JPS6031474B2 - バイオリアクタ−に使用する酵素の製造法 - Google Patents
バイオリアクタ−に使用する酵素の製造法Info
- Publication number
- JPS6031474B2 JPS6031474B2 JP8194676A JP8194676A JPS6031474B2 JP S6031474 B2 JPS6031474 B2 JP S6031474B2 JP 8194676 A JP8194676 A JP 8194676A JP 8194676 A JP8194676 A JP 8194676A JP S6031474 B2 JPS6031474 B2 JP S6031474B2
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- enzyme
- pyruvate kinase
- enzymes
- bioreactors
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な耐熱性かつ安定なピルピン酸キナーゼ
の製造法に関するものである。
の製造法に関するものである。
近年、生体に於ける化学反応の触媒である酵素の優れた
諸性質 ■特異性の高異性の高いこと■高感度であるこ
と ■反応条件が温和であること等が脚光を浴び化学工
業、食品、医療、その他多くの産業分野への利用が検討
され実施されてきた。
諸性質 ■特異性の高異性の高いこと■高感度であるこ
と ■反応条件が温和であること等が脚光を浴び化学工
業、食品、医療、その他多くの産業分野への利用が検討
され実施されてきた。
．現在では、生物化学工業に於ける
酵素利用の趨勢は、従来の加水分解酵素の利用一辺倒か
ら脱皮し、いかにエネルギーを効率よく再生産し合成反
応への酵素利用の端緒を開くかという点に変りつつある
。
酵素利用の趨勢は、従来の加水分解酵素の利用一辺倒か
ら脱皮し、いかにエネルギーを効率よく再生産し合成反
応への酵素利用の端緒を開くかという点に変りつつある
。
その現われは、物質生産系を司るメインリアクター及び
エネルギー供給系あるし・は補酵素の酸化還元に働くサ
ブリアクタ−を合わせもったバイオリアクター（生体反
応装置）の開発研究に見られる。エネルギー供給の為の
サブリアクターに用いる酵素は、生体におけるエネルギ
ー源であるアデノシンニリン酸（以下ＡＴＰと呼ぶ）を
効率良く再生産することが必要で、ホスホトランスフヱ
ラーゼと総称される酵素の使用が考えれる。
エネルギー供給系あるし・は補酵素の酸化還元に働くサ
ブリアクタ−を合わせもったバイオリアクター（生体反
応装置）の開発研究に見られる。エネルギー供給の為の
サブリアクターに用いる酵素は、生体におけるエネルギ
ー源であるアデノシンニリン酸（以下ＡＴＰと呼ぶ）を
効率良く再生産することが必要で、ホスホトランスフヱ
ラーゼと総称される酵素の使用が考えれる。
数あるホスホトランスフェラーゼのうちでも、平衡反応
が最もＡＴＰ合成側に片寄っているピルビン酸キナーゼ
は、この目的に適しているといえる。
が最もＡＴＰ合成側に片寄っているピルビン酸キナーゼ
は、この目的に適しているといえる。
また、ピルビン酸キナーゼは筋疾患、心筋硬塞の早期発
見に有効な血清中のクレアチンキナ−ゼの測定にも必要
な酵素で今日の臨床検査に於いて最もよく用いられる酵
素の一つである。このように診断に酵素を用いることの
重要性は、近年急速に認識が深まり生体成分の検査を酵
素的に行なう手法の開発と、その応用には自覚しいもの
がある。現在では、一歩進んで高価な酵素の使い捨てを
防ぐ意味からもまた測定の自動化、迅速化の点からも診
断用バイオリアクターの開発が望まれている。このよう
に産業上、多くの用途が期待されるピルビン酸キナーゼ
をバイオリアクタ−に組み込む時、本酵素の欠点である
安定性の改良が課題となる。
見に有効な血清中のクレアチンキナ−ゼの測定にも必要
な酵素で今日の臨床検査に於いて最もよく用いられる酵
素の一つである。このように診断に酵素を用いることの
重要性は、近年急速に認識が深まり生体成分の検査を酵
素的に行なう手法の開発と、その応用には自覚しいもの
