JPH01101893A - Ｆｒ−６６９７９物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、抗菌活性や抗腫瘍活性を有する物質、即ち
、式 で示されるＦＲ−６６９７９物質（化学名：６゜９−ジ
ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−１４−オキサ−１
，１１−ジアザテトラシクロ［７゜４．１．０’・７．
０１０・１２］テトラゾカー２゜４．６−ドリエンー８
−イルメチルカルバメート）の発酵法に基づく製造方法
に関するものである。

［従来の技術］ ＦＲ−８６９７９物質は、特開昭６１−１０５９０号公
報において開示された公知の物質であり、次に示す様な
化学的合成法によって製造されるものであることが知ら
れている。即ち同公報第３８頁に記載された実施例１６
によると、式で示されるＦＲ−９００４１３２物質（化
学名＝４−ホルミル−６，９−ジヒドロキシ−１４−オ
キサ−１，１１−ジアザテトラシクロ［７，４゜１．０
２・７．０１０・＋２　］］テトラゾカー２．４．６−
ドリエンー８イルメチルカルバメート）を出発原料とし
、接触還元法によって４位のホルミル基を水添しヒドロ
キシメチル基に誘導する方法が開示されている。尚ここ
でＦＲ−９００４８２物質は、ストレプトミセス属に属
するＦＲ−９００４８２物質生産菌株（例えばストレプ
トミセス・サンジエンシスＮｏ。６８９７：微工研条寄
第７９２号）を培地中で培養することによって生産され
、抗腫瘍活性や抗菌活性等を有することが知られている
。

［発明の課題］ この発明の目的物質であるＦＲ−６６９７９物質を製造
する手段としては、前に述べた如く発酵法によってＦＲ
−９００４８２物買を得、次いでこれを化学的に接触還
元する方法しか知られていない。この様な２段工程を踏
む必要があるということは製造コストを高める要因とな
る。そこでもしＦＲ−６６９７９物買を発酵法によって
一段で製造することができれば経済的に有利であると考
えられた。

この様な観点に立って検討を開始したが、前に述べた様
にＦＲ−９００４８２物質は化学的に見てＦＲ−６６９
７９物質の前駆物質に相当することに注目し、ＦＲ−９
００４８２物質生産菌株を用いて培養することを試みた
結果、ＦＲ−６６９７９物貿が有効に生産されることを
確認し、この発明を完成するに至った。即ちＦＲ−９０
０４８２物質生産菌はＦＲ−６６９７９物質生産菌とし
ても有用であることが確かめられたのである。

［発明の構成］ この発明はＦＲ−６６９７９物質生産菌を培地に培養し
、得られる培養物からＦＲ−６６９７９物質を採取する
ことによって行なうことを要旨とするものである。尚Ｆ
Ｒ−６６９７９物貢は（Ｉ）式で示した様にその化学構
造式中に不斉炭素原子を有しているが、この不斉炭素原
子に基づく異性体もこの発明のＦＲ−６６９７９物質に
含まれる。

［発明の説明］ この発明で使用されるＦＲ−６６９７９物質生産菌の代
表例としては、例えば前述のストレプトミセス・サンジ
エンシスＮｏ。６８９７等が例示されるが、この菌株は
前に述べた様にＦＲ−９００４８２物質も生産する。し
かしＦＲ−９００４８２物質が生合成的にＦＲ−６６９
７９物質の前駆物質となるか否かについては未だ確認さ
れていない。従ってＦＲ−６６９７９物買生産菌は同時
にＦＲ−９００４８２物質生産菌となり得るものである
か否かは問わないものと解釈すべきである。尚ＦＲ−６
６９７９物質生産菌は上記例示された菌株に限定されず
、ストレプトミセス・サンダエンシスに属するものの他
、ＦＲ−６６９７９物貿を生産する全ての菌株を包含す
る。

