JPS5852633B2 - 発酵法によるホスホリパ−ゼｄの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるホスホリパーゼＤの製造法に関す
る。

さらに詳しくは、本発明はミクロモノスポラ属に属し、
ホスホリパーゼＤ生産能を有する微生物を栄養培地に培
養し、培養物中にホスホリパーゼＤを生成せしめ、これ
を採取することを特徴とするホスホリパーゼＤの製造法
に関する。

ホスホリパーゼＤ （ＥＣ３，１，４，４）はリン脂質
のリン酸と塩基とのエステル結合を分解してホスファチ
ジン酸と塩基とを遊離する酵素である。

ホスホリパーゼＤは、リン脂質の代謝に関連する研究用
試薬や血清中に含まれるリン脂質の定量用試薬等として
有用である。

ホスホリパーゼＤはホウレンソウ、キャベツ、ニンジン
、カリフラワー、セロリ、エントウ豆など植物組織に広
く存在することが知られている。

従来、発酵法によるホスホリパーゼＤの製造法としては
、ストレプトマイセス属に属する微生物を用いる方法が
知られている（特開昭４８−９９３８６号公報）。

本発明者らは、天然界より数多くの微生物を入手してホ
スホリパーゼＤの生産性について種々研究した。

その結果、群馬県前橋市の土壌から分離した菌株（ＫＹ
１９３６株と称する）を培地に培養すると、培養物中に
ホスホリパーゼＤが生産する事実を見出した。

本菌の菌学的性質は次の通りである。

１ 形態的性質 ＫＹＩ ９３６株は一般に使用されている寒天培地でス
トレプトマイセス属の菌株に認められるような真性気中
菌糸を形成せず、メロンイエローからオレンジ色の基生
菌糸を形成する。

胞子形成が良好な場合、寒天表面の菌糸の色は褐色から
黒色となる。

寒天培地上で生育したＫＹ １９３６株を顕微鏡で観察
すると、菌糸は直径約０．５μで比較的長く分枝してい
る。

隔壁も見受けられる。

胞子のうは形成されず、胞子は基生菌糸より分枝した単
純胞子柄の頂点に１個あるいは無柄に１個づつのみ着生
する。

胞子柄は比較的長いものが多く、また菌糸の先端部分で
は房状に形成される。

成熟した胞子の直径は１．０から１．５μであり、球状
あるいは卵型を示し、電子顕微鏡による観察では表面は
平滑であり、鞭毛は認められない。

ＸＹ１９３６株を第１表に示した諸種の培地上で生育さ
せたが可溶性色素の生成は認められなかった。

諸種の培地上での生育状態や色については第１表に示し
た。

２ 性理的性質 ＫＹ１９３６株の生理的諸性質を第２表に示す。

以上は、３０℃、２週間後の観察結果である。

但し、６の至適生育温度は４日後、３のミルクおよび４
の繊維素に対する作用については、１ケ丹後の結果であ
る。

３同定 、以上みたごと＜、ＫＹ１９３６株は寒天培地において
真性気中菌糸を形成せず基性菌糸に胞子を単一生成する
中温菌である。

以上のようなことからＫＹ１９３６株は、放線菌のなか
のミクロモノスポラ属に属する菌株であると判定された
。

バージエイのマニュアル・オブ・デターミネテイブ・バ
クテリオロジーの第８版に記載されているミクロモノス
ポラ属の菌の分類に従うと本菌株（ＫＹ１９３６株）は
好気性菌でメリビオース、ラフィノースを資化しツアペ
ック寒天培地での生育が不良であることからしてミクロ
モノスポラ・チャルセア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒ
ａ 、 Ｃｈａｌｃｅａ ）に分類される。

さらに本菌株のその他の生理的性質においても、例えば
菌叢の色はオレンジ色で胞子形成とともに褐色から黒色
になること、可溶性色素を生産しないこと、イノシトー
ル、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニットなどを利用しない
ことなど、ミクロモノスポラ・チャルセアの記載によく
一致する。

