KR800000807B1 - 세균 아포 용해 효소의 제조법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

세균 아포 용해 효소의 제조법

제1도는 스트렙토마이세스 SP. NO 227의 배양액의 원심분리 상징액을 황산 암모늄 침전법에 의하여 분획한 것에 대하여, CM 셀룰로스의 컬럼 크로마토그래피에 흡착시킨 후 0몰에서 0.7몰의 식염의 리니어 그레이디엔트(linear gradient)법에 의하여 용출시켰을 때의 패턴이다. 횡축은 플랙션 넘버를 표시하고, 종축은 용출단백질량을 280mμ의 흡수치로서 표시한 것 및 아포용해활성을 표시한다.

제2도는 스트렙토마이세스 SP. NO 227의 배양액으로 부터 아포용해활성 부분을 컬럼 크로마토 그래피등으로 정제한 것에 대하여 단백질 분해활성을 본 것이다. 횡축은 반응시간(분)을 표시하고, 종축은 반응액중의 트리클로로초산 가용부분의 280mμ의 흡수를 표시한다.

본 발명은 미량의 염류와 질소원과, 세균아포를 함유한 배지에, 새로 토양에서 분리한 스트렙도 마이세스속에 속하는 미생물을 배양하여 배양액중에 세균아포를 용해시키는 효소의 제조법에 관한 것이다.

현재까지 수다하게 미생물이 생산하는 균체의 효소에 의한 미생물 세포의 용해현상이 보고된 바 있다.

예를 들면 바실루스 서브조리스가 생산하는 효소(일본 농화학 31권 281페이지(1956)), 브레비 박테리움 리티캄이 생산하는 효소(일본국 특공소 38―9935호), 스트렙토마이세스 글리세오 비신스가 생산하는 효소(특공소 42―5190호) 등 헤아릴 수 없이 많다.

그러나 이들 효소는 용해되는 미생물이 아포를 형성하거나, 형성하지 않거나 간에, 모두 그 영양형 세포를 용해하는 것이었다. 이들 공지의 미생물 세포벽 용해효소의 대부분은, 글루카나제, 셀룰라제, 페프티다제, 무라미다제 등에 속하는 것이었다. 그런데 아포는 그 영양형세포와, 내열형, 약제내성(藥劑耐性) 기타의 생리학적 성질에서 현저하게 다르게 되어있으며, 또 세포체의 외각구조의 점에서도 영양형세포는 페프리드 글리칸을 주체로 하는 세포벽을 가지고 있는 것에 대하여, 아포는 그것과는 화학적으로 전혀 다른 일종의 경단백질로서 구성되는 스포어 크우트(spore coat)라는 강인한 외각 구조를 그 바깥쪽에 유지하고 있다. 그 상세한 구조에 대하여는 아직도 불명한 점도 많다.

따라서 이와 같은 영양형 세포와는 화학적으로 전혀 다른 지지구조를 가지는 아포를 용해시킬 때, 종래의 미생물 세포벽 용해효소가 작용 곤란한 것은 당연하며, 이 아포의 특수한 단백질 외각구조에 작용하는 물질이 아포의 완전한 용해에는 필수하다. 본 발명자들은 이점에 주목하여 이 아포용해를 위하여 여러가지의 연구를 거듭한 결과 드디어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 세균 아포의 분획성분을 용해시키는 방법은 여러 종류의 아포 중에 존재하며, 아포의 발아에 관계된다고 생각되고 있는 내재성 자기소화계의 효소 저어널ㆍ오브 제너럴 마이크로 바이올로지(J. of. general microbiology 16, 236―249, (1957)) 이외는 알려져 있지 않으며, 또한 그것은 작용시간이 수십시간이라는 극히 작용력이 약한 것이며, 또 아포의 1성분을 대상으로 하고, 아포 전체를 대상으로 한 것은 아니다. 본 발명과 같이 다른 미생물보다 고능률이고 아포 그 자체를 용해시키는 효소를 발견했다는 보고는 전혀 없다.

