JPH0127714B2 - - Google Patents

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JPH0127714B2
JPH0127714B2 JP56017562A JP1756281A JPH0127714B2 JP H0127714 B2 JPH0127714 B2 JP H0127714B2 JP 56017562 A JP56017562 A JP 56017562A JP 1756281 A JP1756281 A JP 1756281A JP H0127714 B2 JPH0127714 B2 JP H0127714B2
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choline
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JP56017562A
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Akinori Matsuzaki
Hajime Suzuki
Toshio Kamei
Fumiaki Ishida
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MSD KK
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Banyu Phamaceutical Co Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるコリン・オキシダーゼの
製造法に関するものである。 コリン・オキシダーゼはコリンの定量に使用さ
れる酵素であり、コリン・エステラーゼ活性の測
定、またはホスホリパーゼDとの共役によりリン
脂質の定量等の臨床診断への利用が考えられてい
る。 微生物起源のコリン・オキシダーゼはアースロ
バクター属によるもの〔J.Biochem.、82、157
(1977)〕 シリンドロカーポン属によるもの〔Arg.Biol.
Chem.、43、815(1979)〕、ブレビバクテリウム属
またはコリネバクテリウム属によるもの(特開昭
53−66492、52−81689)などが報告されている。
これらは主として菌体内にコリン・オキシダーゼ
を生産するため超音波破砕機を用いるなどして菌
体からの酵素抽出を行なわなければならない。 本発明者らは超音波破砕機等の処理方法を用い
菌体破砕を行う事なくコリン・オキシダーゼを得
るために、主として菌体外にコリン・オキシダー
ゼを生産する微生物を検索した。 その結果ストレプトミセス属の6菌株が主とし
て菌体外にコリン・オキシダーゼを生産すること
を見出し、コリン・オキシダーゼを抽出、精製す
ることに成功し本発明を完成した。 本発明に使用する微生物はストレプトミセス属
に属しコリン・オキシダーゼ生産能を有するもの
であれば、自然界から新たに分離された菌株、既
存の培養菌株およびこれらの菌株を微生物突然変
異誘発法、たとえば紫外線等の照射、ニトロソグ
アニジン等による処理により得られたコリン・オ
キシダーゼ生産株のいずれでも使用することがで
きる。さらに本方法はストレプトミセス属に属す
る微生物のコリン・オキシダーゼ合成に関与する
遺伝子の機能を利用するものであり、この遺伝子
を他の微生物体内に取り入ませる等の方法、たと
えばプロトプラストを用いた細胞融合、プラスミ
ドを用いた形質導入などにより得られたコリン・
オキシダーゼ生産微生物の利用も包含する。 本発明者らが分離したストレプトミセス属のコ
リン・オキシダーゼ生産菌6菌株のうちの1株は
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてお
り、その微工研受託番号は、微工研菌寄第5849号
(FERM−P5849)である。本菌の分類学的性質
は次のとおりである。 (1) 形態:本菌株の基中菌糸は分断せずに伸長し
分枝する。気菌糸はよく伸長し、気菌糸上の胞
子柄は直線あるいはゆるやかな波状を示す。胞
子の形状は惰円形および柱筒形(0.3〜0.5×0.7
〜1.0μm)で、表面は平滑である。胞子柄当り