したがってＫＹ１９３６株はミクロモノスポラ・チャル
セアに属する菌株と同定した。

なお、該菌株は微工研に寄託されており、その寄託受理
番号は第４２０１号である。

本発明で用いられる菌としては、例えば前記したミクロ
モノスポラ・チャルセアＫＹ１９３６の他にミクロモノ
スポラ・チャルセアＡＴＣＣ１２４５２、ミクロモノス
ポラ・エチノスポラＮＲＲＬ ２９８５、ミクロモノス
ポラ・エチ／スポラ・サブエスピー・フエルギエナＮＲ
ＲＬ２９９５、ミクロモノスポラ、グロボサＫＣＣＡ０
１２６、ミクロモノスポラ・イノシトラＡＴＣＣ２１７
７３、ミクロモノスポラ・メガロミセアＮＲＲＬ ３２
７５、ミクロモノスポラ・メラノスポレアＩＦＯ１２５
１５、ミクロモノスポラ・バルブロクロモゲネスＡＴＣ
Ｃ２７００７等が挙げられるが、これらの菌たけに限ら
ず、ミクロモノスポラ属に属する菌でホスホリパーゼＤ
を生産する菌であれば、いずれも本発明において使用す
ることができる。

本発明の培養においては、通常の放線菌の培養法が一般
に適用される。

培養のために用いられる炭素源としてはブドウ糖、果糖
、蔗糖、乳糖、糖蜜、澱粉、デキストリン、グリセリン
などが単独または組み合わせて用いられる。

さらに菌の資化性によっては炭化水素、アルコール類、
有機酸、脂肪酸、油脂、粗レシチンなども用いられる。

無機および有機窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ソーダな
どが、また天然窒素源としはペプトン、肉エキス、酵母
エキス、コーンステイープリカー、大豆粉、大豆粕、乾
燥酵母、カザミノ酸、ソリュブルベジタブルプロテイン
などが単独または組み合わせて用いられる。

そのほか必要に応じて食塩、塩化カリウム、リン酸塩、
マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、
亜鉛等の塩類が必要に応じて使用されるほか、本菌の生
育やホスホリパーゼＤの生産を促進する有機質や無機物
を適当に添加することができる。

培養法としては、液体培養法がよく、工業的には深部通
気攪拌培養法がもっとも適している。

培養温度は２２〜４０℃の範囲で行なうことができるが
、２５〜３５℃が好適である。

ｐＨは中性または微アルカリの範囲にあることが望まし
い。

培養期間は条件によって変ってくるが、通常２〜６日程
度であり、ホスホリパーゼＤの生成が確認されたとき、
好ましくは生成が最大に達したときに培養を停止する。

本酵素は主として培養液中に存在するので、培養終了液
より菌体を済別して得られる培養済液よりホスホリパー
ゼＤの採取を行なう。

培養済液よりホスホリパーゼＤの採取にあたっては通常
酵素精製に用いられるあらゆる方法が使用できる。

例えば、減圧濃縮、塩析、有機溶媒沈澱、透析、ゲル済
過、吸着剤などによる吸着クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィーあるいは凍結乾燥等の方法が使
用でき、さらにこれらの方法を適当に組み合わせること
によってホスホリパーゼＤの精製を効果的に行なうこと
ができる。

次に、ホスホリパーゼＤの酵素活性の測定法について説
明する。

ホスホリパーゼＤの酵素活性の測定は次の２つの方法に
よって行なった。

通常の場合は、主として、後者の方法〔酵素（コリンオ
キシダーゼ）による方法〕によって測定した。

活性の表示は１分間に１μｍｏｌｅのコリンまたはエタ
ノールアミンを遊離させる活性を１ ｕｎｉｔとした。

■ デンシトメトリーによる方法 ０、１ Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５０） １．
０ｍＡ。

基質（８０μｍｏｌｅｓ ／ｒ７１１エチルエーテル）
０．５ｍｌ、 ０．１ ＭＣａＣ１２ｏ、 ２ｒｎ１１
水０．３ｍｌに酵素溶液０．５ｍｌから成る組成液を用
い、３７℃で所要時間（３０分〜２時間）反応させたの
ち、反応液中に含まれている基質および反応生成物であ
るホスファチジン酸あるいはＮ−アシルスフィンゴシル
ホスフェイトをエチルエーテル２ｍｌにて３回抽出する
。

残った反応液を４０〜５０℃の温水中に浸漬した後これ
に、空気を吹き込んでエチルエーテルを飛散除去し、つ
ぎに１００℃の熱水中に５分間浸漬して完全に反応を停
止する。

