JPS5840466B2 - アシル−ＣｏＡ・オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
アシル−ＣｏＡ・オキシダ−ゼの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ（Ａｃｙｌ
−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｏｘｉｄａｓｅ ）の製
造法に関する。
−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｏｘｉｄａｓｅ ）の製
造法に関する。
従来より１モルのアシル−ＣｏＡより、１モルの酸素を
消費して、１モルの２・３−デヒドロアシル−ＣｏＡお
よび１モルの過酸化水素を生成する反応を触媒するアシ
ル−ＣｏＡ・オキシダーゼの微生物生産菌としては、キ
ャンシダ・ユテイリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉ
ｓ ）が報告されているにすぎないＣＡｒｃｈ、Ｂ ｉ
ｏｃｈｅｍ、 ｆ３１ｏｐｈｙｓ、 、 １７６゜５９
１−６０３（１９７６））。
消費して、１モルの２・３−デヒドロアシル−ＣｏＡお
よび１モルの過酸化水素を生成する反応を触媒するアシ
ル−ＣｏＡ・オキシダーゼの微生物生産菌としては、キ
ャンシダ・ユテイリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉ
ｓ ）が報告されているにすぎないＣＡｒｃｈ、Ｂ ｉ
ｏｃｈｅｍ、 ｆ３１ｏｐｈｙｓ、 、 １７６゜５９
１−６０３（１９７６））。
本発明者らは、マクロフオミナ
（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍ ｉｎａ ）属に属するマクロフ
オミナ・ファセオリＡ Ｔ ＣＣ１４３８３（Ｍａｃｒ
ｏｐｈｏｍ １ｎａｐｈａｓｅｏｌｉ ＡＴＣＣ１４
３８３）菌株（ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ ＣｏｌＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎＣａｔａ
ｌｏ ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ Ｉ （１９７８）
、）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ
）属に属するクラドスポリウム・レジナエＩＦＯ６３
６７（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｒｅｓｉｎａｅ
Ｉ ＦＯ６３６７）菌株（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ Ｆｏ
ｒ ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＯ８ＡＫＡ Ｌｉ５ｔ
ｏｆ Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ （１９７８） 、：１
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）属に属す
るアスペルギルス・キャンデイダスＭ−４８１５（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ Ｍ −４
８１５）菌株、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ）属に
属するモナスカス・ニス・ピー・Ｍ−４８００（Ｍｏｎ
ａｓｃｕｓ ｓｐ、 Ｍ２ＳＯ４）菌株などの糸状
菌、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）属に属するサツカロマイセス・セレビシェ ＹＯＯ３
６ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ Ｙ ００３６ ）菌株である酵母、アースロバフタ
− （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）属に属する７−スｒ：
ｘ ハクｐ −−ニス・ピー・Ｂ−０７２０（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ 。
オミナ・ファセオリＡ Ｔ ＣＣ１４３８３（Ｍａｃｒ
ｏｐｈｏｍ １ｎａｐｈａｓｅｏｌｉ ＡＴＣＣ１４
３８３）菌株（ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ ＣｏｌＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎＣａｔａ
ｌｏ ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ Ｉ （１９７８）
、）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ
）属に属するクラドスポリウム・レジナエＩＦＯ６３
６７（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｒｅｓｉｎａｅ
Ｉ ＦＯ６３６７）菌株（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ Ｆｏ
ｒ ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＯ８ＡＫＡ Ｌｉ５ｔ
ｏｆ Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ （１９７８） 、：１
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）属に属す
るアスペルギルス・キャンデイダスＭ−４８１５（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ Ｍ −４
８１５）菌株、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ）属に
属するモナスカス・ニス・ピー・Ｍ−４８００（Ｍｏｎ
ａｓｃｕｓ ｓｐ、 Ｍ２ＳＯ４）菌株などの糸状
菌、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）属に属するサツカロマイセス・セレビシェ ＹＯＯ３
６ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ Ｙ ００３６ ）菌株である酵母、アースロバフタ
− （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）属に属する７−スｒ：
ｘ ハクｐ −−ニス・ピー・Ｂ−０７２０（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ 。
Ｂ−０７２０）菌株である細菌が、アシルＣｏＡ・オキ
シダーゼを産生ずることを見い出し、該酵素を得た。
シダーゼを産生ずることを見い出し、該酵素を得た。
マス上記アスペルギルスーキャンデイダスＭ４８１５菌
株の肉眼的および顕微鏡的観察に基く各種培地上におけ
る菌学的特徴は、次に記載する通りである。
株の肉眼的および顕微鏡的観察に基く各種培地上におけ
る菌学的特徴は、次に記載する通りである。
（１）各培地における生育状態
■ ツアペック寒天培地
２６℃での生育は遅く、培養１０日で１５〜１８工に達
するのみである。
するのみである。
集落は薄く平坦。
集落の色は培養初期は白色、分生子が多数でき、成熟す
るにつれてクリーム （Ｃｒｅａｍ （ｈｕｅ １ ％Ｃａ ） ）ないしペ
ールイエｏ （Ｐａｌｅ Ｙｅｌｌｏｗ （ｈｕ
ｅ ＩＣａ ））となる。
るにつれてクリーム （Ｃｒｅａｍ （ｈｕｅ １ ％Ｃａ ） ）ないしペ