の胞子数は10〜50個であり、それ以上のものも
みられる。 (2) 各種培地における生育状態 (1) シユークロース硝酸塩寒天培地(27℃培
養):灰色の発育上に褐色をおびた灰色の気
菌糸をうつすらと着生し、溶解性色素はみと
められない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地(27℃
培養):薄クリーム色の発育上にクリーム色
の気菌糸をうつすらと着生し、溶解性色素は
みとめられない。 (3) イースト麦芽寒天培地(ISP培地2、27℃
培養):褐色の発育上に褐色をおびた灰色の
気菌糸を着生し、溶解性色素は褐色である。 (4) オートミール寒天培地(ISP培地3、27℃
培養):薄黄褐色の発育上に褐色をおびた灰
色の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに
黄褐色をおびる程度である。 (5) スターチ無機塩寒天培地(ISP培地4、27
℃培養):薄黄褐色の発育上に灰色の気菌糸
を着生し、溶解性色素はみとめられない。 (6) グリセリン・アスパラギン寒天培地(ISP
培地5、27℃培養):薄褐色の発育上に灰色
の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに黄
色をおびる程度である。 (7) ペプトン・イースト鉄寒天培地(ISP培地
6、27℃培養):発育は薄褐色で気菌糸は着
生せず、溶解性色素はみとめられない。 (8) チロシン寒天培地(ISP培地7、27℃培
養):薄褐色の発育上に灰色の気菌糸を着生
し、溶解性色素は薄黄色である。 (9) 栄養寒天培地(27℃培養):発育は薄クリ
ーム色で気菌糸は着生せず、溶解性色素はみ
とめられない。 (10) ベンネツト寒天培地(27℃培養):褐色の
発育上に灰色の気菌糸を着生し、溶解性色素
は黄色である。 (3) 生理的性質 (1) 生育温度範囲:25℃〜37℃ (2) 生育PH範囲(トリプトン・イースト・ブロ
ス培地ISP培地1、27℃培養):PH6〜9 (3) メラニン様色素の生成(トリプトン・イー
スト・ブロス培地ISP培地1、ペプトン・イ
ースト鉄寒天培地ISP培地6、チロシン寒天
培地ISP培地7、27℃培養):メラニン様色
素の生成はいずれの培地においても陰性であ
つた。 (4) スターチの加水分解(スターチ寒天培地
ISP培地4、27℃培養):陽性 (5) ゼラチンの液化(グルコース・ペプトン・
ゼラチン培地、27℃培養):陰性 (6) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化(脱脂牛乳、
37℃培養):陽性 (7) 硫化水素の生成(硫化水素生成培地、27℃
培養):陰性 (8) 硝酸塩の還元反応(1%硝酸塩含有ペプト
ン水、27℃培養):陽性 (9) 耐塩性(塩化ナトリウム含有イースト麦芽
寒天培地、27℃培養):7g/dlで生育、10
g/dlで非生育。 (10) 炭素源の利用性(プリドハム、ゴトリーブ
寒天培地ISP培地9、27℃培養):L−アラ
ビノース、D−マンニトール、D−フラクト
ース、L−ラムノース、ラフイノースおよび
D−グルコースはよく利用して生育し、D−
キシロースとイノシトールにおける発育は微
弱でシユークロースは利用しない。 以上の性状を要約すると本菌株はストレプトミ
セス(Streptomyces)属に属し、気菌糸の色は
灰色系、胞子柄の形状は直線あるいは波状、胞子
形態は惰円形ないし柱筒形で表面は平滑であり、
メラニン様色素は生産しない。これらの性状と炭
素源の利用性より既知菌種を検索するとISP記載
からストレプトミセス・ニグリフアシエンス
〔Streptomyces nigrifaciens、Int−ernational
Jaurnal of Systematic Bacterio−10gy18150、
(1968)〕が最も近縁の種としてあげられる。ISP
記載およびBergey′s Manu−al of
Determinative Bacteriology 18th edit−ion、
(1974)記載のストレプトミセス・ニグリフアシ
エンスと本菌株の性状を比較すると表1に示すよ
