JPS63198984A - アルコ−ルオキシダ−ゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は耐熱性及び保存安定性の優れたアルコールオキ
シダーゼ及びその製造法に関する。

〔従来の技術〕

アルコールオキシダーゼはアルコールを酸化してアルデ
ヒドと過酸化水素を生成する反応を触媒する。従ってア
ルコールオキシダーゼは各種アルデヒドや過酸化水素を
製造に使用することができる。更に各種アルコール類、
例えばメタノール、エタノール及びｎ−プロパツール等
の分析にも用いることができる。このためこのような酵
素は血清中のアルコール測定、清酒、ビール、ウィスキ
ー等の酒類製品中のアルコール分析、上記酒類製造中の
工程分析としてのアルコール分析、または各種食品中の
アルコール分析にも大変有用であり、アルコールセンサ
ーとして産業上有益なものである。

現在までのところ、メタノール資化性微生物として知ら
れている酵母には、例えばカンジダ（０ａｎｄｌａ　）
属、ハンセヌラ（ａａｎａｅｎｕｌａ　）属、ビヒア（
Ｐｉｏｈｉａ　）　Ｊｌ　、サツカロミセス（Ｓａｏａ
ｈａｒｏｇｃｅｓ　）属及びトルロプシス（Ｔｏｒｕｌ
ｏｐｓｉｓ　）ｊｔｌが知られている。

更に具体的に説明すると、サツカロミセス属、トルロプ
シス属及びカンジダ属酵母のアルコールオキシダーゼ生
産については、アグリカルチャル・アンド・バイオロジ
カル・ケミストリー第３６巻、第２２９７〜２３０６頁
、１９７２年（Ａｇｒｉｏｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｏｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｖｏｌ、
　３６、第２２９７〜２３０６頁、１９７２年）にさら
にトルロプシス属酵母の酵素は特開昭６１−９６９８６
号公報に記載されており、またカンジダ属酵母の酵素に
ついては、ユーロピアン・ジャーナル・オプ・バイオケ
ミストリー第３６巻、第２５０〜２５６頁、１９７３年
（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　、Ｔｏｕｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｏｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　ｖｏｌ、３６、第２５０〜２５６頁、
１９７３年）にその性質が詳しく報告されている。また
ハンゼヌラ属酵母（特開昭５５−１９０９４号公報参照
）、ピヒア属酵母（特開昭５６−２６１８７号公報参照
）、リボマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅａ　）属酵母（特
開昭５９−１３５８８５号公報参照）がそれぞれアルコ
ールオキシダーゼを生産することが既に知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上述した如く、アルコールオキシダーゼは多種類の酵母
から生産されることは既に知られているが、それら酵母
由来のアルコールオキシダーゼは、耐熱性及び安定性が
低くアルデヒド、過酸化水素等の生産やアルコールセン
サーへの利用においては不十分であった。

本発明の目的は、従来の酵素に代り得る、耐熱性で安定
なアルコールオキシダーゼ及びその製造方法を提供する
ことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は次の理化学
的性質を有するアルコールオキシダーゼに関する。

（６）作用及び基質特異性： アルコールを酸化してアルデヒドと過酸化水素を生成す
る反応を触媒する （口）至適ｐＨ：約６〜８．５ （ハ）安定ｐＨ： 約６．０〜８．０ に）至適温度： 約３５℃〜４０℃ （（ホ）耐熱性： ５０″Ｃ１１５分間処理で約９０％の残存活性を有する （ハ）分子量： 約５．７　Ｘ　１０’　（’Ｉル濾過法）また本発明の
第２の発明は上記アルコールオキシダーゼの製造方法に
関し、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｌｌ　）　Ｊ
ｉに属するアルコールオキシダーゼ生産菌を培養し、培
養物から上記アルコールオキシダーゼを採取するアルコ
ールオキシダーゼの製造方法に関する。

本発明者らは、メタノールを資化、利用、高活性アルコ
ールオキシダーゼ生産酵母の分離及び検索を鋭意性なっ
た結果、耐熱性で安定なアルコールオキシダーゼを生産
する酵母が存在することを見出した。本発明はこの新知
見を基にするものである。

本発明の上記方法によれば、非常に耐熱性で安定なアル
コールオキシダーゼを得ることが可能である。従って本
発明方法は上述した従来法によるアルコールオキシダー
ゼに比し、非常に有効なアルコールオキシダーゼの工業
的生産方法を提供するものである。゛ 次に本発明を更に詳しく説明゛する。

