JP2891023B2 - ランチオニン含有物の製造方法 - Google Patents
ランチオニン含有物の製造方法Info
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- JP2891023B2 JP2891023B2 JP4838593A JP4838593A JP2891023B2 JP 2891023 B2 JP2891023 B2 JP 2891023B2 JP 4838593 A JP4838593 A JP 4838593A JP 4838593 A JP4838593 A JP 4838593A JP 2891023 B2 JP2891023 B2 JP 2891023B2
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- streptomyces
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はランチオニン含有物の製
造方法に関し、詳しくはランチオニン、メチルランチオ
ニンを含むランチオニン含有ペプチドの製造方法に関す
る。
造方法に関し、詳しくはランチオニン、メチルランチオ
ニンを含むランチオニン含有ペプチドの製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ランチオニン（S-(2-アミノ-2-カルホ゛キシエチル)-
L-システイン）やメチルランチオニンを含むランチオニン含
有ペプチドは、微生物による発酵生産物として産生さ
れ、抗菌活性、抗ウイルス活性、免疫増強作用、酵素阻
害活性等、多様な生物活性を持つものが多く、“Lantib
iotic ”の名で総称される有用物質である。
L-システイン）やメチルランチオニンを含むランチオニン含
有ペプチドは、微生物による発酵生産物として産生さ
れ、抗菌活性、抗ウイルス活性、免疫増強作用、酵素阻
害活性等、多様な生物活性を持つものが多く、“Lantib
iotic ”の名で総称される有用物質である。
【０００３】このようなランチオニン含有物質として、
ストレプトコッカス ラクティス（Streptococcus lact
is）の生産する抗生物質ナイシンが知られている。ナイ
シンは、最初に発見され、構造決定されたランチオニン
含有抗生物質であり、構造食品保存剤等としてヨーロッ
パなどで広く用いられている。
ストレプトコッカス ラクティス（Streptococcus lact
is）の生産する抗生物質ナイシンが知られている。ナイ
シンは、最初に発見され、構造決定されたランチオニン
含有抗生物質であり、構造食品保存剤等としてヨーロッ
パなどで広く用いられている。
【０００４】このように、ランチオニン含有ペプチド
は、その有用性のため注目を集めているが、多くのもの
は微生物の発酵生産性の低さから大量供給は難しい。ま
た、化学合成によるランチオニン含有ペプチドの製造方
法の検討も、ナイシンでなされているが（Bulletin of
the Chemical Society of Japan, Vol.65 pp2227, 199
2、 Tetrahedron Letters Vol.29 pp.795, 1988）、そ
の工程の複雑さと収量において満足できるものとはいえ
ない。さらに他のペプチドについては合成された報告は
ない。その理由は、ランチオニン環形成反応、もしくは
これらのペプチドの中によく認められるデヒドロアミノ
酸を含むペプチドの合成には困難な点が多く、固相合成
法はもちろんのこと、液相での合成でも多くの制限があ
り、化学合成がきわめて難しいためである。
は、その有用性のため注目を集めているが、多くのもの
は微生物の発酵生産性の低さから大量供給は難しい。ま
た、化学合成によるランチオニン含有ペプチドの製造方
法の検討も、ナイシンでなされているが（Bulletin of
the Chemical Society of Japan, Vol.65 pp2227, 199
2、 Tetrahedron Letters Vol.29 pp.795, 1988）、そ
の工程の複雑さと収量において満足できるものとはいえ
ない。さらに他のペプチドについては合成された報告は
ない。その理由は、ランチオニン環形成反応、もしくは
これらのペプチドの中によく認められるデヒドロアミノ
酸を含むペプチドの合成には困難な点が多く、固相合成
法はもちろんのこと、液相での合成でも多くの制限があ
り、化学合成がきわめて難しいためである。
【０００５】一方、ナイシンについてはその生合成機構
が推定されている（The Journal of Biological Chemist
ry Vol.263 pp.16260, 1988）。これは、ナイシンを分
泌生産する微生物菌体中に、リーダー部が結合したナイ
シンのプロペプチドが生成された後、多機能酵素でまず
脱水反応がおこり、セリンもしくはスレオニン残基がデ
ヒドロアミノ酸になり、次に生成したデヒドロアミノ酸
へ分子内のシステイン残基のチオール基が付加して分子
内スルフィド結合すなわちランチオニン残基が形成さ
れ、最後にリーダーペプチドがプロセッシングを受けて
目的のランチオニンペプチドとなるというものである
（図１参照）。
が推定されている（The Journal of Biological Chemist
ry Vol.263 pp.16260, 1988）。これは、ナイシンを分
泌生産する微生物菌体中に、リーダー部が結合したナイ
シンのプロペプチドが生成された後、多機能酵素でまず
脱水反応がおこり、セリンもしくはスレオニン残基がデ
ヒドロアミノ酸になり、次に生成したデヒドロアミノ酸