うに両者はかなりよく一致している。 従つて本菌株はストレプトミセス・ニグリフア
シエンスに極めて近縁の種と考えられストレプト
ミセス・ニグリフアシエンス74−SY11と同定し
た。
【表】 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
物その他の栄養素が好適比で存在する培地であれ
ば合成培地または天然培地のいずれでもよい。 コリン・オキシダーゼの生産に適した培地とし
て炭素源はコリン、マンニトール、グルコース、
フルクトースなどが用いられる。窒素源としては
乾燥酵母、大豆抽出物、肉エキス、硝酸アンモニ
ウムなどが用いられる。 無機物としてはリン酸一カリウム、リン酸二カ
リウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウムなどが
用いられる。 また培地中にコリンを加えることによりコリ
ン・オキシダーゼの生産を増加させることができ
る。コリンとしては塩化コリン、硫酸コリンなど
の酸塩や遊離のコリンを使用することができる。 培養法としては液体培養法(振盪培養法もしく
は通気撹拌培養法)がよく、工業的には通気撹拌
培養法がもつとも適している。培養温度は27℃位
が最適である。PHは中性付近であることが望まし
い。培養期間は条件によつて変わつてくるが通常
3〜7日程度である。本酵素は主として菌体外に
蓄積する。 コリン・オキシダーゼの分離精製は次のように
行なう。培養終了後培養物中から菌体を過また
は遠心分離により除き培養液を得る。培養液
を通常酵素精製に用いられる方法たとえば塩析、
透析、アフイニテイ−クロマト、イオン交換クロ
マト、ゲル過などで処理する方法により精製酵
素を得ることができる。 菌体よりコリン・オキシダーゼを得るためには
過または遠心分離により集めた菌体を適当な手
段で破砕し、破砕液を遠心分離し無細胞抽出液を
得る。以後の操作は培養液の場合と同様にして
行なうことができる。 本発明により得られたコリン・オキシダーゼの
酵素学的性質は次の通りである。 (1) 作用 本酵素は次式で示されるように、コリンを酸
化しベタインアルデヒドを経てベタインを生成
する。 コリン+O2→ベタインアルデヒド+H2O2 ベタインアルデヒド+O2+H2O
→ベタイン+H2O2 (2) 酵素活性測定法 (1) 塩化コリンを基質とし反応の際生成する過
酸化水素と4−アミノアンチピリン、フエノ
ールをホースラデイツシユ・パーオキシダー
ゼ存在下で反応させ、生じた色素を500nm
で測定し酵素力価を測定する。 すなわち4−アミノアンチピリン0.82m
mole、フエノール14mmole、ホースラデイ
ツシユ・パーオキシダーゼ1900単位を0.1M
リン酸緩衝液(PH6.8)1に溶解する。 この発色液2mlに100mM塩化コリン0.5ml
と本酵素液0.1mlを加え25℃で30分反応を行
ない500nmで測定を行なう。酵素力価は1
分間に1μmoleの過酸化水素を生成する酵素
量を1単位とした。 (2) (1)の方法は迅速、簡便ではあるが、ホース
ラデイシユ・パーオキシダーゼを用いるため
阻害剤の影響等を検討するには不適当であ
る。そこで酵素的性質の検討にはベタインア
ルデヒドの2,4−ジニトロフエニルヒドラ
ゾンの吸収を440nmで測定するM.Jellinekら
の方法〔J.Biol.Chem.、234、1171(1959)〕
に準じて行なつた。 (3) 基質特異性 コリン類似物質に対する作用の比較を表2に
示す。活性はコリンに対する値を100としたと
きの相対活性で示した。
【表】 (4) 至適PH 図1に本酵素のPH活性曲線を示す。 図1から明らかなように至適PHは8〜9にあ
る。 (5) PH安定性 図2に本酵素のPH安定性曲線を示す。 図2から明らかなようにPH6.5〜9.5にかけ本
酵素は安定である。 (6) 温度安定性 図3に本酵素の温度安定性を示す。 図3から明らかなように本酵素は30℃までは
安定である。 (7) 阻害剤の影響 本酵素に対する種々薬剤の影響を表3に示
す。酵素活性は(2)(2)の項で述べた方法で測定し
た。本酵素は水銀イオン、銀イオンでよく阻害
された。またNaN3、PCMBでも阻害された。
【表】
【表】 次に本発明を実施例で具体的に説明する。 実施例 1 500ml容の坂口フラスコに塩化コリン1%、乾