本発明において使用する酵母は、以下に詳述する如く、
特にメタノールまたはエタノールを炭素源として、これ
を資化するものであることが好ましいが、本発明が目的
としているアルコールオキシダーゼを生産する酵母であ
ればいずれでも良い。これらの具体的菌株としては、例
えば本発明者らが±１中より単離したトルロプシス　ナ
ゴヤエンシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｎＩＬｇｏｙａ
ａｍｉｓ）Ｍ−２００３によって代表されるが、この他
にもアルコールオキシダーゼを生産するトルロプシス属
であればいずれでも使用できる。

また、本発明に用いる微生物は、前記トルロプシス　ナ
ゴヤエンシスに限らず、その自然的または人為的変異株
であってもメタノールを炭素源としてアルコールオキシ
ダーゼ生産能を有するトルロプシス属酵母であれば使用
することができる。

なお、前記Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｎａｇｏｙａｅｎｓ
ｉｓ　Ｍ−２００３株は工業技術院微生物工業技術研究
所へ微工研菌寄第９１３０号（ｙ瓦ＲＭＰ−９１３０）
として寄託されており、その菌学的性質を列挙すると次
のとおりである。

（Ｉ）各培地における生育状態 （１）ＭＹ液体培地： ２５℃で３〜５日培養、細胞は（２，５−５，０）Ｘ　
（３，０−６，０）ミクロン。円形あるいは卵形で、単
独または二連となる。酵母環、被膜の形成は見られない
。分裂子を形成せず多極出芽法で増殖する。

（Ｚ）ＭＹ寒天培地： ２５℃で５日培養、コロニーはクリーム色（淡黄白色）
、表面は滑らかで光沢があり、周縁は金縁状である。

（３）スライド培養： ２５°Ｃで５日培養、菌糸、偽菌糸は全く形成しガい。

（ＩＤ子のり胞子の形成 酢酸ソーダ培地、ゴロトコ’７　（Ｇｏｒｏｄｋｏｗａ
　）培地、野菜片培地、ＭＹ寒天培地などいずれにおい
ても子のう胞子の形成は認められない。

（Ｉｌｌ）射出胞子の形成 ＭＹ寒天培地において、射出胞子の形成は認められない
。

（ＩＶ）生理的性質 （１）最適生育条件；　ｐＨ４，５〜６．５、温度２５
〜３７°Ｃで良好な生育を示す （２生育の範囲ｉ　ｐＨ２，５〜８．５、温度４２℃以
下（３）硝酸塩の資化性；あり （４）アルブチンの分解；あり （５）尿素の分解性；なし く６）ゼラチンの液化性；なし く７）食塩耐性；１１〜１２％ （８）カロチノイドの生成；なし く９デンプン様物質の生成；なし ００ビタミンの要求性；ビオチンを促進的に要求αＤメ
タノール資化性；メタノールを炭素源としてよく生育す
、る ■糖類の発酵性 （１）Ｄ−グルコース　　　＋　（２）Ｄ−ガラクトー
ス　　　＋（３）乳　　　　糖　　−（４ンマルトース
　　−（５）シ　　ヨ　　糖　　　−（６）トレハロー
ス　　＋（７）メレジトース　　　−（８）ラフィノー
ス　　−（旧　　ヌ　　リ　　ン　　　　　− ＣＶＩ）各種炭素源の資化性 （１）Ｄ−グルコース　　　＋　（２）Ｄ−ガラクトー
ス　　　＋（３）　Ｌ−ソルボース　　　＋　（４）Ｄ
−リポース　　　＋（５）Ｄ−キシロース　　　＋　（
６）Ｄ−アラビノース　　　＋（７）Ｉ＋−ラムノース
　　　＋　（杓シ　　ョ　　糖　　　−（９）マル　ド
ース　　−００トレハロース　　　＋ＯＤα−メチルグ
ルコシド　−０２）セロビオース　　　十ｑ■サ　リ　
シ　ン　　　十　ａΦメリピオース　　　−０５）ラ　
り　ドース　　−００ラフイノース　　　−０７）メレ
ジトース　　　−α印グリセロール　　　＋ａ９可溶性
でんぷん　　　−ＣＯイ　ヌ　リ　ン　　　−（２１）
エリスリトール　　　−（２２）リ　ビ　ト　−　ル　
　＋（２３ガ？？ｆｌ−ｋ　　　　−に１４）Ｄ−マン
ニ）−Ａ／　　　　＋（２５）Ｄ−ズルシトール　　　
＋ｃ２ｅイノシトール　　　−（２′ｒ）Ｄｚ−乳酸　
　　十〇ｅフハ　　り酸　　十Ｇ２勧エン酸　　＋（３
Ｇエタノール　　十本国は上記（１）　−＜１）　、　
（■；■；０自ＩＭ　−（８）　、　（９）の性質から
ザ・イースト、ア・タキソノミツク・スタディ（？ｈｅ
　Ｙｅａｓｔ、　Ａ　Ｔａｘｏｎｏｍｉａ　５ｔｕｄｙ
）ノース・ホーランド・パブリッシング１９７０年発行
によってトルロプシス属に属すものと推宏される。しか
し本書に記載される公知の酵母の中には、重囲の生理学
的性質と一致するものは見られない。一方、既知のメタ
ノール資化性酵母の中でジャーナル・オプ・ゼネラル・
アプライド−マイクロバイオ四ジー（Ｊｏｕｎａｌ　ｏ
ｆＧｓｎ＠ｒａｌ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｏｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ　）第２２巻、第１９７〜２０２頁、１９７６
年に記載されている）／ｌ／Ｗプシス　ナゴヤエンシス
とはＤ−７ラビノースの資化性以外の点でほとんど性質
が一致しており、重囲はトルロプシス　ナゴヤエンシス
に属する菌株であると同定した。