へ分子内のシステイン残基のチオール基が付加して分子
内スルフィド結合すなわちランチオニン残基が形成さ
れ、最後にリーダーペプチドがプロセッシングを受けて
目的のランチオニンペプチドとなるというものである
（図１参照）。
【０００６】しかしながら、このランチオニン生成反応
は、ナイシンのプロペプチドに限られたものであり、汎
用性のあるランチオニン含有ペプチドの製造方法として
応用できるものではない。
は、ナイシンのプロペプチドに限られたものであり、汎
用性のあるランチオニン含有ペプチドの製造方法として
応用できるものではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記観点から
なされたものであり、特定のペプチドに限らず、広い範
囲のランチオニン含有ペプチドを得ることを目的とし、
汎用性の高いランチオニン含有物の製造方法を提供する
ことを課題とする。
なされたものであり、特定のペプチドに限らず、広い範
囲のランチオニン含有ペプチドを得ることを目的とし、
汎用性の高いランチオニン含有物の製造方法を提供する
ことを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ペプチド鎖内
のシステイン残基とセリン残基からランチオニンを、又
はシステイン残基とスレオニン残基からメチルランチオ
ニンを、ランチオニン環形成反応により生成する能力を
有する微生物を検索し、その微生物の培養物、あるいは
その微生物より分離した微生物菌体又は菌体の処理物
を、ペプチド又はポリペプチドに作用させると、ペプチ
ド鎖内にランチオニンやメチルランチオニンが生成し、
ランチオニン含有物が得られることを見出し、本発明を
完成させるに至った。
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ペプチド鎖内
のシステイン残基とセリン残基からランチオニンを、又
はシステイン残基とスレオニン残基からメチルランチオ
ニンを、ランチオニン環形成反応により生成する能力を
有する微生物を検索し、その微生物の培養物、あるいは
その微生物より分離した微生物菌体又は菌体の処理物
を、ペプチド又はポリペプチドに作用させると、ペプチ
ド鎖内にランチオニンやメチルランチオニンが生成し、
ランチオニン含有物が得られることを見出し、本発明を
完成させるに至った。
【０００９】すなわち本発明は、ペプチド鎖内のシステ
イン残基とセリン残基からランチオニンを、またはシス
テイン残基とスレオニン残基からメチルランチオニン
を、各々ランチオニン環形成反応により生成させる能力
を有し、ミコバクテリウム（Mycobacterim）属、ノカル
ディア（Nocardia）属、ノカルディオイデス（Nocardio
ides）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ストレプ
トマイセス（Streptomyces）属、またはストレプトバー
ティシラム（Streptoverticillium）属に属する微生物
の培養物又はこの培養物より分離した微生物菌体もしく
はその菌体の処理物を、システイン残基とセリン残基、
又はシステイン残基とスレオニン残基を有するペプチド
と共存させ、前記ペプチド鎖内にランチオニンもしくは
メチルランチオニン、またはランチオニン及びメチルラ
ンチオニンを生成させることを特徴とするランチオニン
含有物の製造方法である。
イン残基とセリン残基からランチオニンを、またはシス
テイン残基とスレオニン残基からメチルランチオニン
を、各々ランチオニン環形成反応により生成させる能力
を有し、ミコバクテリウム（Mycobacterim）属、ノカル
ディア（Nocardia）属、ノカルディオイデス（Nocardio
ides）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ストレプ
トマイセス（Streptomyces）属、またはストレプトバー
ティシラム（Streptoverticillium）属に属する微生物
の培養物又はこの培養物より分離した微生物菌体もしく
はその菌体の処理物を、システイン残基とセリン残基、
又はシステイン残基とスレオニン残基を有するペプチド
と共存させ、前記ペプチド鎖内にランチオニンもしくは
メチルランチオニン、またはランチオニン及びメチルラ
ンチオニンを生成させることを特徴とするランチオニン
含有物の製造方法である。
【００１０】尚、本明細書において、「ペプチド」とは
ペプチド又はポリペプチドをいい、タンパクを含むこと
があり、さらに、これらを「基質」ということがある。
また、「ランチオニン」とは、ランチオニンもしくはメ
チルランチオニン、またはランチオニン及びメチルラン
チオニンの両方をいうことがある。また、ランチオニン
もしくはメチルランチオニン、またはランチオニン及び
メチルランチオニンの両方を鎖内に有するペプチド、ポ
リペプチド、又はタンパクをランチオニン含有物とい
う。以下、本発明を詳細に説明する。
ペプチド又はポリペプチドをいい、タンパクを含むこと
があり、さらに、これらを「基質」ということがある。
また、「ランチオニン」とは、ランチオニンもしくはメ
チルランチオニン、またはランチオニン及びメチルラン
チオニンの両方をいうことがある。また、ランチオニン
もしくはメチルランチオニン、またはランチオニン及び
メチルランチオニンの両方を鎖内に有するペプチド、ポ
リペプチド、又はタンパクをランチオニン含有物とい
う。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】＜１＞本発明に用いる微生物 本発明に使用する微生物としては、ペプチド鎖内のシス