がある。現在では、一歩進んで高価な酵素の使い捨てを
防ぐ意味からもまた測定の自動化、迅速化の点からも診
断用バイオリアクターの開発が望まれている。このよう
に産業上、多くの用途が期待されるピルビン酸キナーゼ
をバイオリアクタ−に組み込む時、本酵素の欠点である
安定性の改良が課題となる。
この安定性の獲得は本酵素に限ったことではなく、酵素
を今後バイオリアクターに用いる時、一般に問題となる
点である。本発明者らは、これらの観点から安定なピル
ビン酸キナーゼを得るべく鋭意研究した結果、サーマス
属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）に属する高度好熱性細菌Ｔｈｅｒ
ｍ順ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓがピルビン酸キナーゼを
生産することを見出した。
を今後バイオリアクターに用いる時、一般に問題となる
点である。本発明者らは、これらの観点から安定なピル
ビン酸キナーゼを得るべく鋭意研究した結果、サーマス
属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）に属する高度好熱性細菌Ｔｈｅｒ
ｍ順ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓがピルビン酸キナーゼを
生産することを見出した。
しかも抽出・精製の後本酵素の諸性質を検討したところ
、従来にない極めて安定な酵素であることが判明し、本
発明を完成した。本発明に於いて使用する菌は、Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ属に属するものでピルビン酸キナーゼを生産す
る菌株であれば、いかなる菌株も使用できる。
、従来にない極めて安定な酵素であることが判明し、本
発明を完成した。本発明に於いて使用する菌は、Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ属に属するものでピルビン酸キナーゼを生産す
る菌株であれば、いかなる菌株も使用できる。
例示の菌株としては、Ｔｈｅｒｍ雌 ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ＡＴＯ０２７６３４があげられる（Ｉｎｔｅ
ｒ順ｔｉｏ脇Ｉ ＪｏｍＭ１ ｏｆＳ＄ｔｅｍａｔｉｃ
舷ｃｔｅｎｏｌｏ幻 ２４巻、１０２−１１２頁（１
９７４）参照）。本菌株の培養は液体培養で行ない、培
地には微生物の培養に際して、通常用いられる種々の炭
水化物、天然栄養源、ビタミン、無機塩類は全て用いる
ことができる。
ｉｌｕｓ ＡＴＯ０２７６３４があげられる（Ｉｎｔｅ
ｒ順ｔｉｏ脇Ｉ ＪｏｍＭ１ ｏｆＳ＄ｔｅｍａｔｉｃ
舷ｃｔｅｎｏｌｏ幻 ２４巻、１０２−１１２頁（１
９７４）参照）。本菌株の培養は液体培養で行ない、培
地には微生物の培養に際して、通常用いられる種々の炭
水化物、天然栄養源、ビタミン、無機塩類は全て用いる
ことができる。
特に窒素源としてはべプトン、酵母エキス、コーンステ
イ−プリカ−、カゼインが好適に利用され、これらの栄
養源を炭素源とした培地での培養も可能である。培養温
度は、４５〜８ｙ０好ましくは７０〜８０００が適当で
あり、この温度範囲での培養には、培地の殺菌を必要と
しない。培養に最適な初発ｐＨ城は、６．５〜８．０で
ある。例えば、通気損投下温度７５ｏ０初発ｐＨ７で培
養すると通常２〜１脚寺間で培養は終了する。培養終了
後、培養液よりピルビン酸キナーゼを採取するには、一
般の酵素採取法を用いることができるが、本酵素は菌体
内酵素であるから遠心分離・ろ過により菌体を集め、緩
衝液に懸濁後、（超）音波、高圧ホモジナィザ−、フレ
ンチプレスあるいは機械的庭砕などにより、菌体を破壊
し酵素を繭体外に排出、可溶化させ、この溶液をろ過・
遠心分離等の操作にかけ、菌体の破砕物を除く。
イ−プリカ−、カゼインが好適に利用され、これらの栄
養源を炭素源とした培地での培養も可能である。培養温
度は、４５〜８ｙ０好ましくは７０〜８０００が適当で
あり、この温度範囲での培養には、培地の殺菌を必要と