한편 이와 같은 아포균은 각종 산업 특히 식품 공업에 있어서의 포장기술, 살균기술의 현저한 진보에도 불구하고, 예를 들면 식품의 부패 원인균으로서, 여전히 문제가 되고 있으며, 본 효소는 그 특성을 이용하여, 이 분야 등에 새로운 국면을 전개할 것으로 예상된다.

본 발명에 있어서 사용하는 균주중에서 가장 유리한 것의 하나는, 스트렙토마이세스 SP. NO 227인데, 이것은 일본국 쿄오또부(京都府) 일대의 토양에서 분리시킨 것으로서, 균학적 제성질은 다음과 같다.

Ⅰ) 형태적 특징

기균사를 잘 형성하는 배지에 있어서, 현미경하에서 단순 분지(分枝)로 직상(直狀)으로 발육하고, 나선형, 불완전 나선형 및 윤성사를 형성하지 않는다. 포자는 기균사의 선단에 종종 50개 이상 연쇄하며 전자 현미경에 의한 관찰의 결과 포자 표면은 평활하고 원통상이다.

또한 그 크기는 1μ×0.5―0.6μ 이었다.

Ⅱ) 각종 배지상에서의 성상

1) 슈크로즈ㆍ초산염 한천배지

(발 육) 양호, 무색

(기 균 사) 백색

(가용성 색소) 없음

2) 글루코즈ㆍ아스파라긴 한천배지

(발 육) 양호, 무색

(기 균 사) 백색

(가용성 색소) 없음

3) 전분 한천배지

(발 육) 양호, 무색

(기 균 사) 백색

(가용성 색소) 없음

4) 글리세린ㆍ아스파라긴 한천배지

(발 육) 양호, 무색

(기 균 사) 백색

(가용성 색소) 없음

5) 티토신ㆍ한천배지

(발 육) 양호, 무색

(기 균 사) 백색

(가용성 색소) 없음

6) 보통 한천배지

(발 육) 보통, 무색

(기 균 사) 백색

(가용성 색소) 없음

7) 이스트ㆍ맥아 한천배지

(발 육) 양호, 무색

(기 균 사) 백색, 면상

(가용성 색소) 없음

8) 오트밀 한천배지

(발 육) 양호, 무색

(기 균 사) 백색

(가용성 색소) 없음

Ⅲ) 생리학적 성질

1) 생육적절 온도 28°C―30°C

2) 젤라틴의 액화 ＋

3) 전분의 가수분해 ＋

4) 탈지유(脫脂乳)의 응고 헵톤화 ＋

5) 멜라닌 색소의 형성 ―

6) 초산의 환원성 ＋

Ⅳ) 탄소원의 이용성

1) 이용하는 탄소원

아라비노즈, 키실로즈, 이노시톨, 만니톨, 과당, 자당

2) 이용이 의심스러운 탄소원

람노즈, 셀룰로즈

3) 이용하지 않는 탄소원

라피노즈

이상의 여러 성질을 요약하면, 스트렙토마이세스 SP. NO 227 균주의 기생균사는 분단되지 않고, 포자낭 포자는 볼수 없었으며, 기균사의 선단에 포자가 연쇄함으로서, 본 균주는 스트렙토마이세스 속에 속하는 사실이 명백하다. 바아제에즈, 메뉴얼 오브 디터미네이티이브 박테리오로지(Manual of Determinative Bacteriology) ―제7판(1975년), 왁스만저 “디ㆍ악티 노미세스” 제2권(1962년)을 참고하여 본 균주의 유사균을 검토하면, 스트렙토마이세스ㆍ칸디다스를 들 수 있다. 스트렙토마이세스 SP. NO 227 균주도, 스트렙토마이세스 칸디다스에 속하는 것이 타당하다고 사료된다.

본 균주의 공업기술원 미생물 공업기술원연구소 미생물 수탁번호는 미공연균기(微工硏菌奇) 제2971호이다. 본 균을 배양하여, 본 효소를 제조하기 위한 배지는 소량의 무기염류와 소량의 효모에기스로서 된 기초배지에, 탄소원으로서 세균아포를 건중량으로 0.2g/50ml(배지)의 비율로 첨가하여 즉시 121°C에서 15분간 살균한다. 세균 아포 이외의 세균 영양형 세포 혹은 키틴등의 다당류, 기타 당류의 첨가는 효소의 생성에 저해가 된다.

