JPS59159777A - ピルビン酸オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はピルビン酸オキシダーゼの製造法に関する。さ
らに詳しくは、本発明はロイコノストック属に属し、ピ
ルビン酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を培地に培
養し、該培養物からピルビン酸オキシダーゼを採取する
ことを特徴とするピルビン酸オキシダーゼの製造法に関
する。

ピルビン酸オキシダーゼはピルビン酸、リン酸および酸
素からアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を
生ずる反応を触媒する酵素であり、血清、尿中のピルビ
ン酸の定量、グルタミン酸−ビルピン酸トランスアミナ
ーゼ、グルタミン酸−オギザロ酢酸トランスアミナーゼ
、２クテートデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ等の酵素活性測定用に用いら
、わ、る。

ピルビン酸オキシダーゼはラクトバチルス・デルプリッ
チイの菌体に存在することが知られている（酵素ハンド
ブック、丸尾文治、田宮信雄監修、発行所：朝倉書局。

又、ペディオコッカス属、ストレプトコツカス属および
アエロコツカス属の微生物がピルビン酸オキシダーゼを
生産することが知られている（特開昭５４−１２６７９
１号公報）発酵法によるピルビン酸オキシダーゼの製造
法について種々検討した結果、ロイコノストック属に属
Ｌ７、ピルビン酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を
培地に培養することにより培養物中にピルビン酸オキシ
ダーゼが生成することが見い出された。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明に使用される微生物はロイコノストック属にＭＬ
、ピルビン酸オキシダーゼ生産能を有する微生物であれ
ばいずれの微生物でもよい。

好適な菌株の例としてはロイコノストック・メロイコノ
ストック・メセンテロイデスの菌与的性質はバーディー
ズ・マニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ、・Ｍａ、ｎｕａｌ
）第８版、第５１１頁に記載されている。

本発明に使用される栄養培地は炭素源、窒素源、無機物
その個使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有す
るものであれば合成培地、天然培地のいずれも使用可能
である。

炭素源としては、グルコース、シェフロース、デキスト
リン、でんぷん、グリセリン、糖黴などの炭水化物など
が用いられる。

窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、グルタミン
酸などのアミノ酸など無機あるいは有機の窒素化合物、
ペグトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーン
・スチーブ・リカ〜などの窒素含有天然物が使用できる
。

無機物としては、リン酸−カリウム、す／酸二カリウム
、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化第２鉄などが
使用できる。

培養は通常振盪培養あるいは通気攪拌培養で行なう。

培養温度は２０−４０℃、培養ｐ）Ｉば４−７、培養時
間は２０−７０時間である。

上記の方法で培養することにより、培養物中にピルビン
酸オキシダーゼが生成蓄積する。

培養物中からのピルビン酸オキシダーゼの採取は例えば
次のように行々う。

培養終了後、発酵液より遠心分離など、により菌体を分
離する。該菌体を適当な手段で破砕し、破砕液から遠心
分離などによって上清を得る。

上清液からのピルビン酸オキシダーゼの精製単離は通常
酵素精製に用いられる方法、たとえば、塩析、有機溶媒
沈殿、透析、等電点沈殿、吸着体などを用いるカラムク
ロマトグラフィー等の方法で行なう。

ピルビン酸オキシダーゼの力価測定法は次の通りである
。

０．００８％　Ｎ−ｘｆｔレーＮ−メチルフェニル−Ｎ
’−アセチノンジアミン２．５ｄ ０１３Ｍ硫酸マグネシウム　　　　　　　０・】祷０．
０１Ｍチア　ミ７ピｏ７＊ス７工　）　　　　　　　Ｏ
，”　ｔｔＬｌＯ，０１Ｍ４−アミノアンチピリン　　
　　　　　０・１ゴ２５０　Ｕ／ｍｅ　ヘル；にキ７Ｆ
−セ０．１　ｍ１３１．５Ｍピルビン酸ソーダ　　　　
　Ｑ、１プ溶解液は０．０５　Ｍリン酸−緩衝液（ｐＨ
７，０）を使用する。これらを混合し、３０℃５分間放
置後、測定すべき酵素液０．１　ｄを添加し、３０℃５
分後の吸光度ＯＤ　５５０　ｎｍ　（Ｅｔ　）を測定す
る。

