ．
　Ｃｏｈｅｎ　ａｎｄ　Ｊ．　Ｅ．　Ｃａｓｈｉｄａ，
　Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．
，　１７，　３０１−３０６．　１９８２）。

一方、キチナーゼに対する阻害剤は、現在までにアロサ
呉ジン（ａｌｌｏｓａｍｉｄｉｎ）が発見されているの
みである（Ｓ．Ｓａｋｕｄａ　ａｔ　ａｌ．，　Ｊ．八
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．４０，　２９６−３００．　１
９８７）。アロザミジンは、昆虫由来のエンド型キチナ
ーゼを強力に阻害することから、殺虫、殺ダニ剤として
の開発が期待されている（特開昭６２　−　２０７２９
４号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、アロザミジンは真菌由来のキチナーゼに対して
は弱い阻害活性しか示さず、抗真菌剤としての開発は困
難と考えられた。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、真菌由来のキチナーゼに対する
阻害物質を天然物より広く検索した桔宋、ある種のアロ
ザざジン生産菌により生産される下記式（１）の化合物
が、極めて強い１９■害活性を示すことを見出した。

式（１）の化合物はアロサミジンの−Ｎ（ＣＩＩ３）ｚ
のメチル基が１個とれて−ＮＨＣｔ｛３に変っているほ
がはアロサごジンと同一の構造を有しているところから
デメチルアロサξジン（Ｄｅｍｅｔｈｙｌ　ａｌｌｏｓ
ａｍｉｄｊｎ）と命名された。

本発明のデメチルアロサごジンを生産する微生物として
はストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　　ｓｐ．）　　八Ｊ　　９４６３　　（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−１０６４２，　　ＦＥｌ？Ｍ　　ＢＰ２８０１
）が一例として挙げられる。この菌は放線菌の同定のた
めに使用されるＩＳＰ３培地で好気的に生育し、気菌糸
を形威し、胞子のうを形或せず、基生菌糸は形或するが
基生菌糸は分断しない。基菌糸は長い胞子鎖を形威する
。胞子柄は輪生しない。

細胞壁中にＬＬ−ジアミノピメリン酸を含有し、特徴的
な糖は存在せず、リン脂質はＰＩ型である。

以上の菌学的性質により、本菌株をストレプト句セス属
に属する１菌株ストレブトごセス・エスピ−　（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ＳＰ→　と同定した。

デメチルアロサ５ジンを製造するには、同物質生産菌、
例えばス１・レプトくセス・エスピーＦＥＲＭ　Ｐ−１
０６４２，　ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８０１を適当な培地に
培養し、その培養物から同物質を採取することにより行
われる。

培養方法は原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが
、通常は液体培地による深部培養が有利５ である。培養に用いられる培地としては、生産菌が利用
できる栄養源を含有するものであればよい。

すなわち、炭素源としてはグルコース、フラクトース、
澱粉、デキストリン等が用いられ、窒素源としては肉エ
キス、カゼイン、グルテン、酵母エキス、大豆粉、コー
ン・スティープ・リカー、尿素、硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム等が用いられる。このほか、例えばリ
ン酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウ
ム等の無機塩も必要に応じて用いることができる。培養
にあたり、発泡のはげしいときにはシリコン化合物、高
級アルコール、植物油等消泡剤を少量添加すればよい。

培養温度は２０〜３５゜Ｃが良く、特に２７゜Ｃ前後が
最も好ましい。培養時間はｌ〜１０日間程度が良いが、
培養条件により適宜変更することができる。

培養により生或したデメチルアロサミジンは主として菌
体内に蓄積されるので、一般には遠心分離、濾過等の手
段により分離した菌体から一般に抗生物質の単離に用い
られる手段によって分離、６ 精製される。例えば、メタノール、ｎ−ブタノール等低
級アルコールによる溶媒抽出法、シリカゲル、硅藻土、
アビセル、アルミナ等を使用する吸着カラムクロマトグ
ラフィー、トーヨーパールＨＷ４０（東洋曹達■製のゲ
ル濾過用担休）等を使用するゲル濾過法、各種イオン交
換クロマトグラフィー、オクタドデシル化（ＯＤＳ）さ
れたシリカゲルを担体とする逆相分配力ラムクロマトグ
ラフィー及びＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ、更には向流分配法、結晶
、再結晶等の精製手段を順次又は適宜組み合わせて行う
ことにより単離、精製ずることができる。

こうして、単離精製されたデメチルア口サミジンは、真
菌由来のキチナーゼに対し、強力な阻害活性を有してお
り、デメチルアロサミジン単位重量あたりの阻害活性は
、アロサ嵩ジンのそれと比較して１００倍程度強いもの
である。