テイン残基とセリン残基からランチオニンを、又はシス
テイン残基とスレオニン残基からメチルランチオニン
を、それぞれランチオニン環形成反応により生成する能
力を有する微生物であればいずれでもよい。また、ラン
チオニン及びメチルランチオニンの両方を生成する能力
を有するものであってもよい。本発明の微生物として具
体的にはミコバクテリウム（Mycobacterim）属、ノカル
ディア（Nocardia）属、ノカルディオイデス（Nocardio
ides）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ストレプ
トマイセス（Streptomyces）属、またはストレプトバー
ティシラム（Streptoverticillium）属に属する微生物
が挙げられる。より具体的には、例えば以下のような細
菌が挙げられる。尚、下記菌株は例示であり、他の保存
菌株等も使用することができる。
テイン残基とセリン残基からランチオニンを、又はシス
テイン残基とスレオニン残基からメチルランチオニン
を、それぞれランチオニン環形成反応により生成する能
力を有する微生物であればいずれでもよい。また、ラン
チオニン及びメチルランチオニンの両方を生成する能力
を有するものであってもよい。本発明の微生物として具
体的にはミコバクテリウム（Mycobacterim）属、ノカル
ディア（Nocardia）属、ノカルディオイデス（Nocardio
ides）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ストレプ
トマイセス（Streptomyces）属、またはストレプトバー
ティシラム（Streptoverticillium）属に属する微生物
が挙げられる。より具体的には、例えば以下のような細
菌が挙げられる。尚、下記菌株は例示であり、他の保存
菌株等も使用することができる。
【００１２】ミコハ゛クテリウム フィレイ (Mycobacterium phlei) IFO3158ノカルテ゛ィア アステオイテ゛ス (Nocardia asteroides) IFO3384ノカルテ゛ィオイテ゛ス アルフ゛ス (Nocardioides albus) IFO13917ロト゛コッカス エリスロホ゜リス (Rhodococcus erythropolis) IFO12
538ストレフ゜トマイセス ク゛リセオラス (Streptomyces griseolus) IFO34
15ストレフ゜トハ゛ーティシラム ケンタッケンス (Streptoverticillium kentu
ckense) IFO12880ストレフ゜トマイセス イェレハ゛ネンシス (Streptomyces yerevanensis)
IFO12517ストレフ゜トマイセス スカヒ゛ース (Streptomyces scabies） IFO3111
538ストレフ゜トマイセス ク゛リセオラス (Streptomyces griseolus) IFO34
15ストレフ゜トハ゛ーティシラム ケンタッケンス (Streptoverticillium kentu
ckense) IFO12880ストレフ゜トマイセス イェレハ゛ネンシス (Streptomyces yerevanensis)
IFO12517ストレフ゜トマイセス スカヒ゛ース (Streptomyces scabies） IFO3111
【００１３】本発明に用いる微生物を培養するための培
地は、その微生物が増殖し得るものであれば特に制限は
ない。例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素
等を含有する通常の培地を使用することができる。
地は、その微生物が増殖し得るものであれば特に制限は
ない。例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素
等を含有する通常の培地を使用することができる。
【００１４】上記炭素源としては、上記微生物が利用可
能であればいずれも使用でき、例えばグルコース、フル
クトース、シュークロース、デキストリン等の糖類、ソ
ルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール
類、フマール酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有
機酸類及びその塩類、パラフィン等の炭化水素類が挙げ
られ、これらの任意の混合物も使用することができる。
能であればいずれも使用でき、例えばグルコース、フル
クトース、シュークロース、デキストリン等の糖類、ソ
ルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール
類、フマール酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有
機酸類及びその塩類、パラフィン等の炭化水素類が挙げ
られ、これらの任意の混合物も使用することができる。
【００１５】また、上記窒素源としては、例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム等の無機塩のアンモニウ
ム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等
の有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリ
ウム等の硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コ
ーンスティープリカー等の有機窒素化合物が挙げられ、
これらの任意の混合物も使用することができる。