また更に例えばＸ線、紫外線等の電磁波処理、或は例え
ばナイトロジエン・マスタード、アザセリン、亜硝酸、
２−アミノプリン、Ｎ−メチル−Ｎｏ−二トローＮ−二
トロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異誘起剤による処理
、ファージとの接触、形質転換、形質導入、細胞融合等
の通常用いられる菌株変異処理方法によって処理した菌
株を使用することも可能である。

この発明による培養方法の実施に当たっては、通常性な
われている培養技術およびその改良手段を適用すること
ができ、例えば深部培養や振どう培養等の好気的培養方
法が賞月される。培養に用いられる培地としては、例え
ばグルコース、でん粉、可溶性でん粉、肉エキス、カゼ
イン加水分解物、ペプトン、グルテンミール、綿実粕、
大豆粉、コーンステイープリカー、乾燥酵母、酵母工キ
ス、りん酸金属塩、硫酸金属塩等の栄養源を組み合せた
培地が利用される。

培地温度は３０℃前後が適当であり、培養時間は３０〜
１５０時間位が適当である。

培養物中に蓄積されたＦＲ−６６９７９物質は常法によ
り分離、採取、精製することができる。

［実施例］ 種培　および木Ｐ養 可溶性でんぷん　　　　　２．０％ グルコース　　　　　　　０．５％ 綿実粕　　　　　１．０％ 乾燥酵母　　　　　　　　０．５％ コーンステーブリカー　　０．５％ ＣａＣＯ３０，，２％ の組成からなる種培養培地（８０ｍｌ：　ｐＨ７，０）
を１６０ｍ１容量エルレンマイヤー・フラスコ４個に夫
々注入し、１２０℃で３０分間熱処理して滅菌した。

一方ストレプトミセス・サンダエンシスＮｏ。

６８９７を斜面培養しておき、その−白金耳を上記滅菌
培地の夫々に接種した。各フラスコを回転式振どう器（
振幅３インチ）を用いて、２００ｒｐｍの撹拌で３０℃
、７２時間の培養を行なった。

得られた種培養培地を合わせ、その全量（３２０ｍｌ）
を下記組成からなる本培養培地（２ａｉ：　ＰＨ４１，
２）に注入した。

可溶性でんぷん　　　８．０％ 乾燥酵母　　　　　　１．０％ 落花生粉　　　　　　３．０％ 大豆ミール　　　　　０．５％ 培養器としては３０ｆｔ容量のジャー・ファーメンタ−
を用い、これは予め１２０℃で３０分の熱処理により滅
菌しておいた。

本培養は２０１／分の通気量と２００　ｒｐｍの撹拌を
併行させつつ３１℃で９６時間行なった。

培養　産　から目・　　の　取 上記の様にして得られた本培養培地（１８ＪＺ）に２Ｎ
硫酸を加えてｐ）（３，０に調整した後、珪藻±（１，
４ｋｇ）を用いて濾過した。得られた濾液（Ｉ　Ｉｍ）
に２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを６．０に
調整し、ダイヤイオンＨＰ−２０［商ＰＡ：三菱化成工
業（株）製］（２，Ｏｊりを充填したカラムに通した。

このカラムを脱イオン水（２，０Ｊｌ）で洗浄した後、
５０％メタノール水（６，０ＩＬ）で溶出した。溶出液
を減圧濃縮してメタノールを留去し、残留液をイオン交
換樹脂アンバーライトＩＲＣ−５０［商標：ローム・ア
ンド・ハース社製、Ｈゝ型（２，Ｏｆ充填）］のカラム
に展開した。このカラムを脱イオン水（２，Ｏｆ）で洗
浄した後、０．ＩＮ塩酸（ａ、Ｏｎ）で溶出した。溶出
液を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中和し、次いで再び
ＨＰ−２０のカラム（２，０ＪＺ）に通した。このカラ
ムを脱イオン水（４Ａ）で洗浄してから５０％メタノー
ル水（ａ、０ｆｌ）で溶出した。活性成分′を含む画分
を集め、減圧下５０１１まで濃縮した後、凍結乾燥して
粉末を得た。この粉末をメタノール（５０ｍｌ）に溶解
し、シリカールＣＣ−４［商標：マリンクロット社製、
１００ｇ］と混合した後、ロータリー・エバポレーター
を用いてメタノールを留去した。残留混合物をクロロホ
ルムに懸濁させ、再びシリカールＣＣＣＣ−４（２００
のカラムに展開した。このカラムをクロロホルムとメタ
ノールの混液（５：１）で溶出した。