ールイエｏ （Ｐａｌｅ Ｙｅｌｌｏｗ （ｈｕ
ｅ ＩＣａ ））となる。
菌核は作らない。裏面は無色。拡散性色素および浸出液
は出さない。
は出さない。
■ 麦芽エキス寒天培地
２６０℃での生育は普通で、培養１０日で直径４２〜４
５ｍｍに達する。
５ｍｍに達する。
集落は薄く平坦。集落の色は培養初期は白色、分生子が
多数でき、成熟するにつれてクリーム（ｈｕｅ １％Ｃ
ａ）となる。
多数でき、成熟するにつれてクリーム（ｈｕｅ １％Ｃ
ａ）となる。
裏面は無色。拡散性色素および浸出液は出さない。
（２）顕微鏡的観察
分生子頭は白色ないしクリーム、比較的大きく、直径５
００〜８００μ、初期には球形、古くなると数本放射状
に分かれる。
００〜８００μ、初期には球形、古くなると数本放射状
に分かれる。
分生子柄は長さ５００〜１０００μ、幅８〜１５μ、壁
は滑面。
は滑面。
頂の５は球形ないし悪球形、直径２０〜４０μ。
検子は二段。第−検子は５．０〜１２．０×３．０〜４
．０μ、第二接子は５．０〜７． ＯＸ ２．５〜３．
０μ。
．０μ、第二接子は５．０〜７． ＯＸ ２．５〜３．
０μ。
分生子は球形、２．５〜３．５μ、壁は滑面。
（３Ｊ 生理的性質
■ 最適生育条件
最適生育ｐＨ： ４〜９、
最適生育温度：２５〜３２℃、
■ 生育し得る範囲
生育し得るｐＨ： ３〜１１、
生育し得る温度：１５〜３７℃、
上記の特徴より、車両Ｍ４８１５菌株はその分生子の先
端に頂の５を持ち、頂の５上に多数の検子ができ、その
先端に１細胞の分生子が連鎖することからアスペルギル
ス属に属すると認められ、さらにその分生子頭が大きく
、白色ないしクリーム色の分生子を豊富に作ることから
、アスペルギルス・キャンデイダスと同定され（Ｋ、
Ｂ 、 Ｒａｐｅｒ＆Ｄ、 Ｉ、Ｆｅｎｎｅｌｌ 、
Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ。
端に頂の５を持ち、頂の５上に多数の検子ができ、その
先端に１細胞の分生子が連鎖することからアスペルギル
ス属に属すると認められ、さらにその分生子頭が大きく
、白色ないしクリーム色の分生子を豊富に作ることから
、アスペルギルス・キャンデイダスと同定され（Ｋ、
Ｂ 、 Ｒａｐｅｒ＆Ｄ、 Ｉ、Ｆｅｎｎｅｌｌ 、
Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ。
６８６ＰＰ（１９６５）、Ｊ、Ａ、ＶＯＩＩ Ａｒｘｌ
Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ Ｓｐ
ｏｒｕｌａｔｉｎｇ １ｎＰｕｒｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
、 ３１５ｐＩ）、（１９７４））、車両をアスペルギ
ルス・キャンデイダスＭ ４８１５と命名した（工業技術院微生物工業技術研究所
、微生物受託番号通知書微工研菌寄第５２２６号、ＦＥ
ＲＭ−ＰＡ５２２６）。
Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ Ｓｐ
ｏｒｕｌａｔｉｎｇ １ｎＰｕｒｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
、 ３１５ｐＩ）、（１９７４））、車両をアスペルギ
ルス・キャンデイダスＭ ４８１５と命名した（工業技術院微生物工業技術研究所
、微生物受託番号通知書微工研菌寄第５２２６号、ＦＥ
ＲＭ−ＰＡ５２２６）。
さらに上記モナスカス・ニス・ピー・Ｍ
４８００菌株の種々の菌学的特徴は次の通りである。
（１）各培地上における生育状態
■ 麦芽エキス寒天培地
２６℃での生育は速く、培養１０日で６０〜６５１１１
ｒＩＬに達する。
ｒＩＬに達する。
集落は薄く、平坦。培養初期は白色の空中菌糸が綿毛状
に生育するが、培養が進むにつれて綿毛状は薄れる。
に生育するが、培養が進むにつれて綿毛状は薄れる。
色はコーラル〔Ｃ０ｒａｌ（ｈｕｅ７１Ｃ）〕。
裏面はブリックレッド（Ｂｒ１ｃｋ Ｒｅｄ （ｈｕｅ
６μｇ ） ） 。
６μｇ ） ） 。
■ バレイショ・ブドウ糖寒天培地
２６℃での生育は速く、培養１０日で６０〜６３朋に達
する。
する。
集落は薄く、平坦。中央部がやや盛り上がる。
培養初期は白色の空中菌糸が綿毛状に生育するが、培養
が進むにつれて綿毛状は薄れる。
が進むにつれて綿毛状は薄れる。
色はコロニアルローズ（Ｃｏ１ｏｎｉａｌ Ｒｏｓｅ
（ｈｕｅ ７ ｉｃ ） 〕。
（ｈｕｅ ７ ｉｃ ） 〕。
裏面はブリックレッド（ｈｕｅ ６ ｒｒｇ ）。
（２）顕微鏡的観察
子の５果は球形で、直径２０〜４５μ、４０〜６０×３
〜５μの茎の頂部に形成。
〜５μの茎の頂部に形成。
子の５は初期に消滅し明確でない。
子のう胞子は楕円形で４．５〜５．５Ｘ４〜４．５μ、
無色、壁は滑面。
無色、壁は滑面。
分生子はメリステンアルスロスポア型
（Ｍｅｒｉｓｔｅｍ−ａｒｔｈｒｏｓｐｏｒｅ ｔｙ
ｐｅ ）で１分生胞子柄の先端に鎖状に形成。
ｐｅ ）で１分生胞子柄の先端に鎖状に形成。
西洋梨形、無色、直径７〜１０μ。
栄養菌糸内に赤褐色の色素を形成。（３Ｊ 生理的性
質 ■ 最適生育条件 最適生育ｐＨ： ４〜９、 最適生育温度；２２・〜３０℃、 ■ 生育し得る範囲 生育し得るｐＨ： ３〜１１１ 生育し得る温度：１５〜３５℃、 上記の通り、車両Ｍ−４８００菌株は、茎の頂部に球形
の子の５果を形成し、子の５が早期に消滅するなどの特
色が認められ、これよりモナスカス属に属すると認めら
れた（ Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａ ｏｆＦｕｎｇｉ
Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ ｉｎ Ｆｕｒｅ Ｃｕ１
ｔｕｒｅ１３１５ｐｐ、（１９７４）Ｌ車両をモナスカ
ス・ニス・ピー・Ｍ−４８００と命名した（工業技術院
微生物工業技術研究所、微生物受託香号通知書微工研菌
寄第５２２５号、ＦＥＲＭ−Ｐ／１６５２２５）さらに
また上記のサンカロマイセス・セレビシェ ＹＯＯ３６
菌株の種々の菌学的特徴は次の通りである。
質 ■ 最適生育条件 最適生育ｐＨ： ４〜９、 最適生育温度；２２・〜３０℃、 ■ 生育し得る範囲 生育し得るｐＨ： ３〜１１１ 生育し得る温度：１５〜３５℃、 上記の通り、車両Ｍ−４８００菌株は、茎の頂部に球形
の子の５果を形成し、子の５が早期に消滅するなどの特
色が認められ、これよりモナスカス属に属すると認めら
れた（ Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａ ｏｆＦｕｎｇｉ
Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ ｉｎ Ｆｕｒｅ Ｃｕ１
ｔｕｒｅ１３１５ｐｐ、（１９７４）Ｌ車両をモナスカ
ス・ニス・ピー・Ｍ−４８００と命名した（工業技術院
微生物工業技術研究所、微生物受託香号通知書微工研菌
寄第５２２５号、ＦＥＲＭ−Ｐ／１６５２２５）さらに
また上記のサンカロマイセス・セレビシェ ＹＯＯ３６
菌株の種々の菌学的特徴は次の通りである。
（１）各培地上における生育状態
■ ＭＹ液体培地
２６℃で良く生育するが、培地の底面のみで生育する。
皮膜は形成しない。生育によって培地はかすかに濁る程
度で、培地の着色はほとんど無い。
度で、培地の着色はほとんど無い。
■ ＭＹ寒天培地
２６℃で良く生育する。
巨大コロニーの周縁は金縁またはわずかに波状。
中央が盛り上がり、円錐状ないし鎖状を呈する。
表面は放射状に数本のシワを持つ。
光沢は鈍光。性状はバター質。
色はクリーム色。■ バレイショ抽出液寒天培地による
スライド培養 栄養細胞は、大きさ３．０〜８． ＯＸ ２．５〜７．
０μ。
スライド培養 栄養細胞は、大きさ３．０〜８． ＯＸ ２．５〜７．
０μ。
悪球形、卵形ないし楕円形。多極出芽により増殖。
菌糸および仮性菌糸は形成されない。
（２）子の５胞子の形成