しない。培養に最適な初発ｐＨ城は、６．５〜８．０で
ある。例えば、通気損投下温度７５ｏ０初発ｐＨ７で培
養すると通常２〜１脚寺間で培養は終了する。培養終了
後、培養液よりピルビン酸キナーゼを採取するには、一
般の酵素採取法を用いることができるが、本酵素は菌体
内酵素であるから遠心分離・ろ過により菌体を集め、緩
衝液に懸濁後、（超）音波、高圧ホモジナィザ−、フレ
ンチプレスあるいは機械的庭砕などにより、菌体を破壊
し酵素を繭体外に排出、可溶化させ、この溶液をろ過・
遠心分離等の操作にかけ、菌体の破砕物を除く。
こうして得られた粗酵素標品を更に精製するには、イオ
ン交換セルロース、イオン交換セファデツクス、ハイド
ロキシアパタイトなどを用いるクロマトグラフィーやセ
フアデツクス、バイオゲルなどを用いるゲルろ過、ある
いは硫安塩析・有機溶媒沈澱など通常の酵素精製技術を
適宜選択し、組合せて実施すれば良い。次に本発明で得
られるピルビン酸キナーゼの諸性質について述べる。
ン交換セルロース、イオン交換セファデツクス、ハイド
ロキシアパタイトなどを用いるクロマトグラフィーやセ
フアデツクス、バイオゲルなどを用いるゲルろ過、ある
いは硫安塩析・有機溶媒沈澱など通常の酵素精製技術を
適宜選択し、組合せて実施すれば良い。次に本発明で得
られるピルビン酸キナーゼの諸性質について述べる。
■ 作用及び基質特異性
アデノシンニリン酸（ＡＤＰ）とホスホェノールピルビ
ン酸（ＰＥＰ）に作用し、ＡＴＰとピルビン酸を生成す
る。
ン酸（ＰＥＰ）に作用し、ＡＴＰとピルビン酸を生成す
る。
■ 至適ｐＨ
３０ｑｏの反応ではｐＨ５．５〜６．０、または７５０
０の反応ではｐＨ５．０〜５．５である。
０の反応ではｐＨ５．０〜５．５である。
■ 安定ｐＨ範囲
９０℃、５分間の加熱処理によっても、ＰＨ５．３〜６
．３の範囲にあっては、９０％以上活性を保持する。
．３の範囲にあっては、９０％以上活性を保持する。
■ 作用適温の範囲
常温より７０〜７５午０まで温度の上昇とともに活性は
増大する。
増大する。
■ 耐熱性
図１に本発明酵素の温度による失活の状態を示す。
図から、明からなように、本酵素は８０００、１時間の
加熱に対しては全く、活性を失わず、９０℃１時間の加
熱に対しても、約４０％の活性を保持する極めて熱安定
な酵素である。
加熱に対しては全く、活性を失わず、９０℃１時間の加
熱に対しても、約４０％の活性を保持する極めて熱安定
な酵素である。
■ 活性化及び阻害
本酵素はアロステリック酵素であり、ｌｍＭのグルコー
ス六リン酸、フレクトース六リン酸、フルクトース１．
６−二リン酸の添加により各々３．８倍、３．７倍、２
．８倍に活性化される。
ス六リン酸、フレクトース六リン酸、フルクトース１．
６−二リン酸の添加により各々３．８倍、３．７倍、２
．８倍に活性化される。
また１のＭのＡＴＰの添加により活性は約２／５に低下
する。尚、この時、基質であるＡＤＰ及びＰＥＰの濃度
は、各々ｌｍＭである。■ 分子量 セフアデックスＧ−２００によるゲルろ過の結果から分
子量は約２０〜２４万と推定される。
する。尚、この時、基質であるＡＤＰ及びＰＥＰの濃度
は、各々ｌｍＭである。■ 分子量 セフアデックスＧ−２００によるゲルろ過の結果から分
子量は約２０〜２４万と推定される。
■ 力価測定法１００ｍＭのィミダゾール−塩酸緩衝液
（冊６．４）中、ホスホェノールピルビン酸（ＰＥＰ）
２ｍＭ、ＡＤＰ４ｍＭ、塩化マグネシウム１０のＭ、ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドン（還元型、ＮＡ
ＤＨ）０．２４ｍＭ、乳酸脱水素酵素１１単位／の‘を
含む反応液を調製する。
（冊６．４）中、ホスホェノールピルビン酸（ＰＥＰ）
２ｍＭ、ＡＤＰ４ｍＭ、塩化マグネシウム１０のＭ、ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドン（還元型、ＮＡ
ＤＨ）０．２４ｍＭ、乳酸脱水素酵素１１単位／の‘を
含む反応液を調製する。
この反応液に適当量のピルビン酸キナーゼを加えると、
ＰＥＰ、ＡＤＰは各々ピルビン酸、ＡＴＰとなる。生成