ンモニウム、塩化アンモニウム等の無機塩のアンモニウ
ム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等
の有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリ
ウム等の硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コ
ーンスティープリカー等の有機窒素化合物が挙げられ、
これらの任意の混合物も使用することができる。
【００１６】他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類等、
通常の培養に用いられる栄養源を適宜、混合して用いる
ことができる。また必要に応じて微生物の増殖を促進す
る因子、本発明の目的化合物の生成能力を高める因子、
あるいは培地のｐＨ保持に有効な物質も添加できる。
通常の培養に用いられる栄養源を適宜、混合して用いる
ことができる。また必要に応じて微生物の増殖を促進す
る因子、本発明の目的化合物の生成能力を高める因子、
あるいは培地のｐＨ保持に有効な物質も添加できる。
【００１７】培養条件としては、培地のｐＨは３．０〜
９．５、好ましくは４〜８、培養温度は２０〜４５℃、
好ましくは２５〜３７℃で、嫌気的あるいは好気的に、
その微生物の生育に適した条件下で５〜１２０時間、好
ましくは１２〜７２時間程度培養する。
９．５、好ましくは４〜８、培養温度は２０〜４５℃、
好ましくは２５〜３７℃で、嫌気的あるいは好気的に、
その微生物の生育に適した条件下で５〜１２０時間、好
ましくは１２〜７２時間程度培養する。
【００１８】 ＜２＞本発明のランチオニン含有物の製造方法 本発明のランチオニン含有物の製造方法は、上記微生物
の培養物、該微生物より分離した微生物菌体又は該微生
物菌体の処理物とランチオニンを導入しようとするペプ
チドとを共存させることを特徴とする。こうすることに
より、上記微生物が生産するランチオニン生成を触媒す
る酵素がペプチドに作用し、ランチオニン環形成反応に
よりランチオニン生成反応が起きる。すなわち、ペプチ
ド鎖内のシステイン残基とセリン残基からランチオニン
が、システイン残基とスレオニン残基からメチルランチ
オニンが生成する。
の培養物、該微生物より分離した微生物菌体又は該微生
物菌体の処理物とランチオニンを導入しようとするペプ
チドとを共存させることを特徴とする。こうすることに
より、上記微生物が生産するランチオニン生成を触媒す
る酵素がペプチドに作用し、ランチオニン環形成反応に
よりランチオニン生成反応が起きる。すなわち、ペプチ
ド鎖内のシステイン残基とセリン残基からランチオニン
が、システイン残基とスレオニン残基からメチルランチ
オニンが生成する。
【００１９】本発明の方法として、具体的には上記微生
物の培養物にそのまま、基質であるペプチドを添加して
反応させる方法、遠心分離や濾過等により菌体を分離
し、これをそのままもしくは洗浄した後、緩衝液、水等
に再懸濁したものにペプチドを添加して反応させる方法
が挙げられる。
物の培養物にそのまま、基質であるペプチドを添加して
反応させる方法、遠心分離や濾過等により菌体を分離
し、これをそのままもしくは洗浄した後、緩衝液、水等
に再懸濁したものにペプチドを添加して反応させる方法
が挙げられる。
【００２０】また、ランチオニン生成反応は、菌体内の
酵素によって触媒されると考えられるので、菌体にアセ
トン処理等の処理をほどこしたもの、あるいは菌体破砕
物を用いることが好ましい。さらに、これらの菌体、あ
るいは菌体処理物から、公知の方法を組み合わせて精製
取得した酵素を使用してもよい。
酵素によって触媒されると考えられるので、菌体にアセ
トン処理等の処理をほどこしたもの、あるいは菌体破砕
物を用いることが好ましい。さらに、これらの菌体、あ
るいは菌体処理物から、公知の方法を組み合わせて精製
取得した酵素を使用してもよい。
【００２１】上記反応は、ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ
５〜８、温度は通常１０〜６０℃、好ましくは２０〜４
０℃の範囲で、培養液、緩衝液あるいは水中で、撹拌下
あるいは静置下で、１〜１２０時間程度行う。基質の使
用濃度は特に制限されないが、０．１〜１０％程度が好
ましい。また、反応液中にリン酸ピリドキシンを添加す
ることによって、反応がさらに効率良く進行する場合が
ある。
５〜８、温度は通常１０〜６０℃、好ましくは２０〜４
０℃の範囲で、培養液、緩衝液あるいは水中で、撹拌下
あるいは静置下で、１〜１２０時間程度行う。基質の使
用濃度は特に制限されないが、０．１〜１０％程度が好
ましい。また、反応液中にリン酸ピリドキシンを添加す
ることによって、反応がさらに効率良く進行する場合が
ある。
【００２２】また、上記のように菌体等あるいは酵素を
溶液に懸濁あるいは溶解した状態で反応を行うことがで
きるが、菌体等あるいは酵素を不溶性担体に固定化した
ものを使用することも可能である。この固定化は、ポリ
アクリルアミドゲル等に包括する方法、イオン交換樹脂
に吸着させる方法等一般に菌体や酵素の固定化に使用さ
れる方法により行うことができる。
溶液に懸濁あるいは溶解した状態で反応を行うことがで
きるが、菌体等あるいは酵素を不溶性担体に固定化した
ものを使用することも可能である。この固定化は、ポリ
アクリルアミドゲル等に包括する方法、イオン交換樹脂
に吸着させる方法等一般に菌体や酵素の固定化に使用さ
れる方法により行うことができる。
【００２３】基質は、ペプチド鎖内にシステイン残基と
セリン残基、またはシステイン残基とスレオニン残基を
含むものであればどのようなものも利用できる。また、
