JPS5926267B2 - Ｌ−グルタミン酸オキシダ−ゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ、および発酵法
によるその製造法に関するものである。

本発明者らは医学的な診断法として非常に重要なグルタ
メイト・オキサロアセテイト・トランスアミナーゼ、グ
ルタメイト・ピルベイト・トランスアミナーゼの迅速か
つ正確な活性測定法を検討し、その生成物であるＬ−グ
ルタミン酸に注目した。

すなわち、このＬ−グルタミン酸にＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼを作用させて過酸化水素を生成せしめ、過酸
化水素と呈色試薬とをパーオキシダーゼの存在下反応さ
せて生じる色素の量を測定することにより、グルタメイ
ト・オキサロアセテイト・トランスアミナーゼ、グルタ
メイト・ヒ８ルベイト・トランスアミナーゼの活性を測
定することが可能と考えた。

しかし、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼについては微生物、
蛇毒、ラット腎臓等にその存在が知られているが（Ｊ、
Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、１９２ 、７５５ 、１９５１ 、Ａｒｃ
、ｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、２９ 、１９０ 、１９５０−Ｊ
、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２４１．２０７５．１９６６）Ｌ−グルタ
ミン酸にきわめて基質特異性の高いＬ−アミノ酸オキシ
ダーゼは全く知られていない。

そこで、本発明者らは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ
を得るため、その生産菌を検索した結果、ストレプトミ
セス属の一菌株が著量のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
を生産することを見出し、Ｌ−グルタミン酸オキシダー
ゼを抽出、精製することに成功し１本発明を完成した。

本発明に使用する微生物はＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼ生産能を有するものであれば、自然界から新たに分離
された菌株、既存の培養菌株およびこれらの菌株を微生
物突然変異誘発法たとえば紫外線等の照射、ニトロソグ
アニジン等による処理により得られたＬ−グルタミン酸
オキシダーゼ生産株のいずれでも使用することができる
。

さらに本方法は、ストレプトミセス属に属する微生物の
し一グルタミン酸オキシダーゼ合成に関与する遺伝子の
機能を利用するものでありこの遺伝子を他の微生物体内
に取り込ませる等の方法、たとえばプロトプラストを使
った細胞融合などにより得られたし一グルタミン酸オキ
シダーゼ生産微生物の利用も包含する。

本発明者らが分離したストレプトミセス・バイオレツセ
ンスＨ８２Ｎ−８Ｙ７は特にＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ生産性が高く工業技術院微生物工業技術研究所に昭
和５５年８月９日保管委託申請し、微生物受託番号微工
研菌寄第５６７２号である。

本菌の分類学的性質は次のとおりである。（ｉ） 形
態：本菌株の基中菌糸は単純分枝で螺旋状の気菌糸を形
成した。

成熟した胞子鎖は１０〜５０個胞子が連鎖し、稀にそれ
以上のものが認められた。

胞子の大きさは０．４〜０．５ Ｘｏ、７〜０．８ μ
ｍで胞子表面はとげ状（５ｐｉｎｙ）である。

（２）各種培地における生育状態； ■）シュークロース硝酸塩寒天培地（２７℃培養）：薄
い紫の発育上に薄い紫の気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。

２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培地）
：灰白色の発育上に灰白色の気菌糸を着生し、溶解性色
素は認められない。

３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地５
．２７℃培養）：白褐色の発育上に白色の気菌糸を着生
し、溶解性色素は認められない。

４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ培地４．２７°
Ｃ培養）：紫がかった白色の発育上に明るい紫色の気菌
糸を着生し、溶解性色素は認められない。

５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地７．２７°Ｃ培養）
：白色の発育上に薄紫色の気菌糸を着生し、溶解性色素
は認められない。

６）栄養寒天培地（２７℃培養）：薄褐色の発育上に灰
色の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに茶色味をお
びる程度である。

７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ培地２．２７℃培
養）：白褐色の発育上に白色の気菌糸を着生し、溶解性
色素は褐色である。

８）オートミール・寒天培地（ＩＳＰ培地３．２７°Ｃ
培養）：白褐色の発育上に白色をおびた紫色の気菌糸を
着生し、溶解性色素は、わずかに茶色味をおびる程度で
ある。

９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）：薄褐
色発育上に白色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認めら
れない。

（３）生理的性質 １）生育温度範囲：２５°Ｃ〜４５℃であって最適温度
は３０℃付近と思われる。

２）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチン
培地２７℃培養）：陽性 ３）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化（脱脂牛乳３７℃培養
）：陰性 ４）スターチの加水分解（スターチ寒天培地２７℃培養
）：陽性ではあるが、その作用は弱い方である。

