JPS6196986A - アルコ−ルオキシダ−ゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、保存安定性に優れた新規なアルコールオキシ
ダーゼ及びその製造方法に関するものであり、更に詳し
くは３５℃以上で生育するトルロプシス属酵母をアルコ
ール培地で培養して得られる新規なアルコールオキシダ
ーゼ及びその製造方法に関するものであり、その目的と
するところは。

安価で大量に得られるアルコールを発酵原料として有効
利用し、産業上、有益な酵素であるアルコールオキシダ
ーゼ及びその製造方法を提供することにある。

（従来の技術） アルコールオキシダーゼは下記反応を触媒する。

ＲＣＨｘＯＨ＋　０□；ヨＲＣＨＯ＋　ＨｚＯｚ（式中
、Ｒは水素又はアルキル基を表す。）そのため、アルコ
ールオキシダーゼは、各種アルデヒドやアルコールの製
造２分析に用いられることができる。したがって、この
ような酵素は。

省エネルギーが経済性を左右する重要な因子となってい
る化学工業のうち、特にアルデヒドやアルコールの製造
に大変有用であるとともに、他方。

血液中のアルコール測定、酵素電極用の酵素としても、
産業上有益である。

一方、メタノール資化性微生物として知られている酵母
には１例えばキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）属、サ
ツカロマイセス（ジ匹二回工庄す！狂−）属、トルｎｊ
７”／ス（ｎ二圏巨圏）属酵母が、アグリカルテャル　
アンド　バイオロジカルケミストリー３６巻、１３号、
　２２９７〜２３０６頁、　１９７２年（Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ　３６１’ｈ　１３２２９７〜２３
０６、１９７２）に記載されており、またタレフケラ−
（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ　）属酵母がアグリ力ルチャル　
アンド　バイオロジカルケミストリー３６巻、１号。

６８〜７５頁、　１９７２年（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
　Ｖｏｌ　３６　　ｍｌ　　６８〜７５．１９７２）に
、またハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　）属酵母（特
開昭５５−１９０９４号公報参照）、ピヒア（Ｐｉｃｈ
ｉａ）属酵母（特開昭５６−２６１８７号公報参照）、
リボマイセス猛江竺匹照り属酵母（特開昭５９−１３５
８８５号公報参照）がそれぞれアルコールオキシダーゼ
を生産することが知られている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、工業的にアルデヒド、アルコールを生産
することを目的に、それら酵母由来のアルコールオキシ
ダーゼを比較検討してみると、キャンディダ属、クレッ
ケラー属、ハンセヌラ属酵母由来のアルコールオキシダ
ーゼは２作用適温がいずれも３５℃付近であるため不安
定であり、工業的操業が困難であった。それゆえ、安定
化のための処理が必要であることが判明した。この原因
は。

それら酵母の培養温度が２８℃近辺であることから。

酵素自体の安定性もその近辺に存在するので、３５℃付
近の操業は不安定になることに起因する。さらに、顕著
な例として、トルロプシス属酵母においては、培養温度
も２０℃と著しく低（、そのため。

酵素は極めて不安定であり、しかも精製されたアルコー
ルオキシダーゼの報告はなされていない。

このことが、前記したごとくアルコールオキシダーゼを
工業的に使用するに当たって大きな障害となっていたの
である。

（問題点を解決するための手段） そこで９本発明者らはかかる問題点を解決し。

室温において長期間活性を失わない性質を有するアルコ
ールオキシダーゼを求めて鋭意研究した結果、特定の酵
母に上記の性質を有するアルコールオキシダーゼが存在
することを見い出し、しかもこのアルコールオキシダー
ゼは容易に純粋に精製し得、かつ従来のアルコールオキ
シダーゼに比較し、驚くほどその安定性に優れた新規酵
素であることを見い出し８本発明を完成した。

すなわち１本発明は、下記の反応を触媒し、かつ溶液状
態で約３０°Ｃで３０日間保存したのちの活性が、保存
前の活性の約５０９＜以上の値を保持している性質を有
するアルコールオキシダーゼ及び３５℃以上で生育可能
なトルロプシス（ｎ」蝕匹旦）属に属する酵母をアルコ
ール培地に培養し、培養物から下記の反応を触媒し、か
つ溶液状態で約３０℃で３０日間保存したのちの活性が
、保存前の活性の約５０％以上の値を保持している性質
を有するアルコールオキシダーゼを採取することを特徴
とするアルコールオキシダーゼの製造方法である。