ゴロドコソ培地において子の５胞子を良く形成する。
球形ないし卵円形。平滑面。直径２，５〜３．０μｏ
１子の５当り１〜４個形成される。
１子の５当り１〜４個形成される。
（３１射出胞子の形成
（４）生理的性質
■ 最適生育条件
最適生育ｐＨ：３〜７、
最適生育温度：２０〜３０℃、
■ 生育の範囲
生育し得るｐＨ： ２〜９、
生育し得る温度：１０〜４０℃、
■ 硝酸塩の同化：
■ 脂肪の分解：
■ 尿素の分解：
■ ゼラチンの液化：
■ 耐浸透圧性：ＮａＣ１の生育限度１２〜１４上記の
通り、車両ＹＯＯ３６菌株は、酵母で、球形ないし卵円
形、平滑面の子の５胞子を形成し、栄養細胞は多極出芽
により増殖、射出胞子を形せず、硝酸塩を資化せず、ま
たグルコースを良く発酵するなどの特色からサツカロマ
イセス属に属しさらに詳細な菌の形態、増殖の仕方、糖
の発酵性および同化性、その他の生理的性質を調べた結
果サツカロマイセス・セレビシェの記＠Ｈ：Ｊ。
通り、車両ＹＯＯ３６菌株は、酵母で、球形ないし卵円
形、平滑面の子の５胞子を形成し、栄養細胞は多極出芽
により増殖、射出胞子を形せず、硝酸塩を資化せず、ま
たグルコースを良く発酵するなどの特色からサツカロマ
イセス属に属しさらに詳細な菌の形態、増殖の仕方、糖
の発酵性および同化性、その他の生理的性質を調べた結
果サツカロマイセス・セレビシェの記＠Ｈ：Ｊ。
Ｌｏｄｄｅｒ１’Ｉ’ｈｅ Ｙｅａｓｔ、 ａ ｊ
ｏｘｏｎｏｍｉｃｓｔｕｄｙ、 １３８５ｐｐ、（１
９７０））と良く一致したもので、車両ＹＯＯ３６菌株
をサツカロマイセス・セレビシェ ＹＯＯ３６と命名し
た（工業技術院微生物工業技術研究所、微生物受託番号
通知書微工研菌寄第５１７４号、ＦＥＲＭ−Ｐ應５１７
４）。
ｏｘｏｎｏｍｉｃｓｔｕｄｙ、 １３８５ｐｐ、（１
９７０））と良く一致したもので、車両ＹＯＯ３６菌株
をサツカロマイセス・セレビシェ ＹＯＯ３６と命名し
た（工業技術院微生物工業技術研究所、微生物受託番号
通知書微工研菌寄第５１７４号、ＦＥＲＭ−Ｐ應５１７
４）。
さらに上記のアースロバフタ−・ニス・ピー・１３−０
７２０菌株の菌学的特徴は次の通りである３（１）各培
地上における生育状態 ■ 普通寒天平板培地 円形の集落を形成し、縁は滑らかで丘状。
７２０菌株の菌学的特徴は次の通りである３（１）各培
地上における生育状態 ■ 普通寒天平板培地 円形の集落を形成し、縁は滑らかで丘状。
２〜３日後灰白色より淡黄色を呈するようになる。
■ 普通寒天斜面培地
生育良好で線状に生育。
２〜３日後午後不溶性黄色の色素を産生ずる。
■ ブイヨン培地
生育は弱いが、一様に混濁する。
菌膜は形成しない。
■ ＢＣＰミルク培地
５〜７日後弱アルカリになる。
（２）顕微鏡的観察
■ 細胞の形、大きさ
若い細胞（培養約６時間）は直線状もしくはやや曲った
桿状、梶棒状で、分岐細胞もわずかであるが存在する。
桿状、梶棒状で、分岐細胞もわずかであるが存在する。
古い細胞（培養２０時間以上）は短稈状または球状にな
る（多形性を有する）。
る（多形性を有する）。
大きさは若い細胞で０．５〜０．８Ｘ１．５〜３．０μ
、古い細胞で０．５〜０．８×０．５〜１０μ。
、古い細胞で０．５〜０．８×０．５〜１０μ。
芽胞は形成しない。■ 運動性
亜極毛（Ｓｕｂｐｏｌａｒ ｆｌａｇｅｌｌａ）また
は極毛（３）生理的性質 ■ 生育温度 １０℃では生育しない。
は極毛（３）生理的性質 ■ 生育温度 １０℃では生育しない。
４２℃では弱く生育する。
２５〜３５℃で良く生育する。■ 生育ｐＨ
ｐＨ６，０テハ生育しない。
ｐＨ６，５〜９．０で生育する。
■ 染色性
ダラム染色：＋
抗酸性染色：
■ セルロースの分解：
■ ゼラチンの分解：十
■ カゼインの分解：十
■ エスクリンの分解：
■ デンプンの分解：＋
■ カタラーゼの産生：＋
［相］ オキシダーゼの産生：＋
０ ウレアーゼの産生：
０ インドールの産生：
０ 硫化水素の産生：
０ アセトインの産生：
［相］ 硝酸塩の還元：＋
［相］ クエン酸塩の利用：＋
＠ アンモニウムの利用二十
［相］ 硝酸塩のオＵ用：＋
［相］ ＯＦテスト′：０（好気性）
〔※； Ｊ、 ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、３０．
４００〜４２７（１９６３）） ［相］ 糖類より酸の産生※ 酸度性（ガスは産生じない） Ｌ（−）−）−アラビノース、セロビオース、Ｄガラク
トース、Ｄ−グルコース、グリセリン、ラクトース、Ｄ
−マンノース、デンプン、シュクロース 酸非産生 アドニトール、ヅルジトール、メン−エリスリトール、
フコース、イノシトール、イヌリン、マルト−ス、マン
ニトール、メレシトース、メリビオース、ラフィノース
、Ｌ（＋）ラムノース、ザリシン、Ｌ（−１−ソルボー
ス、ソルビトール、トレハロース、 上記の通り、車両Ｂ−０７２０菌株は、ダラム陽性、非
抗酸性で、多形状を有する好気性の細菌であり、セルロ
ースを分解しないなどの特色から／ アースロバフタ−属の記載ＣＢｅｒｇｅｙ、ｈ Ｍａｎ
ｕａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ第８版、（１９４１）、Ｃａｎ、Ｊ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｏ、２０．１４１１〜１４１４（１
９７４）、ｌとよく一致し、その他の性状より、半画を
アースロバフタ−・ニス・ピー・Ｂ−０７２０と命名し
た（工業技術院微生物工業技術研究所、微生物受託香号
通知書微工研菌寄第５２２４号、ＦＥＲＭ−Ｐ／ｌ６５
２２４）本発明は、上記の知見に基いて完成されたもの
で、マクロフオミナ属、クラドスポリウム属、アスペル
ギルス属、モナスカス属、サツカロマイセス属またはア
ースロバフタ−属に属するアシルＣＯＡ・オキシダーゼ
生産菌を培地に培養し、次いで培養物からアシル−Ｃｏ
Ａ・オキシダーゼを採取することを特徴とするアシル−
ＣｏＡ・オキシダーゼの製造法である。
４００〜４２７（１９６３）） ［相］ 糖類より酸の産生※ 酸度性（ガスは産生じない） Ｌ（−）−）−アラビノース、セロビオース、Ｄガラク
トース、Ｄ−グルコース、グリセリン、ラクトース、Ｄ
−マンノース、デンプン、シュクロース 酸非産生 アドニトール、ヅルジトール、メン−エリスリトール、
フコース、イノシトール、イヌリン、マルト−ス、マン
ニトール、メレシトース、メリビオース、ラフィノース
、Ｌ（＋）ラムノース、ザリシン、Ｌ（−１−ソルボー
ス、ソルビトール、トレハロース、 上記の通り、車両Ｂ−０７２０菌株は、ダラム陽性、非
抗酸性で、多形状を有する好気性の細菌であり、セルロ
ースを分解しないなどの特色から／ アースロバフタ−属の記載ＣＢｅｒｇｅｙ、ｈ Ｍａｎ
ｕａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ第８版、（１９４１）、Ｃａｎ、Ｊ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｏ、２０．１４１１〜１４１４（１
９７４）、ｌとよく一致し、その他の性状より、半画を
アースロバフタ−・ニス・ピー・Ｂ−０７２０と命名し
た（工業技術院微生物工業技術研究所、微生物受託香号
通知書微工研菌寄第５２２４号、ＦＥＲＭ−Ｐ／ｌ６５
２２４）本発明は、上記の知見に基いて完成されたもの
で、マクロフオミナ属、クラドスポリウム属、アスペル
ギルス属、モナスカス属、サツカロマイセス属またはア
ースロバフタ−属に属するアシルＣＯＡ・オキシダーゼ
生産菌を培地に培養し、次いで培養物からアシル−Ｃｏ
Ａ・オキシダーゼを採取することを特徴とするアシル−
ＣｏＡ・オキシダーゼの製造法である。
本発明における使用菌としては、上記のマクロフオミナ
属に属するマクロフオミナ・ファセオリＡＴＣＣ１４３
８３菌株、クラドスポリウム属に属するクラドスポリウ
ム・レジナエＩＦＯ６３６７菌株、アスペルギルス属に
属するアスペルギルス・キャンデイダスＭ−４８１５菌
株、モナスカス属にｉするモナスカス・ニス・ピー・Ｍ