次に本発明のアルコールオキシダーゼの一例であるトル
ロプシス　ナゴヤエンシスＭ　−２００３由来の酵素の
理化学的性質を示す。

（１）作　用： 次の反応を触媒する ＲＯＨｓＯＨ＋　Ｏｍ　ソ＝公」ＯＨＯ＋　Ｈ＊Ｏｚ（
式中、Ｒは水素またはアルキル基を示す）。

（２）基質特異性： 各種基質に対する相対活性（エタノールへの反応活性を
１００とした）を次表に示した。

第　　１　　表　基質特異性 メタノール及びエタノールに対するメカエリス定数（ｋ
ｍ）値はそれぞれ２．４３ｍＭ及び８．２３ｍＭであっ
た。

（つ至適ｐＨ＝ 約６〜８．５　（３７℃で測定）（第１図参照）（！＠
安定ｐＨ範囲： ３７℃、１５分間処理においてｐＨ約６．０〜８．０で
ほとんど失活が見られない（第２図参照）（０至適温度
： ｐＨ７，５において約３５℃〜４０℃（第３図参照） （０耐熱性： 各温度における１５分間加熱処理後の残存相対活性を第
４図に示す。図中１は本発明の酵素、２はビヒア由来の
酵素（シグマ社製）、また３はカンジダ由来の酵素（シ
グマ社製）をそれぞれ示す。

（η保存安定性： 保存安定性の試験は０．０５％アジ化ナトリウムを含む
５０１１１Ｍ５ＰＨ７，５のリン酸綴衝液にアルコール
オキシダーゼを溶解し３０℃に保ち活性の経時変化を測
定した。その結果を第５図に示す。

（８〕分子量： 約５．７×１０５ダルトン（ゲル濾過法）。そのサブユ
ニットの分子量は約７．ｌ×１０５ダルトン（５ＤＳ−
電気泳動法）であった。

（９）単一性： 精−標品は５％アクリルアミド電気泳動（ｐＨ８，０）
で単一であった。更に５Ｄ８−電気泳動においても単一
なバンドを与えた。

００活性測定法： 酵素活性測定反応液の成分としてはｌ　ｙｎｌ中に１０
０μｍｏｌのメタノール、０．０１％の４−７ミノアン
チビリン、０．０２％の７エノール、５υのパーオキシ
ダーゼを含む。これに酵素液を添加して３７°Ｃで反応
させ５００ｎｍの吸光度の増加より、活性を測定する。

酵素反応の単位Ｕは１分間に１μｍｏｌのＨｏｏｔを生
じせしめる酵素力価とする。

本発明の耐熱性かつ安定なアルコールオキシダーゼを製
造するには例えば次のような方決を用いることができる
。即ち、トルロプシス属のアルコールオキシダーゼ生産
能を有する酵母を培地に培養し得られた培養物から本発
明のアルコールオキシダーゼを得ることが可能である。

