SU785318A1 - Способ получени препарата бактериальной люциферазы - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БАКТЕРИАЛЬНОЙ

1

Изобретение относитс  к медицинской , микробиологической и ферментной промьниленности и может быть прИ менено в биохимии, медицине, микробиологии и аналитической химии дл  5 определени  содержани  флавинов, пиридиннуклеотидов , никотинамидаданиндинуклеотид (НАД)-зависимых редуктаз, альдегидов и кислорода.

Известен способ прлучени  препара- 10 Та бактериальной люциферазы, включающий выращивание культуры Photobacterium fischerl на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, кислорода и мине- 5 ральные соли, в аэробных услови х в течение 24 ч с последующим отделением кле.ток, разрушением их, отделением клеточных оболочек, фракционированным осаждением белков высалива- 20 нием сульфатом аммони  при насыщении 30-75%, отделением осадка фермента, растворением его в буфере и очисткой его путем колонной хроматографии в присутствии буфера на сефгщексе G-75 25 и диэтиламиноэтилцеллюлозе (ДЭАЭ-32) и диэтиламиноэтилсефадексе (А 50)|ХТ

Недостатками этого способа  вл ютс  относительно низка  удельна  активность получаемого препарата лю- 30 ЛЮЦИФЕРАЗЫ

циферазы при реакции с восстановленными формами флавинмононуклеотида и никотинамиддинуЧлеотида удельна  активностьсоставл ет: FHNHit, 90 10- квант с мг , NADH 0,3- квант с . мг .

Цель изобретени  - увеличение удельной активности препарата люциферазы .

Цель достигаетс  тем, что в способе получени  препарата бактериальной люциферазы выращивание культуры провод т в течение 9-11 ч, разрушание клеток осуществл ют обработкой их детергентом в количестве 0,5-1,0% от веса биомассы и действием ультразвука , осаждение люциферазы сульфатом аммони  осуществл ют при насыщении 78-80%, провод т диализ на сефадексё растворенного в буфере осадка фермента, а в качестве анионообА4енника при хроматографии используют триэтиламиноэтилцеллюлозу, полученный элюат пропускают через колонку с сефадексом и лиофилизуют.

Предлагаетс  способ получени  пре парата бактериальной люциферазы, зактпочающийс  в выращивании культуры .Photobacter I urn ftscheri на жидкой питательной среде, содержащей истрчНИКИуглерода , азота, кислорода и минеральные соли, в аэробных услови  х JB течение 9-11 ч, отделении клеток , разрушении их обработкой детер ентом в количестве 0,5-1,0 от веса биомассы и действием ультразвука, о делении клеточных оболочек, фракцио нированнрм оса.ждении белков сульфат аммонТи , причем осаждение люцифераз провод т при насыщении (NH),S04 78-80%, полученный осадок фермента раствор ют в буфере и подвергают ди ализу и хроматографии на сефадексе и триэтиламиноэтилцёллюлозе в присутствии буфера, а полученный после хроматографии элюат пропускают чере колонку с сефадексом G 25 и лиофилизуют .. При выращивании культуры обычно используют среду следующего состава вес.%: . - 0,7-1,0, КНэРОх 0 ,1-0,2; (NH4),ЙP04. 0,05-0,07; MgSO 0,01-0,02; пептон 1,0-1,5; NaCl 28-33, остальное дистиллированна  вода. . В качестве детерге.нта обычно используют Тг i ton . Диализ растворенного осадка люциферазы , полученного при высаливании , обьпно провод т на сефадексё . Хроматографическую очистку на сефадексе обычно провод т с использованием сефадекса . При осуществлении хроматографии на тризтиламиноэтилцёллюлозе обычно используют K/Na-фосфатный буфер , рН 7,0, причем элюцию провод т град ентом в интервале концентраций ОЬ ,5М в указанном буфере. Полученный препарат обладает удельной активностью 1700 10 квант c;t мг-f (FMNHjc) и 57 10 квант с- мг. (NADH) и степенью ОЧИСТ КИ срответственно 525 и 1250 раз. Полученный по предлагаемому способу препарат позвол ет измерить .значительно меньшие количества пири диннукдеотидов, флавинмононуклеотида и НАД-зависимьвс редуктаз, например лактатдегидрогеназы, по сравнению с препаратами,которые получены извеЬтным. способом (см. таблицу). -1г -16 10 10 Прототип Предлага- 1 емый 10 10 Пример 1, Культуру Photobacterium fischeri, растущую на тве дои. среде следующего состава, вес.% морска  вода 38, пептон 1, МПВ б, ijrap-arap 2, дистиллированна  вода остальное, высевают в жидкуюсреду состава , вес.%: 0,7; 0,1; (NH4)2.HP04 - 0,05; MgSO 0,01; пептон 1; NaCl 28, дистиллированна  вода остальное, через 11 ч 200 мл культуры стерильно перенос т в ферментер емкостью 10 л с той же самой средой и осуществл ют ферментацию в течение 9 ч при контроле и поддержа НИИ посто нными рН среды (7,0) и уровн  растворенного кислорода (10% от насыщени ) при 17°С. Ио окончании ферментации клетки отдел ют от культуральной жидкости центрифугированием при 25000дхЗО мий, и разрушают лизисом в К/Nа-фосфатном буфере 0,02 М, рН 7,0, с дитиотриетолом (ДТЕ) с помощью Triton Х-100 в качестве детергента в количестве 0,5% от веса, клеток в течение 40 мин при 17 С с последующей обработкой ультра-, звуком 22 кГц X 3 мин (.1 0,6 А, прибор УДЗ-1). Буфер добавл ют в соотношении 4:1 (объем/вес- клеток). Круп ные частицы клеток удал ют центрифугированием при lOSOOOg X 1 ч, затем провод т дробное осаждение белков сульфатом аммони : перва  часть белков , неактивных, осаждают при насыщении 25%, раствор центрифугируют, при 105ОООд X 1 ч, осаждают активную часть белков при насыщении 80% и центрифугируют в тех же услови х. Вс  люцифераза выса.ливаетс  при насыщении 80%, этот осадок раствор ют в 150 мл K/Na-фосфатного буфера (состав тот же) и нанос т на колонку с сефадексом дл  быстрого диализа, затем активную фракцию нанос т на колонку с сефадексом дл  окончательного диализа и очистки от балласта низко- и высокомолекул рных соединений. Полученный препарат нанос т на триэтиламиноэтилцеллюлозу высокоэффективный анионообменник с. хорошими фильтрационными характеристиками . Вс  активность люциферазы св зываетс  с аонообменНИКОМ, сн тие с Hefo осуществл ют градиентом NaCl в интервале концентраций 0-0,5 М с помощью системы, позвол ющей регули ровать развертывание градиента в зависимости от сигнала детектора УФпоглощени  на выходе колонки, что дает возможность значительно улучшить хроматографическое разделение. Полученный препарат бактериальной люциферазы диализуют на колонке сефадекса G-25 дл  удалени  NaCI и перевода фермента в летучий буфер - триэтиламин - НС1 0,01 М, рН 8,8, а затем лиофилизуют. Окончательный продукт имеет степень очистки в 500 раз по активности с FMNHj, и в 1100 раз по активности с NADH и удельную активнорть 1750 55 10 кйант мг .-Он стабилен при хранении при в течение нескольких мес 

Claims (6)

1. Способ получения препарата бактериальной люциферазы, включающий вы- 55 ращивание культуры Photebacter1um fischeri на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, кислорода и минеральные соли, в аэробных условиях , отделение клеток, их разрушение, отделение клеточных оболочек, Фракционированное осаждение эелков сульфатом аммония, отделение рсадка люциферазы, растворение его В буфере и колонную хроматографию на сефадексе и анионообменниках в присутствии буфера, отличающийс я тем, что, с целью повышения удельной активности препарата, выращивание культуры проводят в течение 9-11 ч, разрушение клеток осуществляют обработкой их детергентом в количестве 0,5-1,0 от веса клеток и действием ультразвука, осаждение 'люциферазы сульфатом аммония осуществляют при насыщении 78-80%, проводят диализ на сефадексе, а в качестве анионообменника при хроматографии используют триэтиламиноэтилцеллюлозу, полученный элюат пропускают через колонку с сефадексом и лиофилизуют.

2. Способ по π. 1, отличающийся тем, что при выращивании культуры используют жидкую питательную среду следующего состава, вес.%: Na₂HP0₄ 0,7-1,0; КН₂РО₄ 0,1-0,2;

(NH₄)₂НРО₄ 0,05-0,07; MgSO₄ 0,01-0,02 пептон 1,0-1,5, NaCl 28-33, остальное дистиллированная вода.

3. Способ поп. 1, отличающийся тем, что в качестве детер- . гента используют Triton Х-100.

4. Способ поп. ^отличающийся тем, что диализ проводят на сефадексе G-75.

5. Способ поп. 1, отличающийся тем, что для хроматографии используют сефадекс G-75.

6. Способ поп. 1, отличающий с я тем, что хроматографию на триэтиламиноэтилцеллюлозе осуществляют в условиях К/Na-фосфатного буфера, pH 7,0, с элюцией градиентом NaCl в интервале концентрацией 0-0,5 М в указанном буфере.