−４８００菌株、サツカロマイセス属に属するサツカロ
マイセス・セレビシェ ＹＯ０３６菌株、７−スロバク
ター属に属するアースロバフタ−・ニス・ピー・Ｂ−０
７２０菌株はその一例であって、これらの菌だけでなく
、マクロフオミナ属、クラドスポリウム属、アスペルギ
ルス属、モナスカス属、サツカロマイセス属、アースロ
バフタ−属に属する菌でアシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ
を生産する菌はすべて本発明において使用でき、また自
然的、人工的に変異した変異株であってもアシル−Ｃｏ
Ａ・オキシダーゼの生産能力を失わない限り、本発明に
使用し得るものである。
属に属するマクロフオミナ・ファセオリＡＴＣＣ１４３
８３菌株、クラドスポリウム属に属するクラドスポリウ
ム・レジナエＩＦＯ６３６７菌株、アスペルギルス属に
属するアスペルギルス・キャンデイダスＭ−４８１５菌
株、モナスカス属にｉするモナスカス・ニス・ピー・Ｍ
−４８００菌株、サツカロマイセス属に属するサツカロ
マイセス・セレビシェ ＹＯ０３６菌株、７−スロバク
ター属に属するアースロバフタ−・ニス・ピー・Ｂ−０
７２０菌株はその一例であって、これらの菌だけでなく
、マクロフオミナ属、クラドスポリウム属、アスペルギ
ルス属、モナスカス属、サツカロマイセス属、アースロ
バフタ−属に属する菌でアシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ
を生産する菌はすべて本発明において使用でき、また自
然的、人工的に変異した変異株であってもアシル−Ｃｏ
Ａ・オキシダーゼの生産能力を失わない限り、本発明に
使用し得るものである。
本発明を実施するに当って、まず上記のアシルＣＯＡ・
オキシダーゼ生産菌を、酵素を生産する通常の方法で培
養する。
オキシダーゼ生産菌を、酵素を生産する通常の方法で培
養する。
培養の形態は液体培養でも固体培養でもよいが、工業的
にはアシルＣｏＡ・オキシダーゼ生産菌の種菌をその生
産用液体培地に接種し、通気攪拌培養を行なうのが有利
である。
にはアシルＣｏＡ・オキシダーゼ生産菌の種菌をその生
産用液体培地に接種し、通気攪拌培養を行なうのが有利
である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用（・られ
るものが広く使用される。
るものが広く使用される。
炭素源としては、同化可能な炭素化合物であればよく、
例えばグルコース、ガラクトース、糖蜜、デンプン加水
分解物、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸。
例えばグルコース、ガラクトース、糖蜜、デンプン加水
分解物、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸。
パルミトレイン酸、ミリストレイン酸などの高級脂肪酸
などが使用される。
などが使用される。
窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例
えばペプトン大豆粉、脱脂大豆粉、カゼイン氷解物、コ
ーン・スチープ・リカー、種々の肉エキス、酵母エキス
硝酸塩、アンモニウム塩などが使用される。
えばペプトン大豆粉、脱脂大豆粉、カゼイン氷解物、コ
ーン・スチープ・リカー、種々の肉エキス、酵母エキス
硝酸塩、アンモニウム塩などが使用される。
その他、食塩、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マ
ゲネシウムなどの塩類が必要に応じて使用される。
ゲネシウムなどの塩類が必要に応じて使用される。
また培地中の炭素源としてオレイン酸などの高級脂肪酸
を使用することにより、培養時アシルＣｏＡ・オキシダ
ーゼの生産能を上昇せしめることが好ましく、またその
添加量としては好ましくは０．５〜１％程度である。
を使用することにより、培養時アシルＣｏＡ・オキシダ
ーゼの生産能を上昇せしめることが好ましく、またその
添加量としては好ましくは０．５〜１％程度である。
また、培養温度は菌が発育し、アシル−ＣｏＡ・オキシ
ダーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、上記生産
菌の糸状菌の場合は好ましくは２５〜３０℃、酵母や細
菌の場合は好ましくは２８〜３３℃である。
ダーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、上記生産
菌の糸状菌の場合は好ましくは２５〜３０℃、酵母や細
菌の場合は好ましくは２８〜３３℃である。
培養時間は条件によって多少異なるが、糸状菌の場合は
４０〜ｉｏｏ時間、酵母の場合は５０〜８０時間、細菌
の場合は１５〜４０時間程度であって、各々アシル−Ｃ
ＯＡ・オキシダーゼが最高高価に達する時期をみはから
って適当な時期に培養を終了すればよい。
４０〜ｉｏｏ時間、酵母の場合は５０〜８０時間、細菌
の場合は１５〜４０時間程度であって、各々アシル−Ｃ
ＯＡ・オキシダーゼが最高高価に達する時期をみはから
って適当な時期に培養を終了すればよい。
かくして得られた培養物において、アシル−ＣｏＡ・オ
キシダーゼはその菌体内に含有、蓄積されている。
キシダーゼはその菌体内に含有、蓄積されている。
このようにして得られた培養物よりアシルＣｏＡ・オキ
シダーゼを抽出し、粗製のアシル−ＣｏＡ・オキシダー
ゼ含有液を得るために、例示すれば、まず培養液を固液
分離し、得られた湿菌体を、必要に応じてリン酸緩衝液
やトリス塩酸塩側液などに懸濁せしめ、次いでリゾチー
ム処理、超音波処理やフレンチプレス処理などの菌体処
理手段を適宜選択組合せて、菌体内よりアシルＣｏＡ・
オキシダーゼを抽出して、この抽出液を遠心処理して、
粗製のアシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ含有液を得る。
シダーゼを抽出し、粗製のアシル−ＣｏＡ・オキシダー
ゼ含有液を得るために、例示すれば、まず培養液を固液
分離し、得られた湿菌体を、必要に応じてリン酸緩衝液
やトリス塩酸塩側液などに懸濁せしめ、次いでリゾチー
ム処理、超音波処理やフレンチプレス処理などの菌体処
理手段を適宜選択組合せて、菌体内よりアシルＣｏＡ・
オキシダーゼを抽出して、この抽出液を遠心処理して、
粗製のアシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ含有液を得る。
次いでこの粗製のアシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ含有液
を、さらに公知の蛋白質、酵素などの単離、精製手段を
用いて精製されたアシル−ＣｏＡ・オキシダーゼを得る
。
を、さらに公知の蛋白質、酵素などの単離、精製手段を
用いて精製されたアシル−ＣｏＡ・オキシダーゼを得る
。
例えば粗製のアシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ含有液にア
セトン、エタノール、イソプロパツールなどの有機溶剤
を加えて分別沈澱せしめるか、硫安などの塩類を加えて
塩析せしめるかしてその含有液から目的物を沈澱せしめ
、これを回収すればよい。
セトン、エタノール、イソプロパツールなどの有機溶剤
を加えて分別沈澱せしめるか、硫安などの塩類を加えて
塩析せしめるかしてその含有液から目的物を沈澱せしめ
、これを回収すればよい。
さらにこの沈澱物を精製するに際し、例えば電気泳動法
などにて単一のスポットを示すまでに精製すればよく、
その精製手段としては上記の沈澱物をリン酸緩衝液やト
リス塩酸緩衝液などの媒体に溶解し、ジエチルアミノエ
チル−セルロース（１）ＥＡＥ−セルロース）ヤシエチ
ルアミノエチル−デキストランゲルなどのイオン交換樹
脂、デキストランゲル、ポリアクリルアマイドゲルなど
のゲルを過剤によるクロマトグラフ法を行えばよい。
などにて単一のスポットを示すまでに精製すればよく、