鎖内にシステイン残基とセリン残基、またはシステイン
残基とスレオニン残基を含むものであればタンパクを用
いても差し支えない。
セリン残基、またはシステイン残基とスレオニン残基を
含むものであればどのようなものも利用できる。また、
鎖内にシステイン残基とセリン残基、またはシステイン
残基とスレオニン残基を含むものであればタンパクを用
いても差し支えない。
【００２４】得られたランチオニン含有物は、イオン交
換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマトグラフィー
等により精製することができる。
換クロマトグラフィーもしくは逆相クロマトグラフィー
等により精製することができる。
【００２５】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。始めに、
後記実施例で使用した微生物（菌体破砕物）と基質の調
製、ランチオニン生成反応とその分析法について説明す
る。
後記実施例で使用した微生物（菌体破砕物）と基質の調
製、ランチオニン生成反応とその分析法について説明す
る。
【００２６】＜１＞ ミコバクテリウム フィレイ（Mycobacterium phlei）
ＩＦＯ３１５８、ノカルディア アステオイデス（Noca
rdia asteoides）ＩＦＯ３３８４、ノカルディオイデス
アルブス（Nocardioides albus）ＩＦＯ１３９１７、
ロドコッカスエリスロポリス（Rhodococcus erythropol
is）ＩＦＯ１２５３８、ストレプトマイセス グリセオ
ラス（Streptomyces griseolus）ＩＦＯ３４１５、スト
レプトバーティシラム ケンタッケンス（Streptoverti
cullium kentuckense）ＩＦＯ１２８８０、ストレプト
マイセス イェレバネンシス（Streptomyces yerevanen
sis）ＩＦＯ１２５１７、ストレプトマイセス スカビ
ース（Streptomyces scabies）ＩＦＯ３１１１を、表２
の組成の培地で培養し、菌体破砕物を調製した。
ＩＦＯ３１５８、ノカルディア アステオイデス（Noca
rdia asteoides）ＩＦＯ３３８４、ノカルディオイデス
アルブス（Nocardioides albus）ＩＦＯ１３９１７、
ロドコッカスエリスロポリス（Rhodococcus erythropol
is）ＩＦＯ１２５３８、ストレプトマイセス グリセオ
ラス（Streptomyces griseolus）ＩＦＯ３４１５、スト
レプトバーティシラム ケンタッケンス（Streptoverti
cullium kentuckense）ＩＦＯ１２８８０、ストレプト
マイセス イェレバネンシス（Streptomyces yerevanen
sis）ＩＦＯ１２５１７、ストレプトマイセス スカビ
ース（Streptomyces scabies）ＩＦＯ３１１１を、表２
の組成の培地で培養し、菌体破砕物を調製した。
【００２７】上記の各細菌を、Ｂ培地（７ｍｌ／試験
管）で２８℃、４８時間振盪培養し、各培養液をＡ培地
１００ｍｌ（５００ｍｌ容坂口フラスコ）に各々接種
し、２８℃で４８時間振盪培養した。培養後、培養液を
遠心分離（４℃、８０００ｒｐｍ、２０分）により菌体
を集め、４０ｍｌの生理食塩水で洗浄した。洗浄菌体を
再び遠心により集菌し、菌体に５０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０、０．１ｍＭジチオスレイトール含
有）を４ｍｌ加え、菌体懸濁液とした。
管）で２８℃、４８時間振盪培養し、各培養液をＡ培地
１００ｍｌ（５００ｍｌ容坂口フラスコ）に各々接種
し、２８℃で４８時間振盪培養した。培養後、培養液を
遠心分離（４℃、８０００ｒｐｍ、２０分）により菌体
を集め、４０ｍｌの生理食塩水で洗浄した。洗浄菌体を
再び遠心により集菌し、菌体に５０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０、０．１ｍＭジチオスレイトール含
有）を４ｍｌ加え、菌体懸濁液とした。
【００２８】次に、菌体懸濁液を、超音波破砕装置（Ku
bota Insonator 201M型）によって、菌体を破砕した
（４℃、２００Ｗ、３０ｍｉｎ．）。破砕後、遠心分離
（４℃、１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ．）により上清
を得、これを菌体破砕処理物（酵素抽出液）とした。
bota Insonator 201M型）によって、菌体を破砕した
（４℃、２００Ｗ、３０ｍｉｎ．）。破砕後、遠心分離
（４℃、１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ．）により上清
を得、これを菌体破砕処理物（酵素抽出液）とした。
【００２９】
【表１】
【００３０】＜２＞基質の調製 ペプチド鎖内にシステイン残基と、セリン残基及び／又
はスレオニン残基を有するペプチドを、t-Boc（tert−
ブトキシカルボニル基）法による固相合成により合成し
た。Applied Biosystem社製４３０Ａ型ペプチド自動合
成装置を用い、合成機に組み込まれているソフトウエア
の合成手順（Ｃ端末から始めてＮ端末に向けて行なわれ
る）に従って、ペプチド研究所製Bocアミノ酸誘導体を
原料に用い、保護ペプチド−樹脂結合体として基質を調
製した。
はスレオニン残基を有するペプチドを、t-Boc（tert−
ブトキシカルボニル基）法による固相合成により合成し
た。Applied Biosystem社製４３０Ａ型ペプチド自動合