エチルエーテルによる抽出液一定量（ｌ〜５μｌ）をケ
イ酸の薄層上（５ｉｌｉｃａ ｇｅｔ Ｈ（Ｅ。

Ｍｅｒｃｋ社製）、溶媒系クロロホルム：メタノール：
水（６５：２５：３）、ｌに展開後、モリブデン青試薬
で発色させ、反応生成物を確認する。

反応停止後の水層一定量（５μｌ）をケイ酸の薄層上（
５ｉｌｉｃａ Ｇｅｌ Ｇ）に標準液（コリンとして０
．２〜１．０■／尻ｌコリン塩酸塩溶液またはエタノー
ルアミンとして０．２〜１．０■／ＴＬｌエタノールア
ミン塩酸塩溶液）とともにスポットし、溶媒系ｎ−ブタ
ノール：酢酸：水（５： ２ ： ２）で展開後、ドラ
ーゲンドルフ試薬またはニンヒドリン試薬によって発色
させる。

コリンのスポットはドラーゲンドルフ試薬によって赤色
を呈し、エタノールアミンのスポットはニンヒドリ７に
薬によって赤紫色を呈する。

このスポットの吸光度をデンシトメトリー（デンシトメ
ータ：クロマトスキャナＣ８９００島津製作所製）によ
って測定し標準曲線から生成量を算出し、酵素活性に換
算する。

デンシトメトリーによる方法は測定に若干の時間を要す
るが、反応生産物の確認が同時にできること、コリンを
含まない燐脂質にも適用できるなどの利点があり、実験
目的に応じてはこの方法を活用して酵素活性の測定を行
なった。

２ 酵素（コリンオキシダーゼ）による方法コリン・オ
キシダーゼはコリンをベタインに酸化し、その際コリン
１モルより２モルの過酸化水素を定量的に発生する。

ホスホリパーゼＤの活性の測定はレシチンとホスホリパ
ーゼＤとの反応によって遊離するコリンにコリン・オキ
シダーゼを作用させて定量的に発生する過酸化水素をペ
ルオキシダーゼの存在下で、フエノー−４−アミノアン
チピリンの発色系に導く方法によって測定する。

この方法の詳細は次の通りであり、１段階の反応により
高い精度でホスホリパーゼＤの活性を測定することがで
きる。

すなわち、コリン・オキシダーゼ４単位、ペルオキシダ
ーゼ６０単位、塩化カルシウムｌＸｌ０−５モル、トリ
トンＸ−１００（界面活性剤、半井化学薬品■製）３ｍ
９．４−アミノアンチピリン０．６ｍＩ？、フェノ−＃
０．９４ｙｎｑを０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液３．０
ｗ１（ｐ）ｉ ｓ、 ０ ）に加え、さらに基質として
レシチンｉｏｏ■を１，５％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１
００を含むインプロパツール１０ｒｕｌに溶かしたもの
を０．０５ｍ１（レシチンとして０．５ｍ９含有）加え
る。

該混合液に測定すべき酵素溶液０． ｌ ｒＩｌｌを加
えて３７℃で１０分間反応させたのち、５００ｎｍの吸
光度を測定する。

対照としては、該反応液からレシチンを除いた反応液を
同時間、同温度に保ったものの５００ｎｍの吸光度を測
定する。

ホスホリパーゼＤの活性の表示は前者の吸光度から後者
の吸光度を差し引いた値からコリンの量を算出すること
によって行なった。

活性の単位Ｕは１分間に１μｍｏｌｅのコリンを遊離さ
せる酵素力価とした。

次に実施例２で得られた酵素標品によるホスホリパーゼ
Ｄの性質を実験例により示す。

実験例 （１）基質特異性 実施例２で得られた酵素標品を０．２Ｕ７’ｒｕｌ（レ
シチンを基質としたときの活性）になるように０．０２
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解する。

該酵素溶液０．５ｍｌ、 ０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５０） １．０ｍｌ、基質（８０μｍｏｌｅｓ
、／１１１１エチルエーテル） ０．５ｍ１１０．１
ＭＣａＣ１□０．２ｒＩｌｌおよび水０．３ｍｌからな
る組成液を３７℃で２＊時間反応させたのち、エーテル
層および水層での反応生成物を薄層クロマトグラフィに
よって検出した。

また水層での生成物として範層プレート上で検出される
コリンまたはエタノールアミンの濃度をデンジトノトリ
ーによって測定し、レシチンに対する活性を１００とし
た場合の各基質に対する活性比を算出した。