５）メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地ＩＳＰ培
地７、ペプトン・イースト・鉄寒天培地ＩＳＰ培地６、
トリプトン・イースト・ブロスＩＳＰ培地１．２７°Ｃ
培養）：チロシン寒天培地で陰性、ペプトン・イースト
・鉄寒天培地およびトリプトン・イースト・ブロス培地
では陽性であった。

６）炭素源の利用性（プリドハム、ゴトリーブ寒天培地
、ＩＳＰ培地９．２７°Ｃ培養）＝Ｄ−グルコース、Ｄ
−マンニトール、ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キ
シロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラクトース、ラフ
ィノース、セロビオースおよびマルトースはよく利用し
て生育し、ラムノース、Ｄ−ソルビトール、■−イノシ
トール、シュクロース、およびメソ−エリスリットにお
ける発育は微弱で、Ｌ−ソルボースは利用しない。

７）硝酸塩の還元反応（１％硝酸カリ含有ペプトン水、
ＩＳＰ培地８．２７℃培養）：陽性以上の性状を要約す
ると本菌株はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）属に属し、気菌糸は螺旋状、胞子の表面はとげ状
である。

培地上で発育は白〜白褐色、または灰白色か薄い紫、気
菌糸は白〜灰色または薄い紫で溶解性の色素はほとんど
生産しないが、生産する場合は褐色である。

メラニン様色素は陽性と判定され、スターチ氷解性は弱
い刀である。

これらの性状より既知菌種を検索すると ＩＳＰ記載からストレプトミセス・バイオレツセンス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｓｃｅｎｓｌＪ
、 Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ １８９ ＊１３８．１９６８）が最も近縁の種とし
てあげられる。

表１に示すように両者はかなりよく一致している。

従って本菌株はストレプトミセス・バイオレツセンスに
極めて近縁の種と考えられストレプトミセス・バイオレ
ツセンスＨ８２Ｎ−８Ｙ７と同定した。

本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機物その他
の栄養素が好適比で存在する培地であれば合成培地また
は天然培地のいずれでもよい。

Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの生産に適した培地とし
て炭素源は、可溶性澱粉、マンニトール。

マルトース、サッカロースなどが用いられる。

窒素源としては肉エキス、ペプトン、酵母エキス。

エビオスなどが用いられる。

無機物としてはリン酸−カリウム、リン酸二カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化カリウムなどが用いられる。

培養法としては液体培養法（振盪培養法もしくは通気攪
拌培養法）がよく工業的には通気攪拌培養法がもつとも
適している。

培養温度は２５〜３７℃であればよいが、２７°Ｃ位が
好適である。

ｐＨは中性付近にあることが望ましい。

培養期間は条件によって変わってくるが通常３〜５日程
度である。

本酵素は主として菌体外に生成蓄積する。

Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの分離精製は次のように
行なう。

培養終了後、培養物中から菌体を涙過または遠心分離に
より除き培養ｒ液を得る。

培養Ｐ液を通常酵素精製に用いられる方法たとえば塩析
、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換セルロースクロマト
、アフィニティークロマト、ゲル瀝過などの方法にて処
理することにより精製酵素を得ることができる。

菌体よりＬ−グルタミン酸オキシダーゼを得るためには
菌体を適当な手段で破砕し、破砕液から遠心分離によっ
てよ清液を得る。

以後の操作は培養Ｐ液の場合と同様にして行なう。

本発明により得られたＬ−グルタミン酸オキシダーゼの
酵素学的性質は次の通りである。

（１）作用 （２）酵素活性測定法 １） Ｌ−グルタミン酸を基質とし、反応の際α−ケ
トルグルタル酸と同時に生成する過酸化水素と４−アミ
ノアンチピリン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリンをホースラ
ディツシュ・パーオキシダーゼ存在下で反応させ生じた
色素を５５０ ｔｌｒｎで測定し、酵素力価を測定する
。

すなわち４−アミノアンチピリン１．５７′ｎｊｉ１．
Ｎ。

Ｎ−ジメチルアニリン３６μｌ、ホースラディツシュ・
パーオキシダーゼ３００Ｕ（バーブロガリン単位）を０
．１ Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，５） １００ｍｌに
溶解する。