また、デメチルアロサξジンは、フザリウム属をはしめ
とする各種真菌類の生育過程に影響を与え異常形態を引
き起こす。

一方、デメチルアロサミジンの細胞毒性は低く、マウス
腹水乳ガン細胞やヒト白血病細胞に対しては、これらの
培養液中にデメチルアロサミジン１■／ｄを添加しても
何ら生育阻害は認められなかった。

本発明のデメチルアロサミジンを抗真菌剤又はキチナー
ゼ阻害剤として利用する際には抗生物質等の一般の製剤
化手段を利用することができる。

形態も溶液、乳液、懸濁液、ペースト、粉末等のいずれ
であってもよい。

なお、デメチルアロサごジンを適当な条件下、例えば、
４Ｎ塩酸中１００゜Ｃで４時間加水分解することにより
、下記式を有する化合物デメチルアロサξゾリン（Ｄｅ
ｍｅｔｈｙｌａｌｌｏｓａｍｉｚｏｌｉｎｅ）が得られ
る。真菌のキチナーゼに対するデメチルアロサミジンと
アロサミジンの阻害活性の大きな違いは、この部分に由
来し、このものも抗真菌剤の合成原料として有用である
。

〔実施例〕

（１）デメチルアロサミジンの製造 グルコース（１２ｇ）、肉エキス（１．２ｇ）、ペプト
ン（２．４ｇ）、酵母エキス（１．２ｇ）及び水（１．
２／２）からなる培地（ｐ＋＋７．２）を調製し、５０
０ｍｆｆｉ容三角フラスコ１２本に１０　０　ｍｐ．ず
つ分注した。

１２０゜Ｃで２０分間滅菌したのち、ストレプトξセス
ＳＰ．　ＡＪ　９４６３（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０６４２，
　ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８０１）　の斜面培養菌体を１白
金耳ずつ接種し、２８゜Ｃで３日間振盪培養し、種母液
を得た。一方、上記組或の培地６０Ｉ！．を調製し、１
００Ｉ！．容培養タンクに注入し、１２０’Ｃで３０分
間滅菌した。これに、上記種母液１．２ｌを加え、２７
゜Ｃで５日間培養した。この時の撹拌速度は２０Ｏｒｐ
ｍ、通気速度は６０　１！．　／ｍｉｎであった。この
ようにして得られた培養物に、セライトを加えた後ヌッ
チェを用いて濾過し、菌体とセライトの混合物を得た。

これにメタノール（８Ｉ！．）を加え、よく撹拌した後
一晩静置した。これを濾過し、メタノール抽出液を得た
。これを約ＩＩ！．まで減圧濃縮した後、華留水を添加
し、全体の液量を６ｐ！にした。この全量を活性炭カラ
ム（６００ｍ容量）に吸着させ、蒸留水（１．８４２）
で洗った後、１０％エタノール（３℃）、２５％エタノ
ール（３ｌ）、５０％エタノール（３　ｊ２＞で順次溶
出した。活性は主として２５％エタノール溶出区に回収
された。この区分を約２ｌに減圧濃縮した後、酢酸を加
え、液のｐＨを３．８に調製した。この液を５０ｍＭ酢
酸アンモニウム／酢酸（ｐＨ　５．０）で平衡化したＳ
Ｐ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５陽イオン交換カラム（
１６０ｍ容量）に吸着させ、同緩衝液で一段階・溶出を
行い、８　ｍｌづつ分画した。各フラクションについて
、活性を測定し、比活性の弱いフラクションＮｏ．５　
５〜６４と、比活性の強いフラクションＮｏ．６　５〜
７５の２区分に分画した。このうちＮｏ５５〜６４の成
分は、ＦＡＢＭＳ，ＮＭＲ等の各種物理化学的性状から
アロサごジンであることが確認された。一方、Ｎｏ．６
　５〜７５の区分は、少量の活性炭により脱塩した後、
減圧濃縮し、次いで弱陽イオン交換カラムＡｓａｈ−ｉ
ｐａｋ　ＥＳ−５０２Ｃを用いた高速液体クロマトグラ
フィー（移動相；　１０ｍＭ酢酸アンモニウム／アンモ
ニア（ｐＨ８．９）、流速；　１．Ｏｍｊ！／ｍｉｎ）
１０ により精製した。２２０ｎｍの紫外部吸収により検出し
、保持時間（ｔＲ）　７．０分および８．８分の２つの
ピークを分取し凍結乾燥した。このうちｔＲ　８．８分
の物質は、各種物理化学的性状からアロザごジンである
ことが確認された。一方のｔＲ　７．０分の物質は、各
種イオン交換カラムを用いたＨＰＬＣ上で単一のピーク
を与え、下記の物理化学的諸性状から、式（１）で表さ
れるデメチルアロサξシンであることが確認された。