これらの結果は第３表に示した。

ホスホリパゼＤはレシチン、リゾレシチン、スフィンゴ
ミエリンおよびホスファチジルエタノールアミンのいず
れにもよく作用する。

（２）至適ｐＨ 実施例２で得られた酵素標品を０．２Ｕ／ｍｌ（レシチ
ンを基質としたときの活性）になるように０．ＯＩＭｌ
−リス緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解する。

得られた酵素溶液０．５ｍｌと次に示すような種々のｐ
Ｈの緩衝液と混合する。

すなわち、ｐＨ５，５〜７．０はｏ、Ｉ Ｍトリス・マ
レート緩衝液、ｐＨ７，０〜８．５は０．１ Ｍ トリ
ス・塩酸緩衝液、ｐＨ８，５〜９．５は０．１ Ｍホウ
酸緩衝液各ＬＯｒｎｌと混合し、さらにこれに０．１Ｍ
−ＣａＣ１２溶液０．２ ｍｌ、蒸留水０．３を加え、
所定のｐＨを有する反応液を得たのち、基質としてレシ
チン８０００μｍｏｌｅを１００１１１１になるように
溶かしたエーテル溶液０．５扉１（４０μｍｏｌｅのレ
シチン含有）を加え、３７℃で２時間反応させ、生成し
たコリンをデンシトメトリーによる方法によって定量し
、ホスホリパーゼＤの活性に換算した。

ｐＨ８，０での活性を１００とした場合の各ｐＨにおけ
る活性の関係は第１図に示すようになり、ｐ）（ｓ、ｏ
付近に至適ｐＨが認められた。

（３）至適温度 （３）基質としてレシチンを用い、実施例２で得られた
酵素標品を使用して（１）と全く同様の方法で反応温度
のみを変更して至適反応温度をしらべた。

反応温度は２５℃から５℃づつ上昇させて７０°Ｃまで
１０段階の反応温度を検討した。

結果は第２図に示すようになり、至適温度は４００Ｃか
ら５０℃の範囲にあることが判った。

（４）温度安定性 実施例２で得られた酵素標品を０．２Ｕ／ｍｌ（レシチ
ンを基質としたときの活性）になるように０．０５Ｍト
リス緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、１０．２０，３０
，３５，４０，４５，５０゜６０．７０および８００Ｃ
の各温度に３０分間放置後再び３７℃に戻し、前記した
゛酵素にによる方法″ホスホリパーゼＤの力価を測定し
、相対活性で示した。

結果は第３図に示すようになった。

この結果から５０℃までの温度では３０分の処理によっ
てもほとんど失活が認められず、７０°Ｃ３０分の処理
によっても５０％以上の活性が残存していた。

（５） ｐＨ安定性 実施例２で得られた酵素標品を２． ＯＵ ７ｍｌ（レ
シチンを基質としたときの活性）になるように０．０１
Ｍ１−リス緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、この酵素溶
液０．４ ｒｒＬｌに１．６ｍｌの０．０５Ｍの各緩衝
液、すなわちｐＨ５，２〜７．０ではトリス・マレート
緩衝液、ｐ）１７．０〜８．５ではトリス・塩酸緩衝液
、ｐＨ８，５〜ｌ０９０ではホウ酸緩衝液を夫々加え２
．０ ｒｄとして、４５℃で２時間保った。

その後、これら酵素溶液１ｍｌに０．１ Ｍ トＩＪス
緩衝液（ｐＨ８，０）３ｒＩｌｌを加えて、ｐＨを７．
５〜８．５とした後、本酵素溶液０．１ ｍｌを用い、
前記した゛°酵素による方法″によってホスホリパーゼ
Ｄの活性を測定し、相対活性で示した結果は、第４図に
示すようになった。

本酵素はｐＨ６，５〜８．０の範囲で最も安定であった
が、ｐＨ５，５または９．５における処理によってもｐ
Ｈ６，５〜８．５での残存活性に対して７０％前後の活
性を示した。

以下に実施例を示す。

実施例 ｌ ＊ャ
可溶性澱粉２０９７ｄｌ、大豆粕１．０ｇ／ｄへ乾燥
酵母１．５ ｇ／ｃｌ１１Ｍｇ Ｓ ０４．７ Ｈ２０
０，Ｉ Ｖｃ１４ＫＨ２ＰＯ４０，３ｇ／ｄｌ、ＮａＣ
１０，３ｇ／ｄ１１豊年レシチンーＡＹ（豊年製油■）
０．２ ｉ／ｄｌからなる培地（ｐＨ７，２） １０
０ｒｎｌを５００１１１１溶坂ロフラスコに分注し、殺
菌後、この培地に寒天培地に着生した第４表に示す菌株
の胞子をそれぞれ一白金耳接種した。