燥酵母1%、K2HPO40.1%、KCl0.05%、
MgSO4・7H2O0.05%を含む培地(PH7.0)100ml
を入れ120℃で20分間加圧滅菌した後、ストレプ
トミセス・ニグリフアシエンス74−SY11を1エ
ーゼ接種し、27℃で5日間振盪培養した。 培養液と菌体に含まれるコリン・オキシダー
ゼの力価はそれぞれ0.87単位/ml、0.005単位/
gであつた。 実施例 2 25容のジヤーフアーメンターに塩化コリン1
%、乾燥酵母1%、K2HPO40.1%、KCl0.05%、
MgSO4・7H2O0.05%を含む培地(PH7.0)12を
仕込み常法により培地を滅菌した。可溶性澱粉1
%、酵母エキス0.2%を含む培地(PH7.0)で振盪
培養したストレプトミセス・ニグリフアシエンス
74−SY11の種培養液500mlを移植し通気量毎分10
、撹拌数250rpm、27℃で4日間通気撹拌培養
して培養液11を得た。 培養液と菌体に含まれるコリン・オキシダー
ゼの力価はそれぞれ1.08単位/ml、0.01単位/g
であつた。 実施例 3 本酵素精製に用いたアフイニテイー担体はI.
Matsumotoらの方法〔J.Biochem.、85、1091
(1979)〕によりコリンを導入したセフアロース
6Bでありその製造法は以下の通りである。 すなわち、よく洗浄後吸引過したセフアロー
ス6B60gに水90ml、2M水酸化ナトリウム39ml、
エピクロルヒドリン9mlを順次加え40℃で2時間
振盪しエポキシ基を導入した。 エピクロルヒドリンで活性化したセフアロース
6B1gに対し、0.025モルの塩化コリンを含む
0.1M水酸化ナトリウム4mlを加え40℃で24時間
振盪しセフアロース6Bにコリンを固定化させた。
調製したコリン−セフアロース6Bのカラムへの
詰め方、コリン・オキシダーゼの吸着方法は通常
の方法を用い、溶出は塩濃度を上昇させることに
より可能であつた。 実施例 4 実施例2と同様の操作で得られた培養液10
に4.5Kgの硫酸アンモニウムを加え一夜放置した
後遠心分離により沈澱を得た。沈澱を0.01Mトリ
ス塩酸緩衝液(PH8.0)80mlに溶解し同緩衝液に
対し透析を行なつた。実施例3の方法で調製した
コリン−セフアロース6Bのカラム(5×30cm)
に酵素を吸着させ0.01Mトリス塩酸緩衝液(PH
8.0)でカラムを洗浄した後塩化ナトリウム0〜
0.5Mを含む同緩衝液により濃度勾配溶出を行な
つた。活性分画を集め0.1Mトリス塩酸緩衝液
(PH8.0)に対し透析を行ない同緩衝液で平衡した
DEAE−セルロースカラム(5×30cm)に酵素を
吸着させた。 0.1Mトリス塩酸緩衝液(PH8.0)でカラムを洗
浄した後塩化ナトリウム0〜1Mを含む同緩衝液
により濃度勾配溶出を行なつた。活性分画を集め
蒸留水に対し透析を行なつた後凍結乾燥し乾燥粉
末1.27gを得た。
【図面の簡単な説明】
1図はコリン・オキシダーゼの至適PH曲線、2
図は同酵素のPH安定曲線を示す。3図は温度安定
曲線である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 ストレプトミセス属に属しコリン・オキシダ
    ーゼ生産能を有する微生物を培養し、得られた培
    養物からコリン・オキシダーゼを採取することを
    特徴とするコリン・オキシダーゼの製造法。
JP56017562A 1981-02-10 1981-02-10 Preparation of choline oxidase by fermentation method Granted JPS57132880A (en)

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EP0356232A3 (en) * 1988-08-26 1991-03-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel choline oxidase and method for producing the same
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