ＲＣＨｚＯ）１　＋　Ｏ□；プＲＣＨＯ＋ＨｚＯｚ（た
だし、Ｒは水素又はアルキル基を表す。）本発明のアル
コールオキシダーゼは、溶液状態で約３０℃で３０日間
保存することにより、アルコールオキシダーゼの残存活
性がもとの活性の約５０％以上の値を保持している性質
を有している（以下この性質を保存安定性という。）。

この保存安定性の試験は、　ｐＦ＋７．５の１００　ｍ
Ｍリン酸緩衝液でタンパク濃度が０．１　ｍｇ／ｍｌと
なるようにアルコールオキシダーゼ溶液を調製し、滅菌
処理を施した後。

約３０℃で３０日間保存することによって行われる。

次に１本発明のアルコールオキシダーゼの理化学的性質
を示すが、そのアルコールオキシダーゼは３５℃以上で
生育可能なトルロプシス属酵母から得られたものである
。

（１）作　用：次の反応を触媒する。

ＲＣＨｚＯＨ＋Ｏ□；ヨＲＣＨＯ＋ＨｚＯ□（ただし、
Ｒは水素又はアルキル基を表す。）（２）基質特異性：
メタノール及びエタノールに対するミカエリス定数（Ｘ
ｍ値）は、おのおの・６ｍＭ及び１７ｍＭである。

次に２本酵素の各種基質の反応活性の比率（エタノール
の反応活性を１００とする）を第１表に表す。

第１表 （３）至適ｐＨ：約ｐＨ７〜９（温度３０”Ｃ）（４）
安定ｐＨ範囲：　Ｉ）８６〜ＩＯテ４℃、２４時間の処
理でほとんど失活が起こらない。

（５）作用適温の範囲：　ｐＨ７，５”ｉ？２５℃より
４０℃までの温度の上昇とともに活性は増大する。

（６）耐熱性：３５℃、１５分間の加熱に対して安定で
ある。

（７）分子量＝３×１０５ダルトン、サブユニットの分
子量は７，５　Ｘ　１０’ダルトン。

（８）力価の測定法：　ＰＨ７，５，１００ｍＭ（７）
　Ｉ７７酸緩衝液にエタノール、オルソジアニシジン及
びパーオキシダーゼをそれぞれ１　（Ｖ／Ｖ）％。

０．０１（Ｖ／Ｖ）　％、　　１−Ｌニソ）／ｍｌ！：
ナルヨウにして調製した基質溶液０．５ｍｌにアルコー
ルオキシダーゼを加えて、　４３６ｎｍの吸光度の３０
℃での単位時間あたりの増加値より力価ヲ測定し、１分
間あたり１マイクロモルのオルソジアニシジンを酸化せ
しめる酵素量を求め、この量を酵素活性の１単位とした
。

（９）単一性：精製標品は、アクリルアミドディスク電
気泳動法により陽極側に移動し、単一なバンドを与えた
。また、　ＳＯＳ電気泳動法によってせ単一なバンドを
与えた。

本発明のアルコールオキシダーゼを製造するには８例え
ば次のごとき方法を採用することができる。すなわち、
３５℃以上で生育可能なトルロプシス属に属する酵母を
アルコール培地に培養し、その培養物から本発明のアル
コールオキシダーゼを採取することによって得ることが
できる。

本発明に使用する酵母は２本発明のアルコールオキシダ
ーゼを産生しうるものであればいがなるものでもよく１
例えばトルロプシスＲ−１４（ｍ工研苗寄第３１１４号
）、トルロプシスＲ〜２６（微工研菌寄第３１１５号）
、トル＋：＋プシス５−１８９　　（ｍ工研菌寄第３１
１６号ンがあ番デられる。