（１）外　観；白色粉末 （２）分子式ｉ　Ｃ２ａＨ４ｏＮａＯ１４（３）ＦＡＢ
ＭＳ　；　ｍ／ｚ　６０９　（Ｍ＋Ｈ）＋，グリセロー
ル・マトリックス （４）紫外線吸収スペクトル；末端吸収（０．ＩＮ酢酸
中）（５）　’Ｈ−ＮＭＲスペクトル；第１図に示す通
り（６００ＭＨｚ，　ＤｚＯ＋ＡｃＯＤ） （２）デメチルアロサミジンのキチナーゼ阻害活性の測
定 上記のようにして製造された、式（Ｉ）のデメチルアロ
サ主ジンは、真菌由来のキチナーゼに対し、強力な阻害
活性を有していた。

（ｉ）キチナーゼ酵素液の調製法 ２ｐ．の坂ロフラスコに０．１％ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ（
和光純薬）　ＸＯ．１％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａ
ｎｏｌを含む２５ｍＭＭＥＳ（半井化学薬品）緩衝液ｉ
ｆｆとパン酵母２００ｇ　（鐘淵化学工業）を入れ３０
゜Ｃ、１２０ｓｐｍで２時間振盪した。

遠心分離（０゜Ｃ、１０ｍｉｎ、１２．　ＯＯＯｇ）に
より菌体を除去、得られた」二清を限外濾過（ＴＯＹＯ
　ＵＬＴＲＡＦＩＬＴＥＩ？ＵＰ−２０）により２００
ｍＲまで濃縮した。濃縮後にクエン酸緩衝液（０．１５
Ｍクエン酸＋０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐｌ＋３
．０）　４００ｍｆｌを加え、生した沈澱を遠心分離（
０’Ｃ、１０ｍｉｎ、１２，　ＯＯＯｇ）により除いた
、上清を再び限外濾過（ＩＪＰ−２０）により４０蔵ま
で濃縮した。その濃縮液を４゜Ｃで保存しａｓｓａｙ時
のキチナーゼ酵素液として用いた。

（ｉ　ｉ）酵素基質の調製法 キトサン（ＰＦＡＮＳＴＩＥＩＩＬ　ＬＡＢＯＲＡＴＯ
ＲｒＥＳ　ＩＮＧ．）０．５ｇに１０％酢酸１０　ｍｌ
を徐々に加え、乳鉢で練り込みゲル状とした。室温で一
夜放置後、メタノール４５ｍｆｌをよくかき混ぜながら
加えた後、ガーゼで濾過し、得られた濾液に３■ラベル
の無水酢酸０．７５ｍｌ　（ＮＥＴ０１８Ａ１０　ＡＣ
ＥＴＩＣ　ＡＮＨＹＤＲＩＤＥ　５ｎ＋Ｃｉ）を加えた
。生威した寒天状のキチンをホモジナイザーですりつぶ
し、ガラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｂ）上
に集め、クエン酸緩衝液（ｐＨ　３　．０）　１０ｍＲ
に懸濁した。このキチン懸濁液（２．３μＣｉ／ｍ　ｃ
ｈｉｔｉｎ　ｓ−ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）をアッセイ時の
基質として用いた。

（　ｉｉｉ　）キチナーゼ阻害活性測定法エフペンドル
フチューブにキチナーゼ酵素液９０ｐＱ、３Ｈ−キチン
懸濁液１０ｐｉ！を入れ３７゜Ｃ、３時間反応させた。

この時ブランクとしては酵素液９０．ｉ！のかわりにク
エン酸緩衝液（ｐＨ　３．０）９０μｅを用いて同様に
反応した。反応後１０％トリクロロ酢酸１００ｐｆｆを
加え、その反応液をガラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ
ｎＧＦ／Ｂ）を通し、得られた濾液にシンチラント溶液
１０ｍＲを加えそのｒａｄｉｏ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　（
ｄｐｍ）を測定し、その値のブランクとの差をキチナー
ゼ活性とした。

シンチラント溶液はオムニフラワー（Ｏｍ−ｎｉｆｌｏ
ｕｒ）４ｇ（第一化学）をトルエン５００−に溶解した
ものにトリトンＸ−１００（半井化学薬品）５００ｍＮ
を加え調１３ 製した。