培養は温度３０℃、攪拌２４０回転／分で５日間振盪培
養した。

培養終了液中の菌体を遠心分離によって除去した培養済
液中のホスホリパーゼＤの活性をデンジトメＩ−ＩＪ−
による方法あるいは酵素による方法によって測定しほぼ
一致した値を得た。

第４表には酵素による方法によって測定したホスホリパ
ーゼＤの活性を示した。

ラスコに入れたものを６本調製し、１２０℃で２０分殺
菌後、この種培地にミクロモノスポラ・チマルセアＫＹ
１９３６ （微工研菌寄第４２０１号）を接種した。

培養は温度３０℃、攪拌２４０回転／分で２日間振盪培
養した。

この培養液（６本全量）を下記の様に調整した３０１容
ジヤー・ファメンターに移した。

本培地は、可溶性澱粉３．０ ｇ／ｄｌ、大豆粕１．０
ｇ／ｄｌ、乾燥酵母２．０ ｇ／ｄＪｌ、 Ｍｇ５０４
−７Ｈ２００，０５ｇ／ｄｉ、 ＫＨ２ＰＯ４０，３ｇ
／ｄｌ、 Ｎａ Ｃ１０，２，ＦｃＵ。

豊年レシチンＡＹ（豊年製油■） ０．２ ｇ／ｄｌか
らなる培地（ｐＨ７，２）約１１を３（ｌ容ジャー・フ
ァメンターに入れ１２０°Ｃで１５分殺菌後、無菌水を
加えて１８１としたものを使用した。

３０Ａ’容ジヤー・ファメンターでの培養は通気量１２
１／分、攪拌３５０回転／分、温度３０℃で、４日間行
なった培養後、菌体を遠心分離によって除去し、培養済
液１６１１ （１３２ｍｕ／ｍｌ）にアセトン２４１を
加えた後、遠心分離を行なってホスホリパーゼＤを含む
沈澱物を得た。

この沈澱物を０．０５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）に
溶解し、セロハンチューブを透析膜として、同。

緩衝液で一夜（約１６時間）、５℃で透析した。

透析チューブ内液を０．０５ＭトＩＪス緩衝液（ｐＨ８
，０）で平衡にしたＤＥＡＥセルロースカラム（２１）
に通搭し、０．０５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）ニ０
．０５％（Ｗ／ｖ）のトリ）ンＸ−１００を溶解した液
に溶かした塩化ナトリウムの０〜１、ＯＭの濃度匂配で
溶出を行なった。

ホスホリパーゼＤの溶出区分を集め、これにアセトンを
添加し、６０％（Ｖ／Ｖ）アセトン溶液にした後、遠心
分離によって沈澱物を得た。

この沈澱物を０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）に
溶解し、上に述べた方法と同様にして一夜（約１６時間
）透析した。

透析内液は０．０５ＭトＩＪス緩衝液（ｐＨ８，０）で
平衡にしたＤＥＡＥ−セファデックス（５ｅｐｈａｄｅ
ｘ） Ａ −５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦｉｎｅＣｈ
ｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ、、製）カラム（５００１７１
１）に通搭し、０．０５％（Ｗ／ｖ）トリトンＸ−１０
０を含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解
した塩化ナトリウムのＯ〜０．６Ｍの濃度勾配で溶出を
行なった。

ホスホリパーゼＤの溶出区分を集め、これにアセトンを
添加し、６０％（■／■）アセトン溶液にした後、遠心
分離によって沈澱物を得た。

この沈澱物を０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）に
溶解した。

この溶解液をさらに同緩衝液で平衡したＤＥＡＥセファ
デックス（５ｅｐｈａｄｅｘ）Ａ −５０カラム（５０
０ｍｌ）に通搭し、０．０５％（Ｗ／■）トリトンｘ−
ｉｏｏを含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）に
溶解した塩化ナトリウムのＯ〜０．６Ｍの濃度勾配で溶
出を行なった。