여기서 사용하는 세균아포란 아포균을 보통 한천배지 혹은 폴리펩톤 2%, 글루코즈 1%, 효모에기스 1%, 식염 0.5%, 염화칼슘 0.01%, 황산 마그네슘 0.01%, 염화망간 0.01%, 한천 2.5%(pH 7.2)와 같은, 아포를 형성하는데 적당한 배지상에서 37°C, 6일간 배양하여 집균후 증류수로서 충분히 원침 세정한 다음, 다시 4°C로 2―3일 정치하고, 재차 증류수로 충분히 세정하고, 4°C로 정치한 후 바닥에 침전되어 있는 층이 올라오지 않도록 상부에 있는 현탁상태의 아포만을 모아서, 다시 세정하여, 현미경 관찰을 한 결과, 영양세포의 잔존을 볼 수 없는 상태의 것을 지칭한다. 영양세포와 아포의 분리가 비교적 곤란한 균종은 다시, 수성 2층 분배법 등으로, 현미경적으로 균일한 아포액이 얻어질 때까지 조작한다.

배양은 상기 효소 생성용 배지에 본균을 접종하여 통상 30°C에서 6―7일간 진탕 배양을 행한다. 배양의 조건은 아포의 종류, 기타 상황에 의하여 변화하지만, 목적으로 하는 아포용해효소의 생산이 최대로 되도록 선택되는 것이 바람직하다. 이와 같이, 상기 효소 생성용 배지에 스트렙토 마이세스 SP. NO 227을 생육시켜 본 효소를 생성 축적시킨 배양액의 원심분리법에 의한 상징액 그 자체도 세균 아포 용해성을 가지므로, 그대로 사용할 수도 있다. 또한 그 상징액을 원료로 하여, 아세톤, 알코올 등의 유기용매로서 침전시키는 방법, 황산암모늄과 같은 무기염류에 의한 염석 등에 의하여 본 효소를 채취할 수 있다.

본 발명은, 다시 세파덱스 등의 겔 여과법, 이온 교환체에 흡착, 탈찰시키는 방법, 그의 전기 영동법등의 효소를 정제하는 경우에 적용할 수 있는 공지의 수단을 적절히 이용하여 정제할 수 있다.

본 효소의 적절 pH는 중성부근에 있고, 또한 적절온도는 40―45°C 부근에 있다. 또 60°C에서 20분간의 가열에 대하여는 충분히 안정하다. 효소 활성의 측정은 아포를 121°C에서 15분간 가열한 것을 증류수로 수회 세정한 후에 1/15M 인산 완충액(pH 7.0)으로 수회 세정하고, 다시 동 균체를 등 환충액에 현탁하고, 현탁액의 2배 희석액이 600mμ의 O.D이며, 0.5―0.7이 되도록 조정한다.

이와 같이 하여 얻어진 현탁액을 시험관에 1ml 넣고, 다시 효소액 1ml를 넣고, 40°C에서 1시간 내지는 수시간 부드럽게 진탕하면서 반응시켜, 600mμ의 O.D의 감소에서 활성을 측정하였다. 이때 동시에 아포의 현탁액 1ml와 증류수 1ml를 첨가한 시험관도 준비하여, 완전히 동일한 조건에서 660mμ의 O.D의 감소를 측정하였다.

용해활성은 다음 식에 따라서 백분율로 표과하였다.

상기식에서, A, B 및 C는 다음과 같은 것이다.

A : 반응계의 O.D의 감소치

B : 증류수 첨가계의 O.D의 감소치

C : 반응 개시시의 O.D 즉 효소액과 아포현탁을 혼합한 직후의 O.D

표 Ⅰ에 바실루스ㆍ리케니 포르미스의 아포를 함유하는 본 효소 생성용 배지에 스트렙토마이세스 SP. NO 227을 배양하여 얻어진 효소액의 각종 아포에 대한 용해활성을 난백 리소짐(lysozyme)의 그것과 비교하여 표시하였다.