アロサ旦ジン、デメチルアロサミジン添加の際は、両方
とも０，ＩＮ酢酸溶液に溶かし、上記反応系にそれぞれ
の濃度のものを１０μｅづつ加えた。ブランク及び阻害
剤を加えないものにも０．ＩＮ酢酸１０μｅを加え上記
反応を行った。

阻害活性は下弐で計算した。

Ａ−Ｂ 阻害率（％）　一（　Ｔ）　ｘｌＯＯ Ａ；阻害剤を添加しない時のキチナーゼ活性（ｄｐｍ）
Ｂ；阻害剤を添加した時のキチナーゼ活性（ｄｐｍ）い
ずれの測定も３連で行い、その平均値を求めた。

（ｉｖ）測定結果 第１表に示す通りであった。

１４ 第１表 阻害率（％） 阻害剤なし デメチルアロサミジン 添加量　　０．８μｇ ０．４μｇ ０．２μｇ ０．１μｇ ０．０５μｇ ０ ８７．１ ８４．６ ７５．２ ７３．９ ６１．１ アロサミジン添加量　　　　４　μｇ　　　５８．５２
　μｇ　　　４７．６ ｌ　μｇ　　　３６．０ （３）デメチルアロサミジンの糸状菌の生育に及ぼす影
響 糸状菌の培養液にデメチルアロサξジンを添加し、その
影響を言周べた。

まず、フザリウム“ニハレ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｎｉｖ
ａｌｅ）八ＴＣＣ−４２３０８をＰＤＡ培地（日水製薬
社製）で前培養し、胞子を形威させた。これを、生理食
塩水に懸濁させ、滅菌した綿に通して、菌糸を含まない
胞子懸濁液を得た。

これを、デメチルアロサ案ジン（　０．８０μｇ　／　
ｍｌ　＋０．１６μｇ／ｄ）添加培地及びデメチルアロ
サミジン無添加の培地（コントロール）に一定量づつ接
種し、その後の培養における経時変化を観測した。

観測は、一定時間毎にサンプリングを行い、顕微鏡写真
を撮り、これより菌糸長及び分岐度を測定した。菌糸の
分岐度は、菌糸の分岐間隔の平均である。なお、培養は
いずれも綿栓付き試験管（直径１１ｍｍ）中に、培地（
酵母エキス０．０３％、麦芽エキス０．０３％（以上Ｄ
ｉｆｃｏ社製）、ポリペプトン０．０５％（大五栄養社
製）、グルコース０．１％）を１雌づつ張り込み、２８
゜Ｃ％　１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎにて行った。

３２時間後の菌糸長と分岐度は、第２表に示す通りであ
った。すなわち、デメチルアロサ５ジンの添加において
、菌糸長が明らかに増加しており、分岐度が減少してい
た。特に菌糸の先端において、分岐度の減少が顕著であ
った。

第２表 ０．８０　　　　　　　　　５７６　　　　　　　　７
４．２（４）デメチルアロサミジンの細胞毒性（ｉ）ダ
ルベッコ改変ＭＥＭ培地に１０％の牛胎児血清を加えた
培地中に、マウス腹水乳ガン細胞ＦＭ３Ａヲ１×１０５
個／ｍｆｌ存在させ、これにデメチルアロサミジンが１
　ｍｇ　／　ｍｌになるように添加して３７゜Ｃで４日
間静置培養させた。

培養したマウス腹水乳ガン細胞ＦＭ３Ａを顕微鏡で観察
したが、生育阻害は全く認められなかった。

（ｉｉ）　ＦＲＭＩ　１６４０培地に１０％の牛胎児血
清を加えた培地中に、ヒト白血病細胞Ｋ５６２を１×１
０５個７ｍｌ存在させ、これにデメチルアロサミジンが
１　ｍｇ　／　ｍＲになるように添加して３７゜Ｃで４
日間静置培養させた。

培養したヒト白血病細胞Ｋ５６２を顕微鏡で観察したが
、生育阻害は全く認められなかった。

〔発明の効果〕

本発明の化合物は真菌由来のキチナーゼに対する阻害作
用が極めて高い。従って、薬効の大きな抗真菌剤及びキ
チナーゼ阻害剤を提供することができる。またこの化合
物は発酵生産されるところから容易に大量生産すること
が可能である。

１７ ４

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の化合物のＪ＋ ＮＭＲスペクトルを 示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式で表わされる化合物 ▲数式、化学式、表等があります▼
2. （２）請求項（１）に記載の化合物を有効成分とする抗
   真菌剤又はキチナーゼ阻害剤
3. （３）ストレプトミセス属に属する請求項（１）に記載
   の化合物を生産する菌を培養して、培養物から当物質を
   採取することを特徴とする請求項（１）に記載の化合物
   の製法