その精製手段としては上記の沈澱物をリン酸緩衝液やト
リス塩酸緩衝液などの媒体に溶解し、ジエチルアミノエ
チル−セルロース（１）ＥＡＥ−セルロース）ヤシエチ
ルアミノエチル−デキストランゲルなどのイオン交換樹
脂、デキストランゲル、ポリアクリルアマイドゲルなど
のゲルを過剤によるクロマトグラフ法を行えばよい。
またこれらの手段は適宜組合せて行なえばよく、次いで
これを凍結乾燥などの手段により乾燥してアシル−Ｃｏ
Ａ・オキシダーゼの精製粉末を得る。
これを凍結乾燥などの手段により乾燥してアシル−Ｃｏ
Ａ・オキシダーゼの精製粉末を得る。
次いで本発明によって得られたアシル−ＣｏＡ・オキシ
ダーゼは、以下に述べる力価の測定法に基いて測定され
、またその理化学的性質は以下の通りである。
ダーゼは、以下に述べる力価の測定法に基いて測定され
、またその理化学的性質は以下の通りである。
（１） 力価の測定法
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）あるいは０．２Ｍ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） ０．１ｒｒＬｌ、５
ｍＭ４−アミノアンチピリン０．０５ｒｒＬｌ、３ｒｒ
ＬＭジエチルメタトルイジン０．０５７７１１．０．５
ｒｒｂｙ／ｍｌ ヘルオキシダーゼ０．０５ｍｆ、２５
ｍＭパルミトイ／Ｌ／−ＣＯＡ Ｏ，０２ｒＩＬｌ、蒸
留水０．２３ｍ１よりなる反応液０．５ｍｌに、酵素液
１０μｌを加えて、３７℃にて１０分間反応させた後Ｑ
、５ｍ／？０４Ｍ尿素を加えて反応を停止せしめ、その
後これに、２ｍｌ、０１％トリトンＸ−１００を加えて
５４５ｎｍにて比色し、生成した過酸化水素量を求める
。
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） ０．１ｒｒＬｌ、５
ｍＭ４−アミノアンチピリン０．０５ｒｒＬｌ、３ｒｒ
ＬＭジエチルメタトルイジン０．０５７７１１．０．５
ｒｒｂｙ／ｍｌ ヘルオキシダーゼ０．０５ｍｆ、２５
ｍＭパルミトイ／Ｌ／−ＣＯＡ Ｏ，０２ｒＩＬｌ、蒸
留水０．２３ｍ１よりなる反応液０．５ｍｌに、酵素液
１０μｌを加えて、３７℃にて１０分間反応させた後Ｑ
、５ｍ／？０４Ｍ尿素を加えて反応を停止せしめ、その
後これに、２ｍｌ、０１％トリトンＸ−１００を加えて
５４５ｎｍにて比色し、生成した過酸化水素量を求める
。
酵素活性は、１分間に１μｍ０１ｅの過酸化水素を生成
する酵素量を１単位（ＩＵ）とする。
する酵素量を１単位（ＩＵ）とする。
（２）作用
１モルのアシル−ＣｏＡ より、１モルの酸素を消費し
て、１モルの２・３−デヒドロアシル−ＣＯＡおよび１
モルの過酸化水素を生成する。
て、１モルの２・３−デヒドロアシル−ＣＯＡおよび１
モルの過酸化水素を生成する。
（３Ｊ 至適ｐＨ
緩衝液としてｐＨ６，０〜７．０；ジメチルグルタル酸
−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ６，５〜７．５ ニリン酸−Ｎ
ａＯＨ緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０ ： ）リス塩酸緩
衝液を用いて、力価の測定法に従って、各々の活性を測
定し、その至適ｐＨを求めた。
−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ６，５〜７．５ ニリン酸−Ｎ
ａＯＨ緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０ ： ）リス塩酸緩
衝液を用いて、力価の測定法に従って、各々の活性を測
定し、その至適ｐＨを求めた。
その結果、各生産菌を培養して得られたアシル−ＣｏＡ
・オキシダーゼの至適ｐＨは次の通りであった。
・オキシダーゼの至適ｐＨは次の通りであった。
生 産 菌 至適ｐＨ
・アースロバフタ−・ニス・ピ ８．０〜８．５−・Ｂ
−０７２０ ・マクロフオミナ・ファセオリ ＡＴＣＣ１４３８３ ６，５〜７．５ ・クラドスポリウム ＩＦ０６３６７ ・レジナエ ６．５〜７．５ ・アスペルギルス・キャンティ ダスＭ−４８１５ ６，５〜７．５ ・モナスカス・ニス・ビー・Ｍ ６．５〜８．０８０
０ ・サツカロマイセス・セレビシ ８．０付近工ＹＯＯ３
６ また第１図・−・は、アースロバフタ−・ニス・ビー・
Ｂ−０７２０菌株よりのアシルＣｏＡ・オキシダーゼの
至適ｐＨ１第１図〇−〇はマクロフオミナ・ファセオリ
ＡＴＣＣ１４３８３菌株よりのアシル−ＣＯＡ−オキシ
ダーゼの至適ｐＨを示す。
−０７２０ ・マクロフオミナ・ファセオリ ＡＴＣＣ１４３８３ ６，５〜７．５ ・クラドスポリウム ＩＦ０６３６７ ・レジナエ ６．５〜７．５ ・アスペルギルス・キャンティ ダスＭ−４８１５ ６，５〜７．５ ・モナスカス・ニス・ビー・Ｍ ６．５〜８．０８０
０ ・サツカロマイセス・セレビシ ８．０付近工ＹＯＯ３
６ また第１図・−・は、アースロバフタ−・ニス・ビー・
Ｂ−０７２０菌株よりのアシルＣｏＡ・オキシダーゼの
至適ｐＨ１第１図〇−〇はマクロフオミナ・ファセオリ
ＡＴＣＣ１４３８３菌株よりのアシル−ＣＯＡ−オキシ
ダーゼの至適ｐＨを示す。
（４）ｐＨ安定性
各ｐＨの緩衝液に酵素液を加え、３７℃にて６０分間放
置した後その残存活性を測定した。
置した後その残存活性を測定した。
またその各ｐＨの緩衝液としては、ｐＨ６，５〜７．５
；リン酸緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０；）リス塩酸緩衝
液、ｐＨ９，０〜１０．０；グリシンＮａＯＨ緩衝液を
使用した。
；リン酸緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０；）リス塩酸緩衝
液、ｐＨ９，０〜１０．０；グリシンＮａＯＨ緩衝液を
使用した。
その結果、各生産菌を培養して得られたアシル−ＣｏＡ
・オキシダーゼのｐＨ安定性は次の通りである。
・オキシダーゼのｐＨ安定性は次の通りである。
生 産 菌 ｐＨ安定性
・アースロバフタ−・ニス・ ６０〜７．５ビー・Ｂ−
０７２０ ・マクロフオミナ・ファセオ ６．５〜８．５すＡＴＣ
Ｃ１４３８３ ・クラドスポリウム・レジナ ６．５〜８．０工ＩＦＯ
６３６７ ・アスペルギルス・キャ７デ ６．５〜８．５イダスＭ
−４８１５ ・モナスカス・ニス・ビー・ ６．５〜８．０Ｍ−４８
００ ・サツカロマイセス・セレビ ６．０〜１０．ＯシエＹ
ＯＯ３６ また、第２図・−・はアースロバフタ−・ニス・ピー・
ＢＯ７２０菌株よりのアシル ＣｏＡ・オキシダーゼのｐＨ安定性、第２図〇−〇はマ
クロフオミナ・ファセオリＡＴＣＣ１４３８３菌株より
のアシル−ＣｏＡ・オキシタ”−ゼのｐＨ安定性を示す
。
０７２０ ・マクロフオミナ・ファセオ ６．５〜８．５すＡＴＣ
Ｃ１４３８３ ・クラドスポリウム・レジナ ６．５〜８．０工ＩＦＯ
６３６７ ・アスペルギルス・キャ７デ ６．５〜８．５イダスＭ
−４８１５ ・モナスカス・ニス・ビー・ ６．５〜８．０Ｍ−４８
００ ・サツカロマイセス・セレビ ６．０〜１０．ＯシエＹ
ＯＯ３６ また、第２図・−・はアースロバフタ−・ニス・ピー・
ＢＯ７２０菌株よりのアシル ＣｏＡ・オキシダーゼのｐＨ安定性、第２図〇−〇はマ
クロフオミナ・ファセオリＡＴＣＣ１４３８３菌株より
のアシル−ＣｏＡ・オキシタ”−ゼのｐＨ安定性を示す
。
（５）熱安定性
４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃の各濃度にて
１０分間処理して、その残存測定を求めた。
１０分間処理して、その残存測定を求めた。
その結果、各生産菌を培養して得られたアシル−ＣｏＡ
・オキシダーゼの熱安定性は次の通りであった。
・オキシダーゼの熱安定性は次の通りであった。
生産菌 鞍定性
・アースロバフタ−・ニス・ピ ４５℃以下−・Ｂ−０
７２０ ・マクロフオミナ・ファセオリ ４０℃以下ＡＴＣＣ１