この発色液２ｍｌに３５ｍＭＬ−グルタミン酸０．５
ｍｌと本酵素液０．０５ Ｔｌｌを加え、３７℃で３０
分反応を行ない５５０ｎｍで測定を行なう。

酵素力価は１分間に１μｍｏｌｅの過酸化水素を生成す
る酵素量を１単位とした。

２）ｌ）の方法は迅速、簡便ではあるが、ホースラディ
ツシュ・パーオキシダーゼを用いるため阻害剤の影響等
を検討するには不適当である。

そこで、それらの検討にはＬ−グルタミン酸からα−ケ
トグルタル酸と同時に生成するアンモニアを測定する永
津らの方法（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、６０，２１９．１９６６）を用い酵素
力価を求めた。

（３）基質特異性 種々のアミノ酸に対する活性を表２に示す。

Ｌ−グルタミン酸に対する活性を１００とした場合の各
種アミノ酸に対する相対活性で示した。

表２から明らかなように本酵素はＬ−グルタミン酸に対
し高い基質特異性を示す。

（４）至適ｐＨ 図１に本酵素のｐＨ活性曲線を示す。

図１から明らかなように至適ｐＨは５〜６にある。

（５）ｐＨ安定性 図２に本酵素のｐＨ安定曲線を示す。

図２から明らかなようにｐＨ３，５〜６．５にかけ本酵
素は安定である。

（６）温度安定性 図３に本酵素の温度安定性を示す。

図３から明らかなように本酵素は５０°Ｃまでは安定で
ある。

（７）阻害剤の影響 本酵素に対する種々薬剤の影響を表３に示す。

各薬剤と本酵素を３７℃で１０分間前保占した１後（２
）・２）の項で述べた方法で活性を測定した。

本酵素は水銀イオン、銅イオンでよく阻害された。

またジエチルジチオカルバメイト、ＰＣＭＢでも阻害さ
れた。

（８）分子量は５００００〜７００００である。

実施例 １ ５００ｍｌの三角フラスコに可溶性澱粉１．５％、ポリ
ペプトン１％、Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、ＫＣｌ０１０５
％１Ｍｇ５０４ ・７Ｈ２００，０５％を含む培地（ｐ
Ｈ７，０）１００ｍｄを入れ１２０°Ｃで２０分間加圧
滅菌した後、ストレプトミセス・バイオレツセンスＨ８
２Ｎ−３Ｙ７をｌ工−ゼ接種し、２７℃で４日間培養し
た。

培養Ｐ液と菌体に含まれるし一グルタミン酸オキシダー
ゼの力価は、それぞれ０，３７単ｖｍ１１０．０１学位
／ｇであった。

本発明により得られたＬ−グルタミン酸オキシダーゼは
Ｌ−グルタミン酸の定量に用いられる。

以下Ｌ−グルタミン酸の定量について説明する。

Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ゛を用いたＬ−グルタミ
ン酸の定量には以下の方法がある。

（１）酸素の存在下、Ｌ−グルタミン酸にＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼを作用させ、生成した過酸化水素を定
量する方法。

（２）同じく生成するアンモニアを定量する方法（３）
同じくカタラーゼの存在下で生成するα−ケトクルター
ル酸に２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを作用させ
て２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンを生成させ、こ
の２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンを比色法により
定量する方法。

＜１）の項に示した生成する過酸化水素を測定する事に
よりＬ−グルタミン酸を定量する方法について述べる。

４−アミンアンチピリン５０■、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニ
リン１５０μｌ、パーオキシダーゼ１、ＯＱ Ｏ単位、
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１２５単位をｌｌの０．
０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解する。

この発色液２ｍｌに０．０５−フィクロモル／ｒＩＬｌ
〜０．６マイクロモル／ｍｌのＬ−グルタミン酸溶液０
．５ ｍｌを加えて３７°Ｃで３０分間反応を行い５５
０ ｎｍで測定を行なう。

図４に示じたようにＬ−グルタミン酸濃度と５５０ ｎ
ｍでのＯＤ値の間には直線関係が得られる。

この方法により溶液中の未知のし一グルタミン酸が定量
できる。

（２）の項に示した生成するアンモニアを測定する事に
よりＬ−グルタミン酸を定量する方法について述べる。

Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ１２ ｓ ＪＱｉ位／
ｌ！を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）に
０．０５マイクロモル／ｌ７１１〜１．０マイクロモル
フｍｌのＬ−グルタミン酸溶液０．５ ｒｕｌを加え３
７°Ｃで３０分間反応を行い、生じたアンモニアをミラ
ー等の方法（Ａｍｅｒ 、Ｊ、ＣＩ ｉｎ、Ｐａｔｈｏ
ｌ 、 、３９ 、９７１９６３）または永津等の方法
（Ｊ−Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

６０．２１９．１９６６）により測定する。

図５に示したようにＬ−グルタミン酸濃度と６３０１１
ｍでのＯＤ値の間には直線関係が得られる。

この方法により溶液中の未知のＬ−グルタミン酸が定量
できる。

これらの事はＬ−グルタミン酸の定量が必要な分野にお
いて新しい定量手法、定量用キットの作製を可能にさせ
る。

本発明により提供されるＬ −グルタミン酸オキシダー
ゼを用いる事によりＬ−グルタミン酸を酸化し、生じた
過酸化水素またはアンモニアを定量する事により生体成
分中のＬ−グルタミン酸の定量が可能になる。

また、（Ｘ）Ｔ 、 ＧＰ Ｔ 、γ−ＧＴＰ等の酵素
反応の結果中じたＬ−グルタミン酸を定量する事により
これらの酵素活性を特異的に測定する事が可能になる。

実施例 ２ ２５１容のジャーファーメンタ−に可溶性澱粉１．５％
、ポリペブト７１％、 Ｋ２ＨＰＯ４０，１％。

ＫＣｌ ０．０５％、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，０５
％を含む培地（ｐＨ７，０）１Ｍを仕込み常法により培
地を滅菌した。

マルトース１％、酵母エキス０．４％を含む培地（ｐＨ
７，０）で２７℃、４日間培養したストレプトミセス・
バイオレツセンスＨ８２−８Ｙ７の種培養液５００ｍ１
を移植し、通気量毎分１０１１攪拌数２５ Ｏｒｐｍ、
２７℃で３日間通気攪拌培養して、培養炉液１１．５１
を得た。

培養涙液と菌体に含まれるＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼの力価は、それぞれ１．２単位／ｍｌ、０．０２単位
／ｇであった。

実施例 ３ 実施例２と同様の操作で得られた培養涙液１０１に３．
０４ｋｇの硫安を加え一夜放置した後、遠心分離により
沈殿を得た。

沈殿を０．０１ＭＩＪン酸緩衝液（Ｉ）Ｈ６，０）、
１０ ｏｍｌに溶解し、同緩衝液２１に対し透析を行な
った。

Ｌ−８ｕｎｄｂｅｒｙ、Ｊ、Ｐｏｒａｔｈの方法（Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、９０，８７，１９７４）によ
り、１．４ブタンジオールジグリシジルエーテルを用い
Ｌ−グルタミンを導入したセファロース６Ｂのカラム（
５Ｘ３０ＣＩｒＬ）に酵素を吸着させ０．０１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）でカラムを洗浄した後。

０〜０．１ ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液によりグラデ
ィエンド溶出を行なった。

活性分画を集め、蒸留水に対し透析を行なった後、凍結
乾燥し、乾燥粉末０．８６ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

１図は、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの至適ｐＨ曲線
、２図は同じ＜ｐＨ安定曲線を示す。 ３図は温度安定曲線である。 図４はＬ−グルタミン酸の濃度を変えてＬ−グルタミン
酸オキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を発色さ
せた場合のＬ−グルタミン酸濃度と吸光度の関係を示す
直線である。 図５はＬ−グルタミン酸の濃度を変えてＬ−グルタミン
酸オキシダーゼを作成させ、生じたアンモニアを発色さ
せた場合のＬ−グルタミン酸濃度と吸光度の関係を示す
直線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 以下の理化学的諸性質を有することを特徴とするし
   一グルタミン酸オキシターゼ （ａ）作用 酸素と水の存在下でＬ−グルタミン酸を特異的に脱アミ
   ン化して、α−ケトグルタル酸、アンモニアおよび過酸
   化水素を生成する。 （ｂ） 基質特異性 Ｌ−クルクミン酸に特異的に作用する。 （Ｃ） 至適ｐＨ：５〜６ （ｄ） 安定ｐｌＴ：３．５ ： ６．５（ｅ）
   作用適温：３７°Ｃ （ｒ） Ｌ−グルタミン酸に対するミカエリス定数（
   Ｋｍ値）：１−ＩＸＩＯ−３Ｍ（ｐＨ５，０）（ｇ）
   分子量： ５００００〜７００００２ ストレプトミ
   セス属に属し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ生産能を
   有する微生物を培養し、得られた培養物からＬ−グルタ
   ミン酸オキシダーゼを採取することを特徴とするＬ−グ
   ルタミン酸オキシダーゼの製造法。