又ピルビン酸ソーダのかわりに蒸留水０．１　ｍｌ添加
し、同様の操作にて吸光度ＯＤ　５５０　ｎｍ（Ｅ２　
）を測定し、下記の式により、酵素量を求める。

ピルビン酸オキシダーゼカ価の表示は、１分間に１マイ
クロモルの過酸化水素を生じる活性を１単位（Ｕ）とす
る。

＝＝＝Ｈ＋↑発明″実施例を示す・ １次種培地として、グルコース１チ、ペプトン１チ、酵
母エキス０．５％、　Ｋ２ＨＰＯ４０，１％。

Ｍｇ５Ｏ４Ｈ７Ｈ２００，０５％＋　ＭｎＣｌ２−ｎＨ
２００，００１％。

ＣａＣＯ３２％、ｐＨ７，０からなる培地３０ｄを２５
０ｄ容三角フラスコに分注し、１２０℃１５分殺菌する
。（以下培地はすべて該条件で次種培地と同じ組成の培
地３００ｍ１を２１！容三角フラスコに分注し、１次種
培養液３０−を移し、２８℃２４時間振とり培養する。

かくして得られた２次種培養液１１を３０１容ジャーフ
ァーメンタ−中１５ｉ！の発酵培地（グルコース３チ、
コーン、スチープ・リカー３％、酵母エキスｌチ、　Ｋ
２ＨＰＯ４（１，１％、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０
５％。

ＣａＣＯ３１％、　ｐＨ７，０）に移し、１５０　ｒ、
ｐ、ｍ　。

通気量１０　ｌ　／　ｒｏｉｎ　＋　３０℃で４８時間
培養する。

かくして得られた培養液のピルビン酸オキシダーゼカ価
はφ２　、　、ｍＵ／７であった。培養液１６１を遠心
分離し菌体を集め、０．００２　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液に
懸濁して１１とし、マントンガラリン菌体破砕機で菌体
を破砕する。菌体破砕液を遠心分離して粗酵素液を得る
。との粗酵素液をアンさせ、１Ｍ硫安を含む０．ＯＩＭ
（１）Ｈ６）リン酸緩衝液で溶出する。溶出液に硫安を
５０％飽和添加し、得られた沈殿物を遠心分離し、０．
０１Ｍ（ｐＨ６）ＩＪン酸緩衝液で溶解後、同緩衝液に
対し１夜透析を行う。透析液をＤＥＡＥ−＋ルロース力
うムｌＯｍＡに通塔し吸着させ、０．２Ｍリン酸緩衝液
で溶出する。溶出液を限外沢過機にて濃縮し凍結乾燥し
て、ピルビン酸オキシダーゼ約ここで得られた酵素の性
質は以下のとおりである。

１）作用 ピルビン酸、無機リン酸及び酸素からアセチルリン酸、
二酸化炭素及び過酸化水素を生じる反応を触媒する。

ＣＨ３ＣＯＣ０ＯＨ＋Ｈ２Ｏ１２＋　０２　→Ｃ）（ａ
ｃＯＯＰＯａ−＋　ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ１２）至適ｐＨ 第１図に示すととく至適ｐＨは６．３〜６．８である。

３　）　ｐＨ安定性 ３０℃６０分の処理で第２図に示すごとく、ｐＨ５〜７
で安定である。

４）至適温度 第３図に示すごとく至適温度は４０〜５５℃である。

５）温度安定性 ｐＨ７１５分処理で第４図に示すごとく、３５℃まで安
定である。

６）ＫｒｒＩ値 ピルビン酸に対するＫｍ値は２Ｘ１０−３Ｍである。

７）等電点 ｐｉ（４，３ ８）分子量 約２７０，０００　（セファデックスＧ−２００ゲル口
過法）°）金属塩０影響　　　　　　　。

金属塩（１０−５Ｍ）　　　　相対活性（チ）ＦｅＣ１
２１０４ ＭｎＣ１２５９ ＺｎｃＪ２　　　　　　　　　７０ Ｍｇｅ’２９８ ＣａＣ１２１０１ ＣｏＣ１２６３ Ｘ無添加の場合：１００％ １０）基質特異性 基質（シ）　　　相対活性（イ） Ｐｙｒｕｖａｔｅ　　　　　　　　１００　％α−Ｋｅ
ｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ　　　　　　　　ＯＱｒ　Ｋ　
ｅｔｏ　ｂｕｔｙｒａｔｅ　　　　　　　　ＯＧ　１ｙ
ｏｘｙｌａｔｅ　　　　　　　　　　０

【図面の簡単な説明】

第１図はピルビン酸オキシダーゼの相対活性と至適ｐＨ
との関係、第２図は相対活性とｐＨ安定性との関係をそ
れぞれ示す。 １）　Ｈ４〜５．５　　二　５０ｍＭ　　クエン酸ノ（
ツファ−ｐＨ６−８：　　５０ｍＭ　　　リン酸）（ツ
ファー第３図はピノぼン酸オキシダーゼの相対活性と至
適温度との関係、第４図は相対活性と温度安定性との関
係をそれぞれ示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ロイコノストック属に属し、ピルビン酸オキシダーゼ生
   産能を有する微生物を培地に培養し、該培養物からピル
   ビン酸オキシダーゼを採取することを特徴とするピルビ
   ン酸オキシダーゼの製造法。