JPH0127714B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるコリン・オキシダーゼの
製造法に関するものである。 コリン・オキシダーゼはコリンの定量に使用さ
れる酵素であり、コリン・エステラーゼ活性の測
定、またはホスホリパーゼＤとの共役によりリン
脂質の定量等の臨床診断への利用が考えられてい
る。 微生物起源のコリン・オキシダーゼはアースロ
バクター属によるもの〔J.Biochem.、82、157
（1977）〕 シリンドロカーポン属によるもの〔Arg.Biol.
Chem.、43、815（1979）〕、ブレビバクテリウム属
またはコリネバクテリウム属によるもの（特開昭
53−66492、52−81689）などが報告されている。
これらは主として菌体内にコリン・オキシダーゼ
を生産するため超音波破砕機を用いるなどして菌
体からの酵素抽出を行なわなければならない。 本発明者らは超音波破砕機等の処理方法を用い
菌体破砕を行う事なくコリン・オキシダーゼを得
るために、主として菌体外にコリン・オキシダー
ゼを生産する微生物を検索した。 その結果ストレプトミセス属の６菌株が主とし
て菌体外にコリン・オキシダーゼを生産すること
を見出し、コリン・オキシダーゼを抽出、精製す
ることに成功し本発明を完成した。 本発明に使用する微生物はストレプトミセス属
に属しコリン・オキシダーゼ生産能を有するもの
であれば、自然界から新たに分離された菌株、既
存の培養菌株およびこれらの菌株を微生物突然変
異誘発法、たとえば紫外線等の照射、ニトロソグ
アニジン等による処理により得られたコリン・オ
キシダーゼ生産株のいずれでも使用することがで
きる。さらに本方法はストレプトミセス属に属す
る微生物のコリン・オキシダーゼ合成に関与する
遺伝子の機能を利用するものであり、この遺伝子
を他の微生物体内に取り入ませる等の方法、たと
えばプロトプラストを用いた細胞融合、プラスミ
ドを用いた形質導入などにより得られたコリン・
オキシダーゼ生産微生物の利用も包含する。 本発明者らが分離したストレプトミセス属のコ
リン・オキシダーゼ生産菌６菌株のうちの１株は
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてお
り、その微工研受託番号は、微工研菌寄第5849号
（FERM−P5849）である。本菌の分類学的性質
は次のとおりである。 (1) 形態：本菌株の基中菌糸は分断せずに伸長し
分枝する。気菌糸はよく伸長し、気菌糸上の胞
子柄は直線あるいはゆるやかな波状を示す。胞
子の形状は惰円形および柱筒形（0.3〜0.5×0.7
〜1.0μｍ）で、表面は平滑である。胞子柄当り
の胞子数は10〜50個であり、それ以上のものも
みられる。 (2) 各種培地における生育状態 (1) シユークロース硝酸塩寒天培地（27℃培
養）：灰色の発育上に褐色をおびた灰色の気
菌糸をうつすらと着生し、溶解性色素はみと
められない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地（27℃
培養）：薄クリーム色の発育上にクリーム色
の気菌糸をうつすらと着生し、溶解性色素は
みとめられない。 (3) イースト麦芽寒天培地（ISP培地２、27℃
培養）：褐色の発育上に褐色をおびた灰色の
気菌糸を着生し、溶解性色素は褐色である。 (4) オートミール寒天培地（ISP培地３、27℃
培養）：薄黄褐色の発育上に褐色をおびた灰
色の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに
黄褐色をおびる程度である。 (5) スターチ無機塩寒天培地（ISP培地４、27
℃培養）：薄黄褐色の発育上に灰色の気菌糸
を着生し、溶解性色素はみとめられない。 (6) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP
培地５、27℃培養）：薄褐色の発育上に灰色
の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに黄
色をおびる程度である。 (7) ペプトン・イースト鉄寒天培地（ISP培地
６、27℃培養）：発育は薄褐色で気菌糸は着
生せず、溶解性色素はみとめられない。 (8) チロシン寒天培地（ISP培地７、27℃培
養）：薄褐色の発育上に灰色の気菌糸を着生
し、溶解性色素は薄黄色である。 (9) 栄養寒天培地（27℃培養）：発育は薄クリ
ーム色で気菌糸は着生せず、溶解性色素はみ
とめられない。 (10) ベンネツト寒天培地（27℃培養）：褐色の
発育上に灰色の気菌糸を着生し、溶解性色素
は黄色である。 (3) 生理的性質 (1) 生育温度範囲：25℃〜37℃ (2) 生育PH範囲（トリプトン・イースト・ブロ
ス培地ISP培地１、27℃培養）：PH６〜９ (3) メラニン様色素の生成（トリプトン・イー
スト・ブロス培地ISP培地１、ペプトン・イ
ースト鉄寒天培地ISP培地６、チロシン寒天
培地ISP培地７、27℃培養）：メラニン様色
素の生成はいずれの培地においても陰性であ
つた。 (4) スターチの加水分解（スターチ寒天培地
ISP培地４、27℃培養）：陽性 (5) ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・
ゼラチン培地、27℃培養）：陰性 (6) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化（脱脂牛乳、
37℃培養）：陽性 (7) 硫化水素の生成（硫化水素生成培地、27℃
培養）：陰性 (8) 硝酸塩の還元反応（１％硝酸塩含有ペプト
ン水、27℃培養）：陽性 (9) 耐塩性（塩化ナトリウム含有イースト麦芽
寒天培地、27℃培養）：７ｇ／dlで生育、10
ｇ／dlで非生育。 (10) 炭素源の利用性（プリドハム、ゴトリーブ
寒天培地ISP培地９、27℃培養）：Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクト
ース、Ｌ−ラムノース、ラフイノースおよび
Ｄ−グルコースはよく利用して生育し、Ｄ−
キシロースとイノシトールにおける発育は微
弱でシユークロースは利用しない。 以上の性状を要約すると本菌株はストレプトミ
セス（Streptomyces）属に属し、気菌糸の色は
灰色系、胞子柄の形状は直線あるいは波状、胞子
形態は惰円形ないし柱筒形で表面は平滑であり、
メラニン様色素は生産しない。これらの性状と炭
素源の利用性より既知菌種を検索するとISP記載
からストレプトミセス・ニグリフアシエンス
〔Streptomyces nigrifaciens、Int−ernational
Jaurnal of Systematic Bacterio−10gy18150、
（1968）〕が最も近縁の種としてあげられる。ISP
記載およびBergey′s Manu−al of
Determinative Bacteriology 18th edit−ion、
（1974）記載のストレプトミセス・ニグリフアシ
エンスと本菌株の性状を比較すると表１に示すよ
うに両者はかなりよく一致している。 従つて本菌株はストレプトミセス・ニグリフア
シエンスに極めて近縁の種と考えられストレプト
ミセス・ニグリフアシエンス74−SY11と同定し
た。