本発明に使用する・トルロプシス属酵母は本発明のアル
コールオキシダーゼを生産しうるちのであればいずれの
酵母であっても良く、例えばトルロプシス　ナゴヤエン
シスＭ　−２００３株が挙げられる。

トル四プシス属酵母を培養するための培地はアルコール
オキシダーゼを生産する培地であればよく、窒素源とし
てはペプトン、肉エキス、脱脂粉乳、ポリペプトン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸等の有機物及び尿素、硫安
またはアンモニア等を用いることができる。主炭素源と
してはメタノールまたはエタノール、イソプロピルアル
コール、ｎ−プロパツール等も使用できるが好ましくは
メタノールを唯一の炭素節とした培地が酵素の誘導生産
に効果的である。

更に、りん酸第−カリウム、りん酸第二カリウム等のリ
ン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等のマグ
ネシウム塩、及び亜鉛、カルシウム、マンガン、鉄等の
金属イオン、そして各々の使用菌株の生育等に必須の微
量栄養素を適当量添加した培地が使用可能である。　　
。

培地は三角７ラスフ、坂ロフラスコの場合は振トウ培養
、タンク培養の場合は通気攪拌培養で実施可能である。

培養温度は１５〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃、一
般にｐＨは２．５〜Ｂ、５、好ましくは４．５〜６．５
で行なう。タンク培養の場合、培養時間は通常４８〜７
２時間である。

培養終了後、培養液中の濾過または遠心分離により回収
及び洗浄することができる。

次に得られた培養物から本発明のアルコールオキシダー
ゼが採取されるが、培養物、分離生菌体、分離菌体の処
理物、ｆ！＃製酵素などの全ての精製段階で採取可能で
ある。

酵素の精製は通常の菌体、内酵素の精製法を使うことが
可能である。即ち遠心分離等により菌体を集めた後、菌
体をダイノミル、フレンチプレス、超音波処理等により
破砕した後、遠心分離によって細胞破砕片を除去し硫安
塩析、ストレプトＴイシン処理、プロタミン処理、ポリ
エチレンイミン処理を行なったのち、ＤＩ！ｊＡＩ−セ
ファロース、Ｉ）］］ｌ１Ａ１１ｔ−ト目バールのイオ
ン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトなど
の吸着クロマトグラフィー、セファデックスＧ−２００
、ト目パールＨＷ−２００等のゲル濾過クロマトグラフ
ィーによって行なうことが可能である。このようにして
本発明のアルコールオキシダーゼを精製することが出来
る。

〔実施例〕

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例　１ 種菌としてトルロプシス゛ナゴヤエンシスＭ−２００３
（ｙｍＲＭｐ−９１３０）を使用する。

ｗｎａａｌ　　０．４　Ｐ　／ｄｌ、ＫＨ＊ＰＯ４０，
ＩＳ’／ｄＩ！、１ｈＨＰＯａＯ１１５’　／ｄｌ　ｓ
　Ｍｇ８０ｔ　ｅ７ｕａｏ　ｏ、　０５　Ｐ　７ｄｌ　
、酵母エキス　０．０５Ｐ／ｄｌ、ペプトン　ｉＦ−／
ｄｌ（ｐＨ６，０）よりなる種培地５００ｍｊを２１容
三角フラスコに入れ１２０’Ｃ，１５分間殺菌する。

上記培地にメタノールを２，０％（ｖ　／　ｖ　）　ト
なるように添加し、前記菌株を１白金耳接種し、３０℃
でｆ２時間振トウ培養する。培養終了後、培養液のすべ
てを３０１ジャーファーメンタ−中の２０１本培養培地
に接種する。ジャー７アーメンター用の培地組成は、前
記培地と同様である。

本培養は３０℃、１５０　ｒ、ｐ、ｍ　、　、通気１１
／／（培地）７分で７２時間培養する。

培養終了液からアルコールオキシダーゼを採取するため
該液を遠心分離して菌体を得、これをｐＨ７，５の５０
ｍＭりん酸緩衝液１１に懸濁し、ダイノミルにて細胞を
破砕した後、遠心分離して上澄液を得る。