成装置を用い、合成機に組み込まれているソフトウエア
の合成手順（Ｃ端末から始めてＮ端末に向けて行なわれ
る）に従って、ペプチド研究所製Bocアミノ酸誘導体を
原料に用い、保護ペプチド−樹脂結合体として基質を調
製した。
【００３１】合成された保護ペプチド−樹脂結合体にｐ
−クレゾールを加え、フッ化水素（ＨＦ）処理装置にセ
ットした後、−２〜−５℃、６０分の処理を行い、固相
樹脂からのペプチドの切り出しと同時に各アミノ酸の全
保護基の除去操作を行なった。反応後、ＨＦを減圧下に
留去した後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて粗ペ
プチドを抽出し、この抽出液から樹脂を濾別した後、濃
縮し、さらにエーテルを加えて粉末とした。
−クレゾールを加え、フッ化水素（ＨＦ）処理装置にセ
ットした後、−２〜−５℃、６０分の処理を行い、固相
樹脂からのペプチドの切り出しと同時に各アミノ酸の全
保護基の除去操作を行なった。反応後、ＨＦを減圧下に
留去した後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて粗ペ
プチドを抽出し、この抽出液から樹脂を濾別した後、濃
縮し、さらにエーテルを加えて粉末とした。
【００３２】得られたチオール遊離の粗ペプチドを酢酸
アンモニウム緩衝液に溶解し、ジチオスレイトールを加
えてペプチド中のチオールを遊離させ、チオールが完全
に遊離されていることを確認後、高速液体クロマトグラ
フィー（カラム：ＹＭＣ ＳＨ−３６３−５ ｓ−５
１２０Ａ ＯＤＳ、溶離条件：０．１％ＴＦＡ含有１０
％アセトニトリル水溶液から０．１％ＴＦＡ含有６０％
アセトニトリル水溶液の直線濃度勾配法による溶出、流
速：２０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：波長２２０ｎｍにおける
紫外部吸収を測定）により、目的とするペプチドを精製
分取した。
アンモニウム緩衝液に溶解し、ジチオスレイトールを加
えてペプチド中のチオールを遊離させ、チオールが完全
に遊離されていることを確認後、高速液体クロマトグラ
フィー（カラム：ＹＭＣ ＳＨ−３６３−５ ｓ−５
１２０Ａ ＯＤＳ、溶離条件：０．１％ＴＦＡ含有１０
％アセトニトリル水溶液から０．１％ＴＦＡ含有６０％
アセトニトリル水溶液の直線濃度勾配法による溶出、流
速：２０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：波長２２０ｎｍにおける
紫外部吸収を測定）により、目的とするペプチドを精製
分取した。
【００３３】このようにして調製した５種類の基質をペ
プチド１〜５とし、アミノ酸配列を各々配列表配列番号
１〜５に示す。
プチド１〜５とし、アミノ酸配列を各々配列表配列番号
１〜５に示す。
【００３４】＜３＞ランチオニン生成反応とその分析法 上記で得られたペプチドを基質として、表２に示す組成
の反応液中で３７℃、１０時間、振盪することにより、
ランチオニン又はメチルランチオニン生成反応を行なっ
た。
の反応液中で３７℃、１０時間、振盪することにより、
ランチオニン又はメチルランチオニン生成反応を行なっ
た。
【００３５】
【表２】
【００３６】反応終了後、９５℃、２分の加熱処理によ
り反応を停止させ、反応液を１２０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、上清と沈殿とに分離させた。この沈殿に、
２００μｌの０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）を添加した後、再び遠心分離によって上清（洗滌
液）と沈殿とを分離し、得られた上清を凍結乾燥した。
り反応を停止させ、反応液を１２０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、上清と沈殿とに分離させた。この沈殿に、
２００μｌの０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）を添加した後、再び遠心分離によって上清（洗滌
液）と沈殿とを分離し、得られた上清を凍結乾燥した。
【００３７】乾燥物に６Ｎ塩酸（２００μｌ）を加え
て、封管中１１０℃、４８時間加水分解を行ない、これ
を高速液体クロマトグラフィーによるアミノ酸分析に供
することによってランチオニン並びにメチルランチオニ
ンの生成量を定量した。アミノ酸分析の条件は表３の通
りである。
て、封管中１１０℃、４８時間加水分解を行ない、これ
を高速液体クロマトグラフィーによるアミノ酸分析に供
することによってランチオニン並びにメチルランチオニ
ンの生成量を定量した。アミノ酸分析の条件は表３の通
りである。
【００３８】
【表３】
【００３９】
【実施例１】前記＜１＞で得られた菌体破砕処理物を用
い、合成ペプチドを基質として上記方法でランチオニン
又はメチルランチオニン生成反応を行ない、生成したラ
ンチオニン並びにメチルランチオニンを定量した。基質
はノカルディア アステオイデスについてはペプチド２
を、ストレプトマイセス イェレバネンシスについては
ペプチド４を、その他の菌株についてはペプチド１を用
いた。結果を表４に示す。尚、基質を加えずに反応を行
った場合は、ランチオニン及びメチルランチオニンの生
成は認められなかった。
い、合成ペプチドを基質として上記方法でランチオニン
又はメチルランチオニン生成反応を行ない、生成したラ
ンチオニン並びにメチルランチオニンを定量した。基質
はノカルディア アステオイデスについてはペプチド２
を、ストレプトマイセス イェレバネンシスについては
ペプチド４を、その他の菌株についてはペプチド１を用