４３８３ ・クラドスポリウム・レジナエ ４０℃以下ＩＦＯ６３
６７ ・アスペルギルス・キャンディ ４０℃以下ダスＭ−４
８１５ ・モナスカス・ニス・ピー・Ｍ ４０℃以下４８００ ・サツカロマイセス・セレジシ ４５℃以下工ＹＯＯ３
６ また、第３図・−・はアースロバフタ−・ニス・ピー・
ＢＯ７２０菌株よりのアシル ＣｏＡ・オキシダーゼの熱安定性、第３図○−Ｃはマク
ロフオミナ・ファセオリＡＴＣＣ １４、３８３菌株よりのアシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ
の熱安定性を示す。
７２０ ・マクロフオミナ・ファセオリ ４０℃以下ＡＴＣＣ１
４３８３ ・クラドスポリウム・レジナエ ４０℃以下ＩＦＯ６３
６７ ・アスペルギルス・キャンディ ４０℃以下ダスＭ−４
８１５ ・モナスカス・ニス・ピー・Ｍ ４０℃以下４８００ ・サツカロマイセス・セレジシ ４５℃以下工ＹＯＯ３
６ また、第３図・−・はアースロバフタ−・ニス・ピー・
ＢＯ７２０菌株よりのアシル ＣｏＡ・オキシダーゼの熱安定性、第３図○−Ｃはマク
ロフオミナ・ファセオリＡＴＣＣ １４、３８３菌株よりのアシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ
の熱安定性を示す。
６） ｋｍ値
生産菌 ｋｍ値
・アースロハクター・ニス・ ０．１３ｍＭピー・ＢＯ
７２０ ・マクロフオミナ・ファセオ ０．０８７ｍＭすＡＴＣ
Ｃ１４３８３ ・クラドスポリウム・レジナ ０．１２ ｍＭ工ＩＦ
Ｏ６３６７ ・アスペルギルス・キャンプ ０．１１ ｍＭイダス
Ｍ−４８１５ 生 産 菌 ｋｍ値 ０モナスカス・ニス・ピー・ −４８００ ０，１５ Ｍ ・サツカロマイセス・セレビ シェＹＯＯ３６ ０，５０ 扉Ｍ （７） 等電点 生 産 菌 等電点 ・アースロハクター・ニス・ピー・ ４．７００７２０ ０マクロフオミナ・ファセオリ ５．１９ＡＴＣＣ
１４３８３ 以上の通り、本発明の酵素アシル−ＣＯＡ・オキシダー
ゼは、バルミトイル−ＣｏＡなとの長鎖のアシル−Ｃｏ
Ａに作用するに際して、１分子の酸素を消費して、２・
３−デヒドロアシル−ＣｏＡおよび過酸化水素を生成す
る反応を触媒する酵素であって、本酵素はアシル−Ｃｏ
Ａを生成する系例えば脂肪酸、ＣｏＡおよび脂肪酸活性
化酵素からなる反応系のアシル−ＣｏＡを生成する系、
またこの脂肪酸を生成する系であるトリグリセライドを
リパーゼまたはリポプロティンリパーゼからなる系との
組合せの系、において脂肪酸、ＣｏＡ、トリグリセライ
ドの定量、脂肪酸活性化酵素、リパーゼ、リポプロティ
ンリパーゼの活性測定などに有用な酵素である。
７２０ ・マクロフオミナ・ファセオ ０．０８７ｍＭすＡＴＣ
Ｃ１４３８３ ・クラドスポリウム・レジナ ０．１２ ｍＭ工ＩＦ
Ｏ６３６７ ・アスペルギルス・キャンプ ０．１１ ｍＭイダス
Ｍ−４８１５ 生 産 菌 ｋｍ値 ０モナスカス・ニス・ピー・ −４８００ ０，１５ Ｍ ・サツカロマイセス・セレビ シェＹＯＯ３６ ０，５０ 扉Ｍ （７） 等電点 生 産 菌 等電点 ・アースロハクター・ニス・ピー・ ４．７００７２０ ０マクロフオミナ・ファセオリ ５．１９ＡＴＣＣ
１４３８３ 以上の通り、本発明の酵素アシル−ＣＯＡ・オキシダー
ゼは、バルミトイル−ＣｏＡなとの長鎖のアシル−Ｃｏ
Ａに作用するに際して、１分子の酸素を消費して、２・
３−デヒドロアシル−ＣｏＡおよび過酸化水素を生成す
る反応を触媒する酵素であって、本酵素はアシル−Ｃｏ
Ａを生成する系例えば脂肪酸、ＣｏＡおよび脂肪酸活性
化酵素からなる反応系のアシル−ＣｏＡを生成する系、
またこの脂肪酸を生成する系であるトリグリセライドを
リパーゼまたはリポプロティンリパーゼからなる系との
組合せの系、において脂肪酸、ＣｏＡ、トリグリセライ
ドの定量、脂肪酸活性化酵素、リパーゼ、リポプロティ
ンリパーゼの活性測定などに有用な酵素である。
次に本発明の実施例を挙げて具体的に説明するが、本発
明はこれによって限定されるものではない。
明はこれによって限定されるものではない。
実施例 １
オレイン酸１％、酵母エキス０．２５％、ペプトン１％
、ＫＣｌ ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ
４・７．Ｈ２Ｏ０，０５％、消泡剤（ディスフオームＢ
、Ｃ−５１Ｙ ） ０．２％よりなる組成の培地１０ｍ
１を滅菌試験管に入れ、これにアースロバフタ−・ニス
・ピー・Ｂ−０７２０菌株を接種し、３０℃にて一晩振
盪培養して種菌を得た。
、ＫＣｌ ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ
４・７．Ｈ２Ｏ０，０５％、消泡剤（ディスフオームＢ
、Ｃ−５１Ｙ ） ０．２％よりなる組成の培地１０ｍ
１を滅菌試験管に入れ、これにアースロバフタ−・ニス
・ピー・Ｂ−０７２０菌株を接種し、３０℃にて一晩振
盪培養して種菌を得た。
次いでこれを、上記と同一組成の培地５１を有する８１
ｄジャーファーメンタ−に移植し、３０℃、２０時間、
６００ｒｐｍ、５Ｊ／分の条件下通気攪拌端艇した。
ｄジャーファーメンタ−に移植し、３０℃、２０時間、
６００ｒｐｍ、５Ｊ／分の条件下通気攪拌端艇した。
培養終了後、培養物を遠心分離してその翁体な得、これ
を、１１の１０ｍＭリン酸緩衝液（、ｐＨ７，０）、２
ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍ９／ｍｌリゾチームに懸濁し、
３７℃にて６０分間攪拌し、処理後デオキシリボヌクレ
アーゼ５■を添加してさらにｉｏ分間攪拌した後、１１
００００ｒｐにて２０分間遠心した。
を、１１の１０ｍＭリン酸緩衝液（、ｐＨ７，０）、２
ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍ９／ｍｌリゾチームに懸濁し、
３７℃にて６０分間攪拌し、処理後デオキシリボヌクレ
アーゼ５■を添加してさらにｉｏ分間攪拌した後、１１
００００ｒｐにて２０分間遠心した。
得られた上清液に、２００ｍ１のアセトンを加えて遠心
した後、さらに上清に、１．８１のアセトンを加えた。
した後、さらに上清に、１．８１のアセトンを加えた。
次いでこれを遠心してその沈澱物を得、これを２００ｍ
１の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、不
溶物を遠心除去し、さらに、飽和硫安を用いて３０〜７
５％の硫安分画を行ない、得られた沈澱物を４０ｍ１の
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、これを
アクリルマイトゲル（バイオゲルＰ−２；バイオラド社
製）のカラムにチャージして脱塩した。
１の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、不
溶物を遠心除去し、さらに、飽和硫安を用いて３０〜７
５％の硫安分画を行ない、得られた沈澱物を４０ｍ１の
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、これを
アクリルマイトゲル（バイオゲルＰ−２；バイオラド社
製）のカラムにチャージして脱塩した。
次いでこれを、リン酸カルシウムゲルのカラムにチャー
ジして吸着せしめ、洗浄後０．０５〜０．５Ｍのリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）の濃度勾配をつけたグラディエン
ド法で溶出し、その活性画分（０，４５Ｍ付近）を回収
した。
ジして吸着せしめ、洗浄後０．０５〜０．５Ｍのリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）の濃度勾配をつけたグラディエン
ド法で溶出し、その活性画分（０，４５Ｍ付近）を回収
した。
さらに、この両分を限外？過膜（ダイアフローメンブレ
ンＰＭ１０；アミコン社製）を用いて脱塩濃縮し、次い
で凍結乾燥して、アシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ（比活
性５．５Ｕ／■、全活性８５０Ｕ、収率８．５％）を得
た。
ンＰＭ１０；アミコン社製）を用いて脱塩濃縮し、次い
で凍結乾燥して、アシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ（比活
性５．５Ｕ／■、全活性８５０Ｕ、収率８．５％）を得
た。
実施例 ２
オレイン酸１％、酵母エキス０．２５％、脱脂大豆粉（
プロトンラワー）１％、ＫＣｌ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４
０，１％、ＣａＣＯ３ｏ、５％、ディスホームＢＣ−５
１Ｙ０．２％よりなる組成の滅菌後の培地１０ｍ１を有
する試験管に、マクロフオミナ・ファセオリＡＴＣＣ１
４３８３菌株を接種し、２６℃にて４日間振盪培養して
種菌を得、これを上記と同一組成の培地５１を有する８
１容ジャーファーメンタ−に移植し、２６℃、４５時間
、７００ｒｐｍ、５Ｊ／分の条件下で通気攪拌培養した
。
プロトンラワー）１％、ＫＣｌ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４
０，１％、ＣａＣＯ３ｏ、５％、ディスホームＢＣ−５
１Ｙ０．２％よりなる組成の滅菌後の培地１０ｍ１を有
する試験管に、マクロフオミナ・ファセオリＡＴＣＣ１
４３８３菌株を接種し、２６℃にて４日間振盪培養して
種菌を得、これを上記と同一組成の培地５１を有する８
１容ジャーファーメンタ−に移植し、２６℃、４５時間
、７００ｒｐｍ、５Ｊ／分の条件下で通気攪拌培養した
。
培養終了後、これを濾過し、得られた菌体を、１．５１
の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、これ
を１５分間ホモジエナイザーにて均一な懸濁液を得た。
の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、これ
を１５分間ホモジエナイザーにて均一な懸濁液を得た。
次いでこれを遠心分離して得られた上清液を、減圧濃縮
して１０分の１の容量となし、不溶物を遠心除去した。
して１０分の１の容量となし、不溶物を遠心除去した。
さらにこれに、飽和硫安を用いて、３０〜８０％の硫安
分画を行ない、得られた沈澱物を７５ｍ１の１０ｍＭ！
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、再度３０〜８０
％の硫安分画を行ない、得られた沈澱物を４０ｒｒｌｌ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、不溶物を遠心
除去した。
分画を行ない、得られた沈澱物を７５ｍ１の１０ｍＭ！
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、再度３０〜８０
％の硫安分画を行ない、得られた沈澱物を４０ｒｒｌｌ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、不溶物を遠心
除去した。
次いでこれを七フアクリルＳ−３００（商品名：ファル
マシア社製）のカラムにチャージして活性画分を得、さ
らにこれを限外を過膜（ダイア７０−メンブレンＸＭ−
５０：アミコン社製）を用いて濃縮後凍結乾燥してアシ
ル−ＣｏＡ・オキシダーゼ（比活性１．２Ｕ／ｍ９、全
活性１１０Ｕ、収率１１．０％）を得た。
マシア社製）のカラムにチャージして活性画分を得、さ
らにこれを限外を過膜（ダイア７０−メンブレンＸＭ−
５０：アミコン社製）を用いて濃縮後凍結乾燥してアシ
ル−ＣｏＡ・オキシダーゼ（比活性１．２Ｕ／ｍ９、全
活性１１０Ｕ、収率１１．０％）を得た。
実施例 ３〜５
実施例２のマクロフオミナ・ファセオリ
ＡＴＣＣ１４３８３菌株の代りに、アスペルギルス・キ
ャンデダスＭ−４８１５菌株、クラドスポリウムーレジ
ナエＩＦＯ６３６７菌株、モナスカス・ニス・ピー・Ｍ
−４８００菌株の各菌株を用い、また実施例２と同一組
成の培地１００Ｔｎｌを有する５００ｍ１容三角フラス
コを用いて、これを各菌株を接種し、２６℃にて４日間
振盪培養した。
ャンデダスＭ−４８１５菌株、クラドスポリウムーレジ
ナエＩＦＯ６３６７菌株、モナスカス・ニス・ピー・Ｍ
−４８００菌株の各菌株を用い、また実施例２と同一組
成の培地１００Ｔｎｌを有する５００ｍ１容三角フラス
コを用いて、これを各菌株を接種し、２６℃にて４日間
振盪培養した。
次いで培養後菌体を１取し、これを、５分の１容量の１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、１０分間
超音波処理した後遠心分離して、その上溝液を得た。
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、１０分間
超音波処理した後遠心分離して、その上溝液を得た。
このようにして得られた各上清液のアシル−ＣｏＡ・オ
キシダーゼの含有量は次の通りであった。
キシダーゼの含有量は次の通りであった。
生 産 菌 含有量（Ｕ／ｍＪ）
アスペルギルス・キャンテ０．０４８
イダスＭ−４８１５
クラドスポリウム・レジ ０．０３５ナエＩＦＯ６
３６７ モナスカス・ニス・ビー・ ０．０６５−４８００ さらに、以下実施例１と同様にして、精製、単離すれば
よい。
３６７ モナスカス・ニス・ビー・ ０．０６５−４８００ さらに、以下実施例１と同様にして、精製、単離すれば
よい。
実施例 ６
オレイン酸１％、酵母エキス０．２５％、ペプトン０．
５％、ＫＣＩ Ｏ，２％、ＫＩ（２Ｐ０４０１％、Ｍ
ｇＳＯ４・ ７Ｈ２００，０５％よりなる組成（ｐＨ４
２）の滅菌後の培地１００ｍ１を有する５００ｍ１容三
角フラスコに、サツカロマイセス・セレビシェＹＯＯ３
６菌株を接種し、３０℃にて３日間振盪培養した。
５％、ＫＣＩ Ｏ，２％、ＫＩ（２Ｐ０４０１％、Ｍ
ｇＳＯ４・ ７Ｈ２００，０５％よりなる組成（ｐＨ４
２）の滅菌後の培地１００ｍ１を有する５００ｍ１容三
角フラスコに、サツカロマイセス・セレビシェＹＯＯ３
６菌株を接種し、３０℃にて３日間振盪培養した。
培養終了後、菌体な遠心して回収し、次いで得られた菌
体を、５分の１容量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に懸濁し、１０分間超音波処理し、次いで遠心して
その上清液を得た。
体を、５分の１容量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に懸濁し、１０分間超音波処理し、次いで遠心して
その上清液を得た。
このようにして得られた上清液のアシル−ＣｏＡ・オキ
シダーゼの含有量は０．７５Ｕ／ｍ７であった。
シダーゼの含有量は０．７５Ｕ／ｍ７であった。
さらに、以下実施例１と同様にして、精製、単離すれば
よい。
よい。
第１図は至適ｐＨを示し、第２図はｐＨ安定性を示し、
第３図は熱安定性を示し、また各図中の・−・はアース
ロバフタ−・ニス・ピー・Ｂ０７２０菌株より得られた
アシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ、〇−〇はマクロフォミ
ナ・ファセオリＡＴＣＣ１４３８３菌株より得られたア
シルＣｏＡ・オキシダーゼの場合を示す。
第３図は熱安定性を示し、また各図中の・−・はアース
ロバフタ−・ニス・ピー・Ｂ０７２０菌株より得られた
アシル−ＣｏＡ・オキシダーゼ、〇−〇はマクロフォミ
ナ・ファセオリＡＴＣＣ１４３８３菌株より得られたア
シルＣｏＡ・オキシダーゼの場合を示す。
Claims (1)
- １ マクロフオミナ属、クシトスポリウム属、アスペル
ギルス属、モナスカス属、サツカロマイセス属またはア
ースロバフタ−属に属するアシルＣｏＡ ・オキシダ
ーゼ生産菌を培地に培養し、次いで培養物からアシル−
ＣｏＡ・オキシダーゼを採取することを特徴とするアシ
ル−ＣｏＡ・オキシダーゼの製造法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54139166A JPS5840466B2 (ja) | 1979-10-26 | 1979-10-26 | アシル−ＣｏＡ・オキシダ−ゼの製造法 |
| CH790180A CH646994A5 (it) | 1979-10-26 | 1980-10-23 | Procedimento per la produzione di acil-coa ossidasi. |
| DE19803040045 DE3040045A1 (de) | 1979-10-26 | 1980-10-23 | Verfahren zur herstellung von acyl-coa-oxidase |
| IT25518/80A IT1195033B (it) | 1979-10-26 | 1980-10-23 | Procedimento per la produzione di acil-coa ossidasi |
| FR8022809A FR2468647A1 (fr) | 1979-10-26 | 1980-10-24 | Procede de production d'acyl-coa oxydase |
| DK449280A DK449280A (da) | 1979-10-26 | 1980-10-24 | Fremgangsmaade til fremstilling af acyl-coa oxidase |
| CA000363190A CA1156572A (en) | 1979-10-26 | 1980-10-24 | Process for production of acyl-coenzyme a oxidase |
| GB8034392A GB2064544B (en) | 1979-10-26 | 1980-10-24 | Process for production of acyl-coenzyme a oxidase |
| US06/201,123 US4346173A (en) | 1979-10-26 | 1980-10-27 | Process for the production of acyl-Coenzyme A oxidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54139166A JPS5840466B2 (ja) | 1979-10-26 | 1979-10-26 | アシル−ＣｏＡ・オキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5661991A JPS5661991A (en) | 1981-05-27 |
| JPS5840466B2 true JPS5840466B2 (ja) | 1983-09-06 |
Family
ID=15239112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP54139166A Expired JPS5840466B2 (ja) | 1979-10-26 | 1979-10-26 | アシル−ＣｏＡ・オキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4346173A (ja) |
| JP (1) | JPS5840466B2 (ja) |
| CA (1) | CA1156572A (ja) |
| CH (1) | CH646994A5 (ja) |
| DE (1) | DE3040045A1 (ja) |
| DK (1) | DK449280A (ja) |
| FR (1) | FR2468647A1 (ja) |
| GB (1) | GB2064544B (ja) |
| IT (1) | IT1195033B (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1229780A (en) * | 1983-07-14 | 1987-12-01 | Alexander P. Murray | Iron removal from edta solutions |
| CA2082324A1 (en) * | 1991-11-08 | 1993-05-09 | Gabriele Wagner | Arthrobacter nicotiana strain, activity of the strain, process for the isolation of the strain, sensor with the activity and use of the strain |
| JP4257730B2 (ja) * | 2003-08-25 | 2009-04-22 | キッコーマン株式会社 | アシルＣｏＡオキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びアシルＣｏＡオキシダーゼの製造法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5915625B2 (ja) * | 1979-03-01 | 1984-04-10 | 東洋紡績株式会社 | 新規なアシルコエンザイムａオキシダ−ゼおよびその製法 |
-
1979
- 1979-10-26 JP JP54139166A patent/JPS5840466B2/ja not_active Expired
-
1980
- 1980-10-23 DE DE19803040045 patent/DE3040045A1/de active Granted
- 1980-10-23 CH CH790180A patent/CH646994A5/it not_active IP Right Cessation
- 1980-10-23 IT IT25518/80A patent/IT1195033B/it active
- 1980-10-24 DK DK449280A patent/DK449280A/da not_active Application Discontinuation
- 1980-10-24 CA CA000363190A patent/CA1156572A/en not_active Expired
- 1980-10-24 FR FR8022809A patent/FR2468647A1/fr active Granted
- 1980-10-24 GB GB8034392A patent/GB2064544B/en not_active Expired
- 1980-10-27 US US06/201,123 patent/US4346173A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CH646994A5 (it) | 1984-12-28 |
| IT1195033B (it) | 1988-09-28 |
| JPS5661991A (en) | 1981-05-27 |
| GB2064544A (en) | 1981-06-17 |
| DK449280A (da) | 1981-04-27 |
| DE3040045A1 (de) | 1981-05-21 |
| CA1156572A (en) | 1983-11-08 |
| FR2468647A1 (fr) | 1981-05-08 |
| GB2064544B (en) | 1983-04-13 |
| DE3040045C2 (ja) | 1989-08-31 |
| IT8025518A0 (it) | 1980-10-23 |
| FR2468647B1 (ja) | 1984-01-06 |
| US4346173A (en) | 1982-08-24 |
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