이와 같이, 난백 리소짐은 아포에 대하여 거의 작용력을 나타내지 않는데에 비하여 본 효소는 뚜렷하게 용해되어 있는 것을 알 수 있다.

표 Ⅰ에 스트렙토마이세스 SP. NO 227을 실제로 정제하였을 때의 1예를 표시하였다. 이와 같이 하여서 정제된 효소에 대하여, 아포 이외의 여러가지 물질에 대한 기질특이성을 조사한 바, 본 효소는 표 Ⅱ에 표시하는 것과 같이 카제인, 케라틴에 작용하고, 알부민에 작용하지 않는, 일종의 경단백질 분해 효소라는 것을 알았다. 그러나 본 효소에 대하여 특징적인 것은, 공지의 순품효소 즉, 동물, 식물, 미생물 기원의 효소를 본 효소 대신에 세균 아포에 적용시켜도 표 Ⅱ에 표시한 것과 같이 거의 아무런 작용도 발결할 수 없고, 본 효소를 사용하였을 때만, 현저한 세균아포의 용해를 볼 수 있다고 하는 것이다.

이상과 같이 본 발명에서 얻어지는 세균 아포 용해 효소는 일종의 신규한 단백질 분해효소이다.

[표 I]

각종 아포에 대한 용해작용

[표 II]

바실루스·세레우스아포에 대한 각종 단백 분해효소의 용해 활성

다음에 본 발명의 실시예를 표시한다.

[실시예 1]

기초배지 K₂HPO₄0.2%, MgSO₄0.1%, 효모에기스 0.1%, 식염 0.5%로 된 배지 1ℓ를 만든다. 이때 pH 수정은 행하지 않는다. 500ml 용량의 프라스코 20개에 50ml씩 상기 배지를 분주하고, 각각의 프라스코에 건중량으로 하여, 약 0.2g의 바실루스 서브틸루스의 아포를 첨가하고, 즉시 121°C로 15분간 살균한다. 이것에 스트렙토마이세스 SP. NO227을 1백금 루프씩 식균하여 30°C에서 약 6일간 진탕 배양한다. 배양액은 원심분리를 행하여 균체를 제거하고, 그 상징액 100ml에 대하여 60g의 비율로 황산 암모늄을 첨가하여, 4°C에서 일야 정치하고, 염석시킨 침전물을 원심분리에 의하여 모아서, 이것을 충분한 양의 1/15M 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석을 행한다.

투석내액을 재동결 건조시키면, 배양액 1ℓ에서 약 2.3g의 분말을 얻을 수 있다. 이 조효소분말 100mg을 1/15M 인산 완충액(pH 7.0) 100ml에 용해하여 효소액으로 하였다.

이 효소액의 세균 아포 용해 활성을 조사한 바, 표 Ⅲ에 표시한 바와 같다.

[표 III]

각종 아포에 대한 용해활성

[실시예 2]

실시예 1에 기재된 것과 동일한 기초배지의 50ml당 바실루스ㆍ셀레우스의 아포를 건중량으로 하여 0.2g을 첨가하여 실시예 1에서 기제한 방법과 동일하게 살균하고, 스트렙토마이세스 SP. NO227을 식균, 배양, 추출하여, 배양액 1ℓ에서 약 2.8g의 동결 건조 효소분말을 얻었다. 이 분말 100mg을 100ml의 1/15M 인산 완충액에 용해시켜서, 여러 종류의 아포에 대하여 용해 활성을 측정하였든 바 표 Ⅳ은 같은 결과를 얻었다.

[표 IV]

각종 아포에 대한 용해활성

Claims (1)

1. 스트렙토마이세스 속에 속하고, 세균 아포 용해효소 생산능이 있는 균주 스트렙토마이세스 SP. NO 227(일본 공업기술원 미생물기술연구소 수탁번호 제2971호)를 미량의 염류, 질소원과 세균 아포만을 함유하는 배지에 배양하여, 생성한 세균아포 용해 효소를 단리하는 것을 특징으로 하는 미생물에 의한 세균아포 용해효소의 제조법.

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