いた。結果を表４に示す。尚、基質を加えずに反応を行
った場合は、ランチオニン及びメチルランチオニンの生
成は認められなかった。
【００４０】
【表４】
【００４１】この結果から明らかなように、表４に示し
た微生物の菌体破砕物を用いると、システイン残基と、
セリン残基あるいはスレオニン残基から、ランチオニン
あるいはメチルランチオニンが生成し、ランチオニン含
有ペプチドが得られる。
た微生物の菌体破砕物を用いると、システイン残基と、
セリン残基あるいはスレオニン残基から、ランチオニン
あるいはメチルランチオニンが生成し、ランチオニン含
有ペプチドが得られる。
【００４２】また、ストレプトコッカス ラクティスＩ
ＦＯ１２５４６、ストレプトマイセス アウレウス（St
reptomyces aureus）ＩＦＯ３１７５、アクチノマイセ
スアルボシアネウス（Actinomyces albocyaneus）ＩＦ
Ｏ１２８３２等で同様の実験を行ったところ、いずれの
ペプチドを基質とした場合にも、ランチオニン及びメチ
ルランチオニンの生成は認められなかった。
ＦＯ１２５４６、ストレプトマイセス アウレウス（St
reptomyces aureus）ＩＦＯ３１７５、アクチノマイセ
スアルボシアネウス（Actinomyces albocyaneus）ＩＦ
Ｏ１２８３２等で同様の実験を行ったところ、いずれの
ペプチドを基質とした場合にも、ランチオニン及びメチ
ルランチオニンの生成は認められなかった。
【００４３】
【実施例２】前記で得られたストレプトバーティシラム
ケンタッケンスＩＦＯ１２８８０の菌体破砕処理物を
用い、ペプチド２〜４を基質として、ランチオニン又は
メチルランチオニン生成反応を行ない、生成したランチ
オニン並びにメチルランチオニンを定量した。その結果
を表５に示した。
ケンタッケンスＩＦＯ１２８８０の菌体破砕処理物を
用い、ペプチド２〜４を基質として、ランチオニン又は
メチルランチオニン生成反応を行ない、生成したランチ
オニン並びにメチルランチオニンを定量した。その結果
を表５に示した。
【００４４】
【表５】
【００４５】この結果から、ストレプトバーティシラム
ケンタッケンスの菌体破砕物を用いると、ランチオニ
ン及びメチルランチオニンを生成させることができるこ
とがわかる。尚、この菌は、元々菌体タンパク中にラン
チオニンを含まないものであるが、ランチオニン生成反
応を行うことが可能であることが本発明で初めて示され
た。
ケンタッケンスの菌体破砕物を用いると、ランチオニ
ン及びメチルランチオニンを生成させることができるこ
とがわかる。尚、この菌は、元々菌体タンパク中にラン
チオニンを含まないものであるが、ランチオニン生成反
応を行うことが可能であることが本発明で初めて示され
た。
【００４６】
【実施例３】前記で得られたストレプトマイセス イェ
レバネンシスＩＦＯ１２５１７の菌体破砕処理物を用
い、ペプチド５を基質として、メチルランチオニン生成
反応を行なった。その結果、基質１００ｎｍｏｌあたり
０．４ｎｍｏｌのメチルランチオニンを生成した。
レバネンシスＩＦＯ１２５１７の菌体破砕処理物を用
い、ペプチド５を基質として、メチルランチオニン生成
反応を行なった。その結果、基質１００ｎｍｏｌあたり
０．４ｎｍｏｌのメチルランチオニンを生成した。
【００４７】この結果から、ストレプトマイセス イェ
レバネンシスは、システインとスレオニン残基からメチ
ルランチオニンを生成する酵素を生産し、これを利用す
ることによりメチオランチオニン含有ペプチドが得られ
ることがわかった。
レバネンシスは、システインとスレオニン残基からメチ
ルランチオニンを生成する酵素を生産し、これを利用す
ることによりメチオランチオニン含有ペプチドが得られ
ることがわかった。
【００４８】
【発明の効果】本発明の方法により、ペプチド又はポリ
ペプチド中のペプチド鎖内に、容易にランチオニン、メ
チルランチオニンを生成させることができ、ランチオニ
ン含有物を製造することが可能となる。
ペプチド中のペプチド鎖内に、容易にランチオニン、メ
チルランチオニンを生成させることができ、ランチオニ
ン含有物を製造することが可能となる。
【００４９】
【００５０】配列番号：１ 配列の長さ：34 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu 5 10 15 Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys His Cys Ser Ile His Val 20 25 30 Ser Lys
【００５１】配列番号：２ 配列の長さ：19 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Val Gln Ser Cys Ser Phe Gly Pro Leu Thr Trp Ser Cys Asp Gly 5 10 15 Asn Thr Lys
【００５２】配列番号：３ 配列の長さ：５ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５３】配列番号：４ 配列の長さ：５ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５４】配列番号：５ 配列の長さ：４ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Gly Cys
【図１】 ランチオニン生成反応を示す図