したピルビン酸は、さらに乳酸脱水素酵素の作用により
乳酸に還元される。この反応に共没して起るＮＡＤＨの
酸化に伴なう３４帥肌の吸光度の減少から力価を測定す
る。１分間に１マイクロモルのピルビン酸の生成に相当
する吸光度を減少せしめる酵素活性をもって１単位とす
る。
ＰＥＰ、ＡＤＰは各々ピルビン酸、ＡＴＰとなる。生成
したピルビン酸は、さらに乳酸脱水素酵素の作用により
乳酸に還元される。この反応に共没して起るＮＡＤＨの
酸化に伴なう３４帥肌の吸光度の減少から力価を測定す
る。１分間に１マイクロモルのピルビン酸の生成に相当
する吸光度を減少せしめる酵素活性をもって１単位とす
る。
次に本発明の実施例を示す。実施例 １
べプトン０．８％、酵母エキス０．４％、塩化ナトリウ
ム０．４％からなるｐＨ７に調整した培地１００の‘を
含む５００の上客坂口 フ ラ ス コ にＴｈｅｒｍ
ｕｓ比ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＡＴＣＣ２７６３４を接種
し、７５ｑＣにおいて１朝時間娠糧培養する。
ム０．４％からなるｐＨ７に調整した培地１００の‘を
含む５００の上客坂口 フ ラ ス コ にＴｈｅｒｍ
ｕｓ比ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＡＴＣＣ２７６３４を接種
し、７５ｑＣにおいて１朝時間娠糧培養する。
次にこうして得られた坂口フラスコ１０本分の培養液を
上記組成からなる１５０そ水道水（ｐＨ７に調整）を入
れた２００そ客酉登蓮鞍槽に移し通気量５０〜１００そ
／分、回転数２００〜４００／分、温度７５ｏｏで培養
した。約１岬寺間で菌の増殖は定常期に達し、この時点
で培養を終了し集菌した。この時菌体は１５タノそ（湿
量）得られた。菌体は−２０００で凍結して保存すれば
約２年間は安定である。菌体約ｌｋ９を２倍量の仇Ｍト
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、高圧ホモジ
ナィザーにより細胞を破壊後遠心分離により細胞破砕物
を除去し、ピルビン酸キナーゼの粗抽出液を得た。この
粗抽出液には、４９５山単位のピルビン酸キナーゼがあ
った。この液に硫安塩析を行ない３０〜５０％飽和区分
での沈澱を集め、５ｍＭトリス塩酸緩衝液（冊７．５）
に対して透析後、あらかじめ同緩衝液で平衡化してある
ＤＥＡＥ−セルロースに吸着後、同緩衝液を用い、０か
ら０．８Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配にてピルビン
酸キナーゼを港出させた。
上記組成からなる１５０そ水道水（ｐＨ７に調整）を入
れた２００そ客酉登蓮鞍槽に移し通気量５０〜１００そ
／分、回転数２００〜４００／分、温度７５ｏｏで培養
した。約１岬寺間で菌の増殖は定常期に達し、この時点
で培養を終了し集菌した。この時菌体は１５タノそ（湿
量）得られた。菌体は−２０００で凍結して保存すれば
約２年間は安定である。菌体約ｌｋ９を２倍量の仇Ｍト
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、高圧ホモジ
ナィザーにより細胞を破壊後遠心分離により細胞破砕物
を除去し、ピルビン酸キナーゼの粗抽出液を得た。この
粗抽出液には、４９５山単位のピルビン酸キナーゼがあ
った。この液に硫安塩析を行ない３０〜５０％飽和区分
での沈澱を集め、５ｍＭトリス塩酸緩衝液（冊７．５）
に対して透析後、あらかじめ同緩衝液で平衡化してある
ＤＥＡＥ−セルロースに吸着後、同緩衝液を用い、０か
ら０．８Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配にてピルビン
酸キナーゼを港出させた。
次に５のＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したハ
イドロアパタィトカラムに溶出画分を吸着後５ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）から３００のＭリン酸緩衝液の
直線勾配にて本酵素を溶出させた。更に５ｍＭトリス−
塩酸緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＤＥＡＥ−セフアデ
ックスＡ−５０に溶出画分をかけ、０から０．９ Ｍの
塩化カリウムの直線濃度勾配により、ピルビン酸キナ「
４・ゼを溶出させた。この活性画分を集めると、ピルビ
ン酸キナーゼの収量は、１２．５柵で、比活性は酵素１
の９当り約４山単位であった。粗酵素液よりの回収率は
１０％であった。
イドロアパタィトカラムに溶出画分を吸着後５ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）から３００のＭリン酸緩衝液の
直線勾配にて本酵素を溶出させた。更に５ｍＭトリス−
塩酸緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＤＥＡＥ−セフアデ
ックスＡ−５０に溶出画分をかけ、０から０．９ Ｍの
塩化カリウムの直線濃度勾配により、ピルビン酸キナ「
４・ゼを溶出させた。この活性画分を集めると、ピルビ
ン酸キナーゼの収量は、１２．５柵で、比活性は酵素１
の９当り約４山単位であった。粗酵素液よりの回収率は
１０％であった。
図１は本発明の方法により製造されるピルビン酸キナー
ゼの温度による失活の状態を示すものである。 図１ ぅも渡けさ氏充め＊樋
ゼの温度による失活の状態を示すものである。 図１ ぅも渡けさ氏充め＊樋
Claims (1)
- １ サーマス属に属するピルビン酸キナーゼ生産菌を培
養し、得られた培養物から安定性ピルビン酸キナーゼを
採取することを特徴とする新規ピルビン酸キナーゼの製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8194676A JPS6031474B2 (ja) | 1976-07-12 | 1976-07-12 | バイオリアクタ−に使用する酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8194676A JPS6031474B2 (ja) | 1976-07-12 | 1976-07-12 | バイオリアクタ−に使用する酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS539392A JPS539392A (en) | 1978-01-27 |
| JPS6031474B2 true JPS6031474B2 (ja) | 1985-07-22 |
Family
ID=13760658
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8194676A Expired JPS6031474B2 (ja) | 1976-07-12 | 1976-07-12 | バイオリアクタ−に使用する酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6031474B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6329412A (ja) * | 1986-07-22 | 1988-02-08 | 住友電気工業株式会社 | 絶縁電線 |
| JPS6329411A (ja) * | 1986-07-22 | 1988-02-08 | 住友電気工業株式会社 | 絶縁電線 |
| JPS63178410A (ja) * | 1987-01-19 | 1988-07-22 | 東京特殊電線株式会社 | 滑性ポリウレタン絶縁電線 |
| JPH0679450B2 (ja) * | 1989-01-27 | 1994-10-05 | 第一電工株式会社 | 滑性絶縁電線 |
-
1976
- 1976-07-12 JP JP8194676A patent/JPS6031474B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS539392A (en) | 1978-01-27 |
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