【表】 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
物その他の栄養素が好適比で存在する培地であれ
ば合成培地または天然培地のいずれでもよい。 コリン・オキシダーゼの生産に適した培地とし
て炭素源はコリン、マンニトール、グルコース、
フルクトースなどが用いられる。窒素源としては
乾燥酵母、大豆抽出物、肉エキス、硝酸アンモニ
ウムなどが用いられる。 無機物としてはリン酸一カリウム、リン酸二カ
リウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウムなどが
用いられる。 また培地中にコリンを加えることによりコリ
ン・オキシダーゼの生産を増加させることができ
る。コリンとしては塩化コリン、硫酸コリンなど
の酸塩や遊離のコリンを使用することができる。 培養法としては液体培養法（振盪培養法もしく
は通気撹拌培養法）がよく、工業的には通気撹拌
培養法がもつとも適している。培養温度は27℃位
が最適である。PHは中性付近であることが望まし
い。培養期間は条件によつて変わつてくるが通常
３〜７日程度である。本酵素は主として菌体外に
蓄積する。 コリン・オキシダーゼの分離精製は次のように
行なう。培養終了後培養物中から菌体を過また
は遠心分離により除き培養液を得る。培養液
を通常酵素精製に用いられる方法たとえば塩析、
透析、アフイニテイ−クロマト、イオン交換クロ
マト、ゲル過などで処理する方法により精製酵
素を得ることができる。 菌体よりコリン・オキシダーゼを得るためには
過または遠心分離により集めた菌体を適当な手
段で破砕し、破砕液を遠心分離し無細胞抽出液を
得る。以後の操作は培養液の場合と同様にして
行なうことができる。 本発明により得られたコリン・オキシダーゼの
酵素学的性質は次の通りである。 (1) 作用 本酵素は次式で示されるように、コリンを酸
化しベタインアルデヒドを経てベタインを生成
する。 コリン＋O₂→ベタインアルデヒド＋H₂O₂ ベタインアルデヒド＋O₂＋H₂O
→ベタイン＋H₂O₂ (2) 酵素活性測定法 (1) 塩化コリンを基質とし反応の際生成する過
酸化水素と４−アミノアンチピリン、フエノ
ールをホースラデイツシユ・パーオキシダー
ゼ存在下で反応させ、生じた色素を500nｍ
で測定し酵素力価を測定する。 すなわち４−アミノアンチピリン0.82ｍ
mole、フエノール14ｍmole、ホースラデイ
ツシユ・パーオキシダーゼ1900単位を0.1M
リン酸緩衝液（PH6.8）１に溶解する。 この発色液２mlに100ｍＭ塩化コリン0.5ml
と本酵素液0.1mlを加え25℃で30分反応を行
ない500nｍで測定を行なう。酵素力価は１
分間に1μmoleの過酸化水素を生成する酵素
量を１単位とした。 (2) (1)の方法は迅速、簡便ではあるが、ホース
ラデイシユ・パーオキシダーゼを用いるため
阻害剤の影響等を検討するには不適当であ
る。そこで酵素的性質の検討にはベタインア
ルデヒドの２，４−ジニトロフエニルヒドラ
ゾンの吸収を440nｍで測定するM.Jellinekら
の方法〔J.Biol.Chem.、234、1171（1959）〕
に準じて行なつた。 (3) 基質特異性 コリン類似物質に対する作用の比較を表２に
示す。活性はコリンに対する値を100としたと
きの相対活性で示した。

【表】 (4) 至適PH 図１に本酵素のPH活性曲線を示す。 図１から明らかなように至適PHは８〜９にあ
る。 (5) PH安定性 図２に本酵素のPH安定性曲線を示す。 図２から明らかなようにPH6.5〜9.5にかけ本
酵素は安定である。 (6) 温度安定性 図３に本酵素の温度安定性を示す。 図３から明らかなように本酵素は30℃までは
安定である。 (7) 阻害剤の影響 本酵素に対する種々薬剤の影響を表３に示
す。酵素活性は(2)(2)の項で述べた方法で測定し
た。本酵素は水銀イオン、銀イオンでよく阻害
された。またNaN₃、PCMBでも阻害された。

【表】

【表】 次に本発明を実施例で具体的に説明する。 実施例 １ 500ml容の坂口フラスコに塩化コリン１％、乾
燥酵母１％、K₂HPO₄0.1％、KCl0.05％、
MgSO₄・7H₂O0.05％を含む培地（PH7.0）100ml
を入れ120℃で20分間加圧滅菌した後、ストレプ
トミセス・ニグリフアシエンス74−SY11を１エ
ーゼ接種し、27℃で５日間振盪培養した。 培養液と菌体に含まれるコリン・オキシダー
ゼの力価はそれぞれ0.87単位／ml、0.005単位／
ｇであつた。 実施例 ２ 25容のジヤーフアーメンターに塩化コリン１
％、乾燥酵母１％、K₂HPO₄0.1％、KCl0.05％、
MgSO₄・7H₂O0.05％を含む培地（PH7.0）12を
仕込み常法により培地を滅菌した。可溶性澱粉１
％、酵母エキス0.2％を含む培地（PH7.0）で振盪
培養したストレプトミセス・ニグリフアシエンス
74−SY11の種培養液500mlを移植し通気量毎分10
、撹拌数250rpm、27℃で４日間通気撹拌培養
して培養液11を得た。 培養液と菌体に含まれるコリン・オキシダー
ゼの力価はそれぞれ1.08単位／ml、0.01単位／ｇ
であつた。 実施例 ３ 本酵素精製に用いたアフイニテイー担体はI.
Matsumotoらの方法〔J.Biochem.、85、1091
（1979）〕によりコリンを導入したセフアロース
6Bでありその製造法は以下の通りである。 すなわち、よく洗浄後吸引過したセフアロー
ス6B60ｇに水90ml、2M水酸化ナトリウム39ml、
エピクロルヒドリン９mlを順次加え40℃で２時間
振盪しエポキシ基を導入した。 エピクロルヒドリンで活性化したセフアロース
6B1ｇに対し、0.025モルの塩化コリンを含む
0.1M水酸化ナトリウム４mlを加え40℃で24時間
振盪しセフアロース6Bにコリンを固定化させた。
調製したコリン−セフアロース6Bのカラムへの
詰め方、コリン・オキシダーゼの吸着方法は通常
の方法を用い、溶出は塩濃度を上昇させることに
より可能であつた。 実施例 ４ 実施例２と同様の操作で得られた培養液10
に4.5Kgの硫酸アンモニウムを加え一夜放置した
後遠心分離により沈澱を得た。沈澱を0.01Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH8.0）80mlに溶解し同緩衝液に
対し透析を行なつた。実施例３の方法で調製した
コリン−セフアロース6Bのカラム（５×30cm）
に酵素を吸着させ0.01Mトリス塩酸緩衝液（PH
8.0）でカラムを洗浄した後塩化ナトリウム０〜
0.5Mを含む同緩衝液により濃度勾配溶出を行な
つた。活性分画を集め0.1Mトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）に対し透析を行ない同緩衝液で平衡した
DEAE−セルロースカラム（５×30cm）に酵素を
吸着させた。 0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）でカラムを洗
浄した後塩化ナトリウム０〜1Mを含む同緩衝液
により濃度勾配溶出を行なつた。活性分画を集め
蒸留水に対し透析を行なつた後凍結乾燥し乾燥粉
末1.27ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

１図はコリン・オキシダーゼの至適PH曲線、２
図は同酵素のPH安定曲線を示す。３図は温度安定
曲線である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトミセス属に属しコリン・オキシダ
   ーゼ生産能を有する微生物を培養し、得られた培
   養物からコリン・オキシダーゼを採取することを
   特徴とするコリン・オキシダーゼの製造法。