活性成分を含む画分を集めて減圧濃縮すると粗製粉末（
１，２ｇ）が得られた。この粗製粉末をメタノール（２
００１１）に溶解し、高速液体クロマトグラフィに展開
した。この展開操作に当たっては、ウォーターズ・モデ
ル６０００Ａポンプとウォーターズ・モデルＵ６にの注
入器を用いた。

クロマトグラフィ上のモニターはＵＶ検出器を用いて行
なった（使用波長２４０　ｎｍ）。ＹＭＣ−パック　Ｓ
−０４３［島久（株）製コの充填された鋼製カラムを用
いて５ＩＩｌｌＺ分の流速で展開し、移動相としてはメ
タノールとクロロホルムの混液（５：１）を用いた。上
記条件の下で高速液体クロマトグラフィを行なった結果
、活性画分（保持時間：２５〜３５分）が得られ、これ
を減圧濃縮すると、白色粉末状のＦＲ−６６９７９物質
（０，７ｇ）が得られた。本品は特開昭６１−１０５９
０号に開示された方法（ＦＲ−９００４８２物質の接触
還元）で得られたＦＲ−６６９７９物買と同定の結果、
同一物質であることが確認された。

抗菌活性 細菌用ブイヨンを用い、段階希釈検定法によって各種細
菌に対するＦＲ−６６９７９物質の抗菌活性を調べた。

３７℃で一夜培養後の最小発育阻止濃度（ＭｒＣ）を求
めたところ、ＦＲ−６６９７９物質は各種の病原性微生
物に対して抗菌活性を示すことが分かった。代表菌種に
対するＭＩＣ（μｇ／ｍｌ）は下記の通りである。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ且匹紅匣二ＮＣＴ（ニー１０４
９０　１２．５製造できることとなった。

瘍移植７日後にハンクス溶液を使って希釈腹水から調製
し、低温下（４℃）　１０００ｒｐｍ　、　５分間の遠
心分離に付した。遠心分離された腫瘍細胞を、１０％子
牛脂児血清、ペニシリンＧ（６０μｇ／ｍｌ）およびス
トレプトマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を補充したＭＥＭ
ダルベツコ培地中に加え細胞濃度が２．５Ｘ１０’個／
ｍｌとなる様に腫瘍細胞液を調製した。

次にこの細胞を各種濃度に調製されたＦＲ−６６９７９
物質によって処理した。処理はプラスチック製組織培養
皿を用い、５％ＣＯ２の？Ｘ温潤雰囲気下７℃で７２時
間インキュベートすることによって行なった。薬物濃度
の対数値と処理細胞の増殖率をグラフ上にプロットする
ことによって細胞増殖５０％阻止（ＩＣ，。＝μｇ／ｍ
ｌ）に必要な物質濃度を求めた。その結果ＦＲ−６６９
７９物質のＩＣ，。値はｏ、？３μｇ／ｍｌであった。

［発明の効果］

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＦＲ−６６９７９物質生産菌を培地に培養し、得
   られる培養物からＦＲ−６６９７９物質を採取すること
   を特徴とするＦＲ−６６９７９物質の製造法。
2. （２）ＦＲ−６６９７９物質生産菌がストレプトミセス
   ・サンダエンシスに属する微生物である特許請求の範囲
   第１項に記載の製造法。
3. （３）ＦＲ−６６９７９物質生産菌がストレプトミセス
   ・サンダエンシスＮｏ．６８９７またはその変異菌であ
   る特許請求の範囲第２項に記載の製造法。