この上澄液にポリエチレンイミンを０．０５％濃度とな
るように添加して、沈殿物を遠心分離により除去し、上
澄液を得る。

次いで５０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化し
た５００ＭのＤＩｌ！ＡＭ−セファロースＯｌ、−６Ｂ
カラム（直径７Ｃ１＋、長さ１３　ａｍ　）にチャージ
し、同緩衝液で洗浄し、次に塩化す）　ＩＪウム０〜０
．５Ｍの濃度勾配で溶出を行なう。アルコールオキシダ
ーゼ溶出画分を集めた。

次いで活性画分を、５０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７，５
）を外液として一晩透析したのち、５０ｆｆｉＭりん酸
緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したＤＥＡＩＣ−トヨバ
ール６５０８カラム（直径２．２　Ｃ１１、長さ３０ｃ
ｍ）にチャージし、同緩衝液にて洗浄し、次に塩化ナト
リウムＯ〜０．５Ｍの濃度勾配で溶出を行なう。アルコ
ールオキシダーゼ溶出画分を集め、限外濾過にて２０１
まで濃縮した。

この酵素液を０．５　Ｍ　　ｘｏｉを含有ｔ　ルｐＨ７
，５の５０ｍＭりん酸緩衝液で平衡化したトヨパールＨ
Ｗ−５５ｆ９のカラム（直径２．２　ｃｍ　、長さ９５
ｃｍ）にてゲル濾過を行なう。アルコールオキシダーゼ
活性画分を集め、コ四ジオンバッグでｌＱｍ＃まで濃縮
したのち、凍結乾燥する。

約６０％の活性収率でアルコールオキシダーゼを採取し
た。得られた標品の活性は、５．０Ｔｙ／ツであり、２
８０ｍｍの吸光度あたりの活性は２．５１７であった。

このようにして得られたアルコールオキシダーゼは、ア
クリルアミドディスク電気泳動で単一ナバンドヲ与え、
更にスーパーロース’Ｉ’Ｍ　Ｑゲルク四マドグラフィ
ー（ファルマシア社製）においても、分子量約５７００
００のところに単一のピークを与えた。

得られたアルコールオキシダーゼの耐熱性を第４図のグ
ラフに１で示す。

応用例　１ 実施例１で得られたアルコールオキシダーゼを用いてア
ルコールセンサーを作製し、酵素の安定性について検討
した。

すなわち、アルコールオキシダーゼを、ポーツ、−２゜
エチレンイミンとゲルタールアルデヒドを−ｓ’、’、
＋”剤として使用し、トリアセチルセル四−ス膜に固定
した。その結果センサーの電極応答は２週間以上安定で
あった。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したとおり、本発明のアルコールオキシ
ダーゼは耐熱性に優れており、培養物からの酵素精製が
容易であること、また保存安定性に優れておりアルコー
ルセンサーに適した酵素である点において顕著な効果を
有する。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図、及び第５図はそれぞれ本発明
のアルコールオキシダーゼの至適ｐＨ１安定ＰＨｑ至適
温度及び保存安定性を示すグラフ、ｍ４Ｆ！！Ｊは本発
明のアルコールオキシダーゼ（１）、ピヒア由来のアル
コールオキシダーゼ（り及びカンジダ由来のアルコール
オキシダーゼ（３）の耐熱性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有するアルコールオキシダーゼ
   。 （イ）作用及び基質特異性： アルコールを酸化してアルデヒドと過酸化 水素を生成する反応を触媒する （ロ）至適ｐＨ： 約６〜８．５ （ハ）安定ｐＨ： 約６．０〜８．０ （ニ）至適温度： 約３５℃〜４０℃ （ホ）耐熱性 ５０℃、１５分間処理で約９０％の残存活性を有する（
   ヘ）分子量： 約５．７×１０＾５（ゲル濾過法） ２、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属に属する
   アルコールオキシダーゼ生産能を有する酵母を培養し、
   培養物から下記の理化学的性質を有するアルコールオキ
   シダーゼを採取することを特徴とするアルコールオキシ
   ダーゼの製造方法。 （イ）作用及び基質特異性： アルコールを酸化してアルデヒドと過酸化 水素を生成する反応を触媒する （ロ）至適ｐＨ： 約６〜８．５ （ハ）安定ｐＨ： 約６．０〜８．０ （ニ）至適温度： 約３５℃〜４０℃ （ホ）耐熱性： ５０℃、１５分間処理で約９０％の残存活 性を有する （ヘ）分子量： 約５．７×１０＾５（ゲル濾過法）