本発明における微生物を培養するに際して用いられる培
地としては１例えば主炭素源としてのアルコール、例え
ばメタノールと、窒素源、無機物。

ビタミン、その他生製促進物質とをそれぞれ適量に含有
する培地ならば２合成培地又は天然培地いずれでも使用
できる。この酵母は、培地中のメタノール濃度が６重量
％でも生育できるが９通気によるメタノールの蒸発損失
を少なくするために。

培地中のメタノールの初発濃度をできるだけ低くして、
メタノールの消費に合わせてメタノールを添加し、培養
液中のメタノールを低濃度に保つ培養方法をとることが
好ましい。

また、窒素源としては１例えばアンモニウム塩。

硝酸塩などの無機窒素化合物、尿素、コーンステイープ
リカー、酵母エキス、ペプトンなどの有機窒素化合物が
用いられる。窒素源として１例えばアンモニウム塩を使
用するときは、アンモニウムイオンが菌体生育のために
消費されると培養液のｐＨが低下するので、好適なＧｌ
）Ｉを維持するためアンモニア、カセイカリ、カセイソ
ーダなどを添加することが望まれる。また、培地中にそ
の他としてマグネシウム塩、リン酸塩、カリウム塩、カ
ルシウム塩、鉄塩などの無機塩及び必要に応じてビタミ
ン類、アミノ酸類などの生育に必須な物質あるいは生長
促進物質を添加することも好ましい。

培養にあたっては、温度３５℃以上、好ましくは３５〜
３８℃とし、　ｐＨを２．５〜８．０．好ましくは３６
０〜６．０とし、好気的培養を行うのがよい。

なお、一般にメタノール資化性酵母の増殖可能温度は、
３０〜３３℃であるが１本酵母はより高温（３５℃以上
）で、良好な培養ができるので、培養時に発生する熱を
除去する費用が少なくてすみ。

本発明の方法の実用上の価値は高い。

また、培養方法は回分培養、連続培養のいずれの方法を
行ってもよい。

培養液から酵母菌体を採取するには１例えば濾過、遠心
分離などを行えばよい。もし、必要ならば洗滌をほどこ
すこともできる。

次に、得られた培養物から本発明のアルコールオキシダ
ーゼが採取されるが、培養物１分離生菌体１分離菌体の
処理物、粗製酵素、精製酵素などのあらゆる段階で採取
できる。精製法としては。

通常の酵素精製法を用いることができる。すなわち、遠
心分離などにより菌体を得た後、菌体をマントンゴーリ
ン、ダイノミル、フレンチプレス。

超音波処理などにより細胞破砕後、遠心分離により細胞
片を除去し、細胞抽出液を得、これに硫酸ストレプトマ
イシン又は硫酸プロタミン処理を行い、さらには硫酸ア
ンモニア沈澱、アセトン沈澱。

加熱処理などを行い、精製するためにＤＥＡＥ−セルロ
ースカラムなどのイオン交換クロマトグラフィー、ヒド
ロキシアパタイトカラムなどの吸着クロマトグラフィー
、フェニルセファロースＣＬ−４Ｂ　（商品名、ファル
マシア社製）のような疎水性クロマトグラフィー、架橋
デキストランあるいは架橋、　ポリアクリルアミドなど
のゲル濾過クロマトグラフィーを組合せて行うことがで
きる。このようにして９本発明のアルコールオキシダー
ゼを単離。

精製することができる。

次に１本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１．比較例１ （ＮＨ４，）ｚｓＯ４２ｇ、　ＫＨｚＰＯ４０，５ｇ、
　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ、　ＮａＣ１０，０
５ｇ＋酵母エキス０．１ｇ、ビオチン１０μｇ、　チア
ミン塩酸塩４００μｇ、水１２゜ｐＨ４，５からなる培
地１００ｍ１を、　５００ｍ１容マイヤーフラスコに入
れ、　　１　ｋｇ／ｃｉ、　１０分間殺菌後、メタノー
ルを１　（Ｖ／Ｖ）％となるように添加し、これにトル
ロプシスＲ−１４（微工研菌寄　第３１１４号、）を接
種し、培養温度３５℃で振盤培養を行った。３６時間培
養後、培養液を遠心分離機にかけ、菌体を分離したとこ
ろ、２Ａあたり３０ｇの湿菌体が得られた。

この菌体３ｇをｐＨ７，５の２５ｍＭリン酸緩衝液２０
ｍ１に懸濁し、超音波発生装置にて３０分間処理し、細
胞を破壊した後、遠心分離してアルコールオキシダーゼ
活性を有する粗酵素液を得た。

この粗酵素液をあらかじめ上記緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムに通じ、塩化カリウムを上記緩
衝液に加えた溶液で溶出せしめると。

塩化カリウム濃度０．１５Ｍの近くに目的のアルコール
オキシダーゼが溶出した。この画分を集め、濃縮後、１
５％飽和相当の硫酸アンモニウムを加え。

あらかじめ上記リン酸緩衝液を１５％飽和相当の硫酸ア
ンモニウムを加えた溶液で平衡化したフェニル・セファ
ロースカラムに通じ、水により塩濃度を減少させること
によってアルコールオキシダーゼを溶出させた。

このようにして得たアルコールオキシダーゼはアクリル
アミドディスク電気泳動で単一なバンドを与え、さらに
セファクリルＳ−３００ゲル汐ロマトグラフイーにおい
ても９分子量約３００　、０００のところに単一のピー
クを与えた。

その収量は約７ｍｇで、酵素１ｍｇあたり約４０単位の
力価を示した。

次に、このようにして得たアルコールオキシダーゼと、
比較のためキャンディダＮ−１６（微工研菌寄　　第４
２５号。）をアグリ力ルチャル　アンドバイオロジカル
ケミストリー３６巻、１３号、　２２９７〜２３０６頁
、　１９７２年（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　
ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｂｑｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ　３
６　Ｎａ　１３２２９７〜２３０７．１９７２）に記載
の手法により培養し、かつ同文献記載の手法により精製
して得たアルコールオキシダーゼとの保存安定性を調べ
た（比較例１）。

保存安定性の試験は１００ｍＭ、　ｐＨ７，５のリン酸
緩衝液１０ｍ１に、それぞれＩｍｇのアルコールオキシ
ダ・−ゼを溶解し、メンブランフィルタ−により滅菌後
、３０℃に保ち、活性の経時変化を測定した。

その結果を第１図に示す。図中の曲線Ａが実施′例１１
曲線Ｂが比較例１である。この結果からあきらかなよう
に、キャンディダＮ−１６から得られたアルコールオキ
シダーゼは、３０℃で２日間保存することによりほぼ完
全にその活性を不可逆的に失うのに対し２本発明のアル
コールオキシダーゼは３０日経過した時点でも約６０％
の活性が保持されていた。

このように１本発明のアルコールオキシダーゼは驚くほ
ど安定であり、これを長期間保存することができる性質
を有している。この性質は、いままでのアルコールオキ
シダーゼにはないものである。

実施例２ （ＮＯ３）２ＳＯ４Ｌｏｇ、　ＫＨ２ＰＯ４２，５ｇ、
　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２，５ｇ、　ＮａＣ１０，２
５ｇ、　　Ｆｅ５０．・７Ｈｚ０　０．０１ｇ。

酵母エキス０．１ｇ、ビオチンＩＯμｇ、チアミン塩酸
塩４００μｇ、水１　／、　ｐｌ（４，５からなる培地
１５Ａを３０β容ジャーファーメンタ−に入れ、１ｋｇ
／ｃｒｊで２０分間殺菌し、これにメタノールを０．５
　（Ｖ／Ｖ）％となるように添加した。この培地に同様
組成培地で、あらかじめマイヤーフラスコにて３６時間
培養しておいたトルプロシスＲ−１４（微工研菌寄第３
１１４号。）の培養液を２容量％植菌し、３５℃で通気
培養を行った。ｐＨはアンモニア水を用いて自動的に４
．５になるように維持し、培養液中のメタノール濃度は
０．２〜０．５　（Ｖ／Ｖ）％となるように逐次添加し
ながら培養した。培養４５時間後にメタノールの添加量
は１５　（Ｖ／Ｖ）％に達したので、培養を停止し、遠
心分離により集菌したところ、１βあたり４５０ｇの湿
菌体が得られた。

この菌体４５０ｇをｐＨ７，５の２５ｍＭリン酸緩衝液
３１に懸濁し、ダイノミルにて細胞を破壊した後。

遠心分離してアルコールオキシダーゼ活性を有する粗酵
素液を得た。

この粗酵素液に１５％飽和相当の硫酸アンモニウムを加
え、あらかじめ上記リン＃緩衝液に１５％飽和相当の硫
酸アンモニウムを加えた溶液で平衡化したフェニル・セ
ファロースカラムに通じ、水により塩濃度を減少させる
ことによってアルコールオキシダーゼを溶出させた。次
に、この両分を集め、濃縮後、上記リン酸緩衝液に透析
し、あらかじめ上記リン酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
−セファセルカラムに通じ、塩化カリウムを上記リン酸
緩衝液に加えた溶液に溶出せしめると、塩化カリウム濃
度０．１５Ｍ近くに目的のアルコールオキシダーゼが溶
出した。

このようにして得たアルコールオキシダーゼは。

実施例１と同様にアクリルアミドディスク電気泳動で単
一なバンドを与え、ざらにセファクリルＳ−３００ゲル
クロマトグラフイーにおいても１分子量約３００．００
０のところに単一のビーフを与えた。

また、このアルコールオキシダーゼを実施例１と同様な
保存安定性の試験を行ったところ、実施例、１と同様の
保存安定性の結果が得られた。

（発明の効果） ・　　本発明のアルコールオキシダーゼは、極めて優れ
た保存安定性を有している。この優れた性能を利用して
アルコールをアルデヒドに変換させる系に適用させるこ
とができる。すなわち、アルコールオキシダーゼを包括
法により固定し、３０’Ｃにおいて連続的にアルコール
をアルデヒドに変換させるものである。その結果、従来
のアルコールオキシダーゼでは２〜３日でその触媒能力
を完全に失っていたものが１本発明のアルコールオキシ
ダーゼを用いると、３０日後においても初期の６０％の
能力を維持し、新たに４０％のアルコールオキシダーゼ
を加えることにより、初期と同程度の能力を持つように
なり、この操作を繰り返すことにより。

半永続的にアルコールをアルデヒドに変換させることが
可能である。

また２本発明のアルコールオキシダーゼは、驚くべきこ
とにその基質特異性が広いという顕著な特色を持ってい
る。すなわち、従来の酵母由来のアルコールオキシダー
ゼがメタノール及びエタノールに同等程度反応するのに
対し２本発明のアルコールオキシダーゼはエタノールに
強く反応するが、メタノールにはエタノールの約３５％
の反応性しか示さない。この性質は、エタノールの混在
しているエタノール溶液のエタノール濃度を酵素法で測
定する時、正誤差を小さくすることができ。

エタノールの測定法として、このアルコールオキシダー
ゼを用いれば、正確にエタノール測定ができることを意
味し、工業的なアルコール、アルデヒドの製造に加えて
分析面でも産業上有益である。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明のアルコールオキシダーゼ（曲線Ａ）
及びキャンディダから得られたアルコールオキシダーゼ
（曲線Ｂ）を３０℃で保存し、活性の経時変化（残存活
性）を示す図である。 特許出願人　　ユニチカ株式会社 苓１図 Ｓ　牧

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の反応を触媒し、かつ溶液状態で約３０℃で
   ３０日間保存したのちの活性が保存前の活性の約５０％
   以上の値を保持している性質を有するアルコールオキシ
   ダーゼ。 ＲＣＨ＿２ＯＨ■ＲＣＨＯ＋Ｈ＿２Ｏ＿２ （ただし、Ｒは水素又はアルキル基を表す。）
2. （２）３５℃以上で生育可能なトルロプシス（￥Ｔｏｒ
   ｕｌｏｐｓｉｓ￥）属に属する酵母をアルコール培地に
   培養し、培養物から下記の反応を触媒し、かつ溶液状態
   で約３０℃で３０日間保存したのちの活性が保存前の活
   性の約５０％以上の値を保持している性質を有するアル
   コールオキシダーゼを採取することを特徴とするアルコ
   ールオキシダーゼの製造方法。 ＲＣＨ＿２ＯＨ＋Ｏ＿２■ＲＣＨＯ＋Ｈ＿２Ｏ＿２（た
   だし、Ｒは水素又はアルキル基を表す。）