溶出液をアンバーライトＸＡＤ −７（Ｒｏｈｍ＆Ｈａ
ａｓ Ｃｏ、製）（２００１７１１）のカラムに通して
トリトンＸ−１００を除去した。

この分離液にアセトンを添加し、６０％（Ｖ／Ｖ ）ア
セトン溶液にした後、遠心分離によって沈澱物を得た。

この沈澱物を０．０５ＭトｌＪス緩衝液（ｐＨ８，０）
に溶解し、上に述べた方法と同様にして一夜（約１６時
間）透析した後この透析内液を凍結乾燥した。

約２８％の活性収率でホスホリパーゼＤを採取した。

比活性は１２３Ｕ／■蛋白質であった。

実施例 ３ ミクロモノスポラ・エチノスポラ・サブエスピー・フエ
ルギエナＮＲＲＬ２９９５を可溶性澱粉２０ ｇ／ｄｌ
、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１ｇ／ｄｉ。

ＫＨ２ＰＯ４０，３ｇ／ｄｌ、 ＮａＣ１Ｏ，３ｇ／ｄ
ｉ、大豆粕１． Ｏｉ ／ｄｉ１粗レシチン０．２ ｇ
／ｄｌ、乾燥酵母１．５ｇ／ｄｌからなる培地３００ｒ
ｒＬｌを２１容三角フラスコに入れ１２０℃、２０分殺
菌したものに接種した。

種培養は温度３０℃、攪拌２４０回転／分で３日間行な
った。

この種培養液を可溶性澱粉３．０ ｇ／ｄｌ、 ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２００，ｌ ｇ／ｄｉ、 ＫＨ２ＰＯ４０，
３ｇ／ｄ１１ペプトン０．５．９ ／ｄ１１乾燥酵母２
０ ｇ／ｄｉｄ、 ＮａＣ１０，３ｇ／ｄｌからなる培
地（ｐＨ７，２）３１を５１容ジヤー・ファメンターに
入れ１２０℃、４０分殺菌したものに移した。

本培養は通気量３Ａ／分、攪拌５５０回転回転源度３０
℃で、５日間行なった。

該培養液より遠心分離によって菌体を除去した培養Ｆ液
２．６１（６７ｍｕ ／ｍｌ ）に硫酸アンモニウムを
添加して６０％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム飽和溶液と
し、得られる沈澱物を遠心分離によって集めた。

この集めた沈澱物を０．０５ＭトＩＪス緩衝液（ｐＨ８
，０）に溶解し、それを同緩衝液で平衡にした１１のセ
ファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ −２５に通塔し
、同緩衝液で溶出した。

ホスホリパーゼＤの溶出区分を集め凍結乾燥を行なった
。

該凍結乾燥物を０．０５ＭトＩＪス緩衝液（ｐＨ８，０
）に溶解した後、同緩衝液で平衡にしたＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−５０のカラム（５００１７２１）に通塔
し、０．０５％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００を含む０
．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した塩化す
ｌ−ＩＪウムのＯ〜０．６Ｍの濃度匂配で溶出を行なっ
た。

溶出したホスホリパーゼＤの活性区分に再び硫酸アンモ
ニウムを添加して６０％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム飽
和溶液として遠心分離により沈澱物を得た。

該沈澱物を０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）に溶
解し、セロハンチューブを透析膜として、同緩衝液で一
夜（約１６時間）５℃で透析した。

透析内液は０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）で平
衡にしたＤＥＡＥ−セルロースカラム（２００７７１１
）に通塔し、０．０５％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００
を含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し
た塩化ナトＩＪウムの０〜０．６Ｍの濃度匂配で溶出を
行なった。

溶出する活性区分に、硫酸アンモニウムを添加して６０
％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム飽和溶液として、遠心分
離により沈澱物を得た。

該沈澱物を０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）に溶
解し、セロハンチューブを透析膜として同緩衝液で一夜
（約１６時間）５℃で透析した。

透析内液からトリトンＸ−１００を除去するために、該
透析内液をアンバーライトＸＡＤ−７（１００ｄ）に通
塔した。

溶出液中の活性区分を集め、凍結乾燥した。

約２３％の活性収率でホスホリパーゼＤを採取した。

比活性は７７Ｕ／■蛋白質であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はホスホリパーゼＤの相対活性とｐＨとの関係を
示す。 第２図はホスホリパーゼＤの相対活性と温度との関係を
示す。 第３図はホスホリパーゼＤの熱安定性を示す。 第４図はホスホリパーゼＤのｐＨ安定性を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ミクロモノスポラ属に属し、ホスホリパーゼＤ生産
   能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にホス
   ホリパーゼＤを生成せしめ、これを採取することを特徴
   とするホスホリパーゼＤの製造法。