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/04 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/04 Ｃ１２Ｒ 1:625） (72)発明者 清水 昌 京都府京都市左京区北白川追分町（番地 なし）京都大学農学部内 (72)発明者 山田 秀明 京都府京都市左京区北白川追分町（番地 なし）京都大学農学部内 (72)発明者 芝 哲夫 大阪府箕面市稲４−１−２財団法人 蛋 白質研究奨励会 ペプチド研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ペプチド鎖内のシステイン残基とセリン
残基からランチオニンを、またはシステイン残基とスレ
オニン残基からメチルランチオニンを、各々ランチオニ
ン環形成反応により生成させる能力を有し、ミコバクテ
リウム（Mycobacterim）属、ノカルディア（Nocardia）
属、ノカルディオイデス（Nocardioides）属、ロドコッ
カス（Rhodococcus）属、ストレプトマイセス（Strepto
myces）属、またはストレプトバーティシラム（Strepto
verticillium）属に属する微生物の培養物又はこの培養
物より分離した微生物菌体もしくはその菌体の処理物
を、システイン残基とセリン残基、又はシステイン残基
とスレオニン残基を有するペプチドと共存させ、前記ペ
プチド鎖内にランチオニンもしくはメチルランチオニ
ン、またはランチオニン及びメチルランチオニンを生成
させることを特徴とするランチオニン含有物の製造方
法。 - 【請求項２】 前記微生物が、ミコバクテリウム フィ
レイ（Mycobacterium phlei）、ノカルディア アステ
オイデス（Nocardia asteoides）、ノカルディオイデス
アルブス（Nocardioides albus）、ロドコッカス エ
リスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ストレプ
トマイセス グリセオラス（Streptomyces griseolu
s）、ストレプトバーティシラム ケンタッケンス（Str
eptoverticillium kentuckense）、ストレプトマイセ
ス イェレバネンシス（Streptomyces yerevanensis）、
ストレプトマイセス スカビース（Streptomyces scabi
es）から選ばれることを特徴とする請求項１記載のラン
チオニン含有物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4838593A JP2891023B2 (ja) | 1993-03-09 | 1993-03-09 | ランチオニン含有物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4838593A JP2891023B2 (ja) | 1993-03-09 | 1993-03-09 | ランチオニン含有物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06253885A JPH06253885A (ja) | 1994-09-13 |
| JP2891023B2 true JP2891023B2 (ja) | 1999-05-17 |
Family
ID=12801843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4838593A Expired - Fee Related JP2891023B2 (ja) | 1993-03-09 | 1993-03-09 | ランチオニン含有物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2891023B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130203662A1 (en) * | 2008-12-05 | 2013-08-08 | The Regents Of The University Of Califonira | Mini-Hepcidin Peptides and Methods of Using Thereof |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001066708A2 (en) * | 2000-03-08 | 2001-09-13 | Zealand Pharma A/S | MATERIALS AND METHODS RELATING TO THE DEGRADATION OF Cdc25A IN RESPONSE TO DNA DAMAGE |
| JP2009050251A (ja) * | 2007-05-14 | 2009-03-12 | Sumitomo Chemical Co Ltd | 乳酸の製造方法 |
-
1993
- 1993-03-09 JP JP4838593A patent/JP2891023B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130203662A1 (en) * | 2008-12-05 | 2013-08-08 | The Regents Of The University Of Califonira | Mini-Hepcidin Peptides and Methods of Using Thereof |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06253885A (ja) | 1994-09-13 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |