JP2566943B2 - グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法 - Google Patents
グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法Info
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- JP2566943B2 JP2566943B2 JP62058874A JP5887487A JP2566943B2 JP 2566943 B2 JP2566943 B2 JP 2566943B2 JP 62058874 A JP62058874 A JP 62058874A JP 5887487 A JP5887487 A JP 5887487A JP 2566943 B2 JP2566943 B2 JP 2566943B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は反応性が高くグルコースに特異的な基質特異
性を有するグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法に関
する。
性を有するグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法に関
する。
（従来の技術） グルコースデヒドロゲナーゼは β−Ｄ−グルコース＋NAD（Ｐ）＋→ Ｄ−グルコノラクトン＋NAD（Ｐ）Ｈ＋H+ の反応を触媒する酵素である。近年に、臨床検査分野に
おいて、上記酵素反応を利用した生体液中のグルコース
の定量測定が行なわれており、グルコースデヒドロゲナ
ーゼの需要が高まっている。
おいて、上記酵素反応を利用した生体液中のグルコース
の定量測定が行なわれており、グルコースデヒドロゲナ
ーゼの需要が高まっている。
従来のグルコースデヒドロゲナーゼの製造法として
は、例えばバチルス・メガテリウム菌株から培養、採取
する方法（特開昭58−201985号公報）、バチルス・セレ
ウム菌株から培養、採取する方法（特開昭57−16693号
公報）、アセトバクター，アシネトバクター，グルコノ
バクターまたはシュードモナスの各属の菌株から培養、
採取する方法（特開昭59−25700号公報）等が知られて
いる。
は、例えばバチルス・メガテリウム菌株から培養、採取
する方法（特開昭58−201985号公報）、バチルス・セレ
ウム菌株から培養、採取する方法（特開昭57−16693号
公報）、アセトバクター，アシネトバクター，グルコノ
バクターまたはシュードモナスの各属の菌株から培養、
採取する方法（特開昭59−25700号公報）等が知られて
いる。
しかしながら、特にグルコノバクター属に属する生産
菌からのグルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースに
対する反応性を100とした場合、２−デオキシ−グルコ
ースに対して227の相対活性を示すもので、さらにマン
ノサミンに対しても95の相対活性を示し、その基質特異
性が広すぎる欠点を有していた（「酵素ハンドブック」
第43頁,1983年３月，株式会社朝倉書店発行参照）。
菌からのグルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースに
対する反応性を100とした場合、２−デオキシ−グルコ
ースに対して227の相対活性を示すもので、さらにマン
ノサミンに対しても95の相対活性を示し、その基質特異
性が広すぎる欠点を有していた（「酵素ハンドブック」
第43頁,1983年３月，株式会社朝倉書店発行参照）。
また、上記した如く近年とくにグルコースデヒドロゲ
ナーゼの需要が高まっており、新たなグルコースデヒド
ロゲナーゼ生産菌の発見により新規な製造法が開発され
ることが期待されている。
ナーゼの需要が高まっており、新たなグルコースデヒド
ロゲナーゼ生産菌の発見により新規な製造法が開発され
ることが期待されている。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は、反応性が高くか
つ基質特異性がグルコースに特異的な新規なグルコース
デヒドロゲナーゼの新規な製造方法を提供することであ
る。
つ基質特異性がグルコースに特異的な新規なグルコース
デヒドロゲナーゼの新規な製造方法を提供することであ
る。
［発明の構成］ （問題点を解決するための手段） 本発明は、クリプトコッカス（Cryptococcus）属，カ
ンジダ（Candida）属，デバリオマイセス（Debariomyse
s）属，ハンセヌラ（Hansenula）属またはピチア（Pich
ia）属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培
地に培養し、その培養物からグルコースおよびNADPから
グルコノ−δ−ラクトンおよび還元型NADPを生成する反
応を触媒するグルコースデヒドロゲナーゼを採取するこ
とによるグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法に関す
る。
ンジダ（Candida）属，デバリオマイセス（Debariomyse
s）属，ハンセヌラ（Hansenula）属またはピチア（Pich
ia）属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培
地に培養し、その培養物からグルコースおよびNADPから
グルコノ−δ−ラクトンおよび還元型NADPを生成する反
応を触媒するグルコースデヒドロゲナーゼを採取するこ
とによるグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法に関す
る。
本発明に使用される各属のグルコースデヒドロゲナー
ゼ生産菌としては、クリプドコッカス（Cryptococcus）
属，カンジダ（Candida）属，デバリオマイセス（Debar
iomyses）属，ハンセヌラ（Hansenula）属またはピチア
（Pichia）属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産
菌であればよく例えばクリプトコッカス ユニグトラー
タス（Cryptococcus uniguttulatus）Y0033（微工研条
寄第1352号），カンジダ サケ（Candida sake）Y0192
（微工研菌寄第8710号），デバリオマイセス ハンセニ
イ（Debariomyces hansenii）HUT 7012（微工研菌寄第8
711号），ハンセヌラ アノマラ（Hansenula anomala）
HUT 7083（微工研菌寄第8712号）およびピチア ボビス
（Pichia bovis）ATCC 24208が挙げられる。上記各菌の
性状を次に示す。
ゼ生産菌としては、クリプドコッカス（Cryptococcus）
属，カンジダ（Candida）属，デバリオマイセス（Debar
iomyses）属，ハンセヌラ（Hansenula）属またはピチア
（Pichia）属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産
菌であればよく例えばクリプトコッカス ユニグトラー
タス（Cryptococcus uniguttulatus）Y0033（微工研条
寄第1352号），カンジダ サケ（Candida sake）Y0192
（微工研菌寄第8710号），デバリオマイセス ハンセニ
イ（Debariomyces hansenii）HUT 7012（微工研菌寄第8
711号），ハンセヌラ アノマラ（Hansenula anomala）
HUT 7083（微工研菌寄第8712号）およびピチア ボビス
（Pichia bovis）ATCC 24208が挙げられる。上記各菌の
性状を次に示す。
クリプトコッカス ユニグトラータス Y0033 1.各培地における生育状態 （１）YM液体培地 25℃３日間培養で、栄養細胞は球形〜楕円形,2〜５×
４〜５μm,多極出芽により増殖。白色，粉状の沈澱物を
形成。皮膜は培養５日目よりリング状に形成。
４〜５μm,多極出芽により増殖。白色，粉状の沈澱物を
形成。皮膜は培養５日目よりリング状に形成。
（２）YM寒天培地 集落は円形，周縁は全円，隆起は半レンズ状，表面は
平滑，光沢は輝光，性状はバター状，色は白色。
平滑，光沢は輝光，性状はバター状，色は白色。
（３）バレイショ抽出液寒天培地によるスライド培養 偽菌糸は形成されない。
2.子のう胞子の形成 − 3.射出胞子の形成 − 4.各生理的性質 （１）最適生育条件 pH5〜9,温度24〜30℃ （２）生育の範囲 pH4.5〜11.5,温度19〜33℃ （３）硝酸塩の同化 − （４）脂肪の分解 − （５）尿素の分解 ＋ （６）ゼラチンの液化 − （７）好浸透圧性または耐浸透圧性 − （８）カロチノイドの生成 − （９）顕著な有機酸の生成 − （10）デンプン様物質の生成 − （11）ビタミン欠乏培地での生育 ＋ｗ 5.各炭素源の発酵性及び資化性 発酵性 Ｄ−グルコース − Ｄ−ガラクトース − 麦芽糖 − ショ糖 − 乳糖 − ラフィノース − 資化性 Ｄ−アラビノース ＋ｓ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−リボース ＋ Ｄ−キシロース ＋ｗ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース − Ｄ−ガラクトース − Ｌ−ラムノース ＋ Ｄ−フラクトース − Ｌ−ソルボース − 麦芽糖 ＋ ショ糖 ＋ 乳糖 − メリビオース − セルビオース − トレハロース ＋ ラフィノース ＋ メレジトース ＋ α−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ アルブチン ＋ デキストリン − 可溶性デンプン ＋ｗ イヌリン ＋ｗ エタノール ± アドニット ± エリトリット − イノシット ＋ Ｄ−マンニット ＋ Ｄ−ソルビット ＋ ズルシット − Ｄ−グルコン酸塩 − グリセリン − ２−ケト−Ｄ−グルコン酸塩 ＋ DL−乳酸塩 ＋ コハク酸塩 − クエン酸塩 − この菌は静岡県田方郡大仁町の豚舎から単離された酵
母に属する菌である。この菌は多極出芽で増殖し、子の
う胞子，射出胞子及び偽菌糸形成しない。イノシトール
を資化する等の特色からクリプトコッカス属に属する。
炭素源の資化性パターンの他、硝酸塩で資化しない、ビ
タミンを要求する、37℃で生育しない等の生理的特色か
ら、本菌はCryptococcus uniguttulatusと同定され、Cr
yptococcus uniguttulatusY0033株と命名された。
母に属する菌である。この菌は多極出芽で増殖し、子の
う胞子，射出胞子及び偽菌糸形成しない。イノシトール
を資化する等の特色からクリプトコッカス属に属する。
炭素源の資化性パターンの他、硝酸塩で資化しない、ビ
タミンを要求する、37℃で生育しない等の生理的特色か
ら、本菌はCryptococcus uniguttulatusと同定され、Cr
yptococcus uniguttulatusY0033株と命名された。
本株は微工研に（微工研条寄第1352号）として寄託され
た。
た。
カンジダ サケ Y192 1.各培地における生育状態 （１）YM液体培地 25℃３日間で、栄養細胞は卵円形〜球形１〜３×２〜
５μm,多極出芽により増殖。白色，粉状の沈澱物を形
成。皮膜はリング状に形成。
５μm,多極出芽により増殖。白色，粉状の沈澱物を形
成。皮膜はリング状に形成。
（２）YM寒天培地 集落は円形，周縁は乱糸状，隆起は半レンズ状，表面
は平滑，光沢は輝光，性状はバター状，色は白色〜クリ
ーム。
は平滑，光沢は輝光，性状はバター状，色は白色〜クリ
ーム。
（３）バレイショ抽出液寒天培地によるスライド培養 偽菌糸を形成。
2.子のう胞子の形成 − 3.射出胞子の形成 − 4.各生理的性質 （１）最適生育条件 pH6〜8,温度19〜22℃ （２）生育の範囲 pH2〜8.5,温度16〜27℃ （３）硝酸塩の同化 − （４）脂肪の分解 − （５）尿素の分解 − （６）ゼラチンの液化 − （７）好浸透圧性または耐浸透圧性 ＋ （８）カロチノイドの生成 − （９）顕著な有機酸の生成 ＋ （10）デンプン様物質の生成 − （11）ビタミン欠乏培地での生育 ＋ （12）DBBテスト − 5.各炭素源の発酵性及び資化性 発酵性 Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋s,w 麦芽糖 ＋s,w ショ糖 ＋s,w 乳糖 − ラフィノース 資化性 Ｄ−アラビノース − Ｌ−アラビノース − Ｄ−リボース ＋w,s Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ Ｌ−ラムノース − Ｄ−フラクトース ＋ Ｌ−ソルボース ＋ 麦芽糖 ＋ ショ糖 ＋ 乳糖 − メリビオース − セルビオース − トレハロース ＋ ラフィノース − メレジトース ＋ α−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ アルブチン − デキストリン ＋ 可溶性デンプン − イヌリン − エタノール ＋ アドニット ＋ エリトット − イノシット − Ｄ−マンニット ＋ Ｄ−ソルビット ＋ ズルシット − Ｄ−グルコン酸塩 − グリセリン − ２−ケト−Ｄ−グルコン酸塩 ＋ DL−乳酸塩 ＋ コハク酸塩 ＋ クエン酸塩 ＋ この菌株は長野県佐久市の土壌より単離された酵母に
属する菌である。多極出芽で増殖し、子のう胞子及び射
出胞子を形成しない、偽菌糸を形成する。イノシトール
を資化しない等の特色からCandida属に属する。さらにD
BBテスト −，イノシトール，エリトリット，マルトー
ス，ラフィノースの各炭素源の資化性 −，硝酸塩の資
化性 −等の特色から“The Yeasts;a taxonomic study
1984"のCandida Group VIIに該当する。Group VIIには
28種認められているが、ガラクトースの資化性 ＋，可
能性デンプン，乳糖及びセロビオースの資化性 −,37
℃での生育 −，グルコースの発酵性 ＋，偽菌糸の形
成 ＋等から、本菌はCandida sakeと同定され、Candid
a sakeY0912と命名された。本株は微工研に微工研菌寄
第8710号として寄託された。
属する菌である。多極出芽で増殖し、子のう胞子及び射
出胞子を形成しない、偽菌糸を形成する。イノシトール
を資化しない等の特色からCandida属に属する。さらにD
BBテスト −，イノシトール，エリトリット，マルトー
ス，ラフィノースの各炭素源の資化性 −，硝酸塩の資
化性 −等の特色から“The Yeasts;a taxonomic study
1984"のCandida Group VIIに該当する。Group VIIには
28種認められているが、ガラクトースの資化性 ＋，可
能性デンプン，乳糖及びセロビオースの資化性 −,37
℃での生育 −，グルコースの発酵性 ＋，偽菌糸の形
成 ＋等から、本菌はCandida sakeと同定され、Candid
a sakeY0912と命名された。本株は微工研に微工研菌寄
第8710号として寄託された。
デバリオマイセス ハンセニイ HUT 7012 1.各培地における生育状態 （１）麦芽汁培地 26℃７日間培養で細胞は球形〜楕円形，多極出芽,2〜
６×２〜８μm,数個連鎖する。沈澱物は粉状。皮膜はリ
ング状に形成。
６×２〜８μm,数個連鎖する。沈澱物は粉状。皮膜はリ
ング状に形成。
（２）麦芽汁寒天培地 26℃７日間で生育良好。集落は白色，鈍光，バター
質，平滑。周縁は全縁。
質，平滑。周縁は全縁。
（３）バレイショ抽出液寒天培地によるスライド培養 偽菌糸は形成されない。
2.子のう胞子の形成 ニンジン片培地及び野菜汁培地にて形成される。接合
法。球形で表面はやや粗面。2.5〜３μｍ。１子のうに
１個形成。
法。球形で表面はやや粗面。2.5〜３μｍ。１子のうに
１個形成。
3.各生理的性質 硝酸塩の資化性 − アルブチンの分解 ＋ ビタミン欠乏培地での生育 − 37℃での生育 − 4.炭素源の発酵性及び資化性 発酵性 Ｄ−グルコース ＋ｗ Ｄ−ガラクトース ± 麦芽汁 ± ショ糖 ＋ｗ 乳糖 − ラフィノース − 資化性 Ｄ−アラビノース − Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−リボース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ 麦芽糖 ＋ ショ糖 ＋ 乳糖 − セルビオース − トレハロース ＋ ラフィノース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ 可溶性デンプン ＋ イヌリン − この菌は広島大学工学部よりDebariomyces kloeckeri
として分与された菌株である。現在D.kloeckeriという
種は認められておらず（The yeasts,a taxonomic stud
y,1984）、すべてDebariomyces hanseniiに編入されて
いる。
として分与された菌株である。現在D.kloeckeriという
種は認められておらず（The yeasts,a taxonomic stud
y,1984）、すべてDebariomyces hanseniiに編入されて
いる。
HUT 7012株の再認識を行なった結果、栄養細胞は多極
出芽により増殖，子のうは接合により形成，子のう胞子
は球形かつ粗面，硝酸塩を資化しない、グルコースの発
酵性微弱等の特色からDebariomyces属に属することが、
確認された。Debariomyces属は現在９種類認められてい
るが、（The yeasts,a taxonomic study,1984）、子の
う胞子は球形〜亜球形かつ粗面,1子のうに１個形成，グ
ルコース及びショ糖の発酵性あるが微弱，ショ糖，麦芽
糖及びキシロースを資化する。ビタミンの要求性ある等
の特色から、本菌はDebariomyces hanseniiであること
が確認された。本菌は微工研に微工研菌寄第8711号とし
て寄託された。
出芽により増殖，子のうは接合により形成，子のう胞子
は球形かつ粗面，硝酸塩を資化しない、グルコースの発
酵性微弱等の特色からDebariomyces属に属することが、
確認された。Debariomyces属は現在９種類認められてい
るが、（The yeasts,a taxonomic study,1984）、子の
う胞子は球形〜亜球形かつ粗面,1子のうに１個形成，グ
ルコース及びショ糖の発酵性あるが微弱，ショ糖，麦芽
糖及びキシロースを資化する。ビタミンの要求性ある等
の特色から、本菌はDebariomyces hanseniiであること
が確認された。本菌は微工研に微工研菌寄第8711号とし
て寄託された。
ハンセヌラ アノマラ HUT 7083 1.各培地における生育状態 （１）麦芽汁培地 26℃７日間培養で栄養細胞は球形〜長楕円形,2〜４×
２〜８μm,単生〜数個連鎖する。沈澱物は粉状，皮膜は
平滑に形成。
２〜８μm,単生〜数個連鎖する。沈澱物は粉状，皮膜は
平滑に形成。
（２）麦芽汁寒天培地 26℃７日間で生育良好。集落は白色，鈍光，バター
質，平滑，周縁は波状。
質，平滑，周縁は波状。
（３）バレイショ抽出液寒天培地によるスライド培養 多数の偽菌糸が形成される。
2.子のう胞子の形成 ニンジン片培地及び野菜汁培地にて形成される。山高
帽型で表面は平滑。2.0〜3.0×2.0〜2.5μｍ。１子のう
に１〜４個形成。
帽型で表面は平滑。2.0〜3.0×2.0〜2.5μｍ。１子のう
に１〜４個形成。
3.各生理的性質 硝酸塩の資化性 ＋ アルブチンの分解 ＋ ビタミン欠乏培地での生育 ＋ 37℃での生育 − 4.炭素源の発酵性及び資化性 発酵性 Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ 麦芽汁 ＋ ショ糖 ＋ 乳糖 ＋ ラフィノース ＋ 資化性 Ｄ−アラビノース − Ｌ−アラビノース − Ｄ−リボース − Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース Ｌ−ラムノース 麦芽糖 ＋ ショ糖 ＋ 乳糖 − セロビオース ＋ トレハロース ＋ ラフィノース ＋ 可溶性デンプン ＋ イヌリン − エリトリット ＋ 本菌は広島大学工学部より分与を受けた株である。再
確認を行なった結果、栄養細胞は多極出芽により増殖，
偽菌糸を形成，山高帽型の子のう胞子を形成，子のうは
長い管状とはならない、硝酸塩を資化する等の特色から
ハンセヌラ属に属することが確認された。ハンセヌラ属
は30種認められているが、（The yeasts,a taxonomic s
tudy 1984）、麦芽糖、エリトリット及び可溶性デンプ
ンを資化する、ラムノースを資化しない、ビタミン要求
性はない。グルコース，ショ糖及び麦芽糖の発酵性ある
等の特色から、本菌は微工研に微工研菌寄第8712号とし
て寄託された。
確認を行なった結果、栄養細胞は多極出芽により増殖，
偽菌糸を形成，山高帽型の子のう胞子を形成，子のうは
長い管状とはならない、硝酸塩を資化する等の特色から
ハンセヌラ属に属することが確認された。ハンセヌラ属
は30種認められているが、（The yeasts,a taxonomic s
tudy 1984）、麦芽糖、エリトリット及び可溶性デンプ
ンを資化する、ラムノースを資化しない、ビタミン要求
性はない。グルコース，ショ糖及び麦芽糖の発酵性ある
等の特色から、本菌は微工研に微工研菌寄第8712号とし
て寄託された。
ピチア ボビス ATCC 24208 ATCC 24208寄託菌（van Uden,N,and de Carmo−Sous
a,L.“Jounal of General Microbiology"16:385（195
7）参照） 本発明における上記各酵母によるグルコースデヒドロ
ゲナーゼの製造は、通常の酵母培養による酵母の製造の
方法にしたがって行なう。すなわち酵母の培地に接種
し、通気撹拌にる好気的培養条件下に培養する。
a,L.“Jounal of General Microbiology"16:385（195
7）参照） 本発明における上記各酵母によるグルコースデヒドロ
ゲナーゼの製造は、通常の酵母培養による酵母の製造の
方法にしたがって行なう。すなわち酵母の培地に接種
し、通気撹拌にる好気的培養条件下に培養する。
培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用され、例えば窒素源としてはコーンスチ
ープリカー，大豆粉，カゼイン加水分解物，ペプトン，
酵母エキス，肉エキス等が好ましく、炭素源としては資
化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコースま
たはマルトース，シュクロース，ラクトースなどの二糖
類，デキストリン，澱粉，糖蜜などが使用される。
ものが広く使用され、例えば窒素源としてはコーンスチ
ープリカー，大豆粉，カゼイン加水分解物，ペプトン，
酵母エキス，肉エキス等が好ましく、炭素源としては資
化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコースま
たはマルトース，シュクロース，ラクトースなどの二糖
類，デキストリン，澱粉，糖蜜などが使用される。
培養温度は菌が発育しグルコースデヒドロゲナーゼを
生産する範囲内で適宜変更できるが好ましくは25℃〜37
℃特に30℃付近である。培養時間は条件によって多少異
なるが、グルコースデヒドロゲナーゼが最高収量に達す
る時期をみはからって適当な時期に培養を終了すればよ
く通常20〜50時間である。
生産する範囲内で適宜変更できるが好ましくは25℃〜37
℃特に30℃付近である。培養時間は条件によって多少異
なるが、グルコースデヒドロゲナーゼが最高収量に達す
る時期をみはからって適当な時期に培養を終了すればよ
く通常20〜50時間である。
このようにして得られた培養物からグルコースデヒド
ロゲナーゼを採取する。採取方法は、例えばまず得られ
た培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を
分離し、次いで分離した菌体を超音波処理，フレンチプ
レス処理もしくはガラスビーズを用いる機械的破壊，ま
たは有機溶媒を用いた自己消化などで破壊し、次に遠心
分離によってグルコースデヒドロゲナーゼを含む粗酵素
液を得る。次いで、この粗酵素液を50℃に10〜30分間加
温し直ちに遠心分離し上清を回収する。さらにDEAE−セ
ルロース,DEAE−セファデックスＡ−25,DEAE−セファロ
ース,CM−セルロース,CMセファデックスＣ−25,CM−セ
ファロースCL−6Bなどのイオン交換クロマトグラフィー
を行った後、ハイドロキシル アパタイト クロマトグ
ラフィーを行って精製すればよい。必要に応じて凍結乾
燥する。
ロゲナーゼを採取する。採取方法は、例えばまず得られ
た培養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を
分離し、次いで分離した菌体を超音波処理，フレンチプ
レス処理もしくはガラスビーズを用いる機械的破壊，ま
たは有機溶媒を用いた自己消化などで破壊し、次に遠心
分離によってグルコースデヒドロゲナーゼを含む粗酵素
液を得る。次いで、この粗酵素液を50℃に10〜30分間加
温し直ちに遠心分離し上清を回収する。さらにDEAE−セ
ルロース,DEAE−セファデックスＡ−25,DEAE−セファロ
ース,CM−セルロース,CMセファデックスＣ−25,CM−セ
ファロースCL−6Bなどのイオン交換クロマトグラフィー
を行った後、ハイドロキシル アパタイト クロマトグ
ラフィーを行って精製すればよい。必要に応じて凍結乾
燥する。
（実施例） 実施例１ クリプトコッカス ユニゲトラータスY0033によるグル
コースデヒドロゲナーゼの製造 （ｉ）粉末酵母エキス0.5％，牛肉エキス1.0％，グルコ
ース1.0％,KH2PO4 0.15％,CaCl2・2H2O 0.033％,MgSO4
・7H2O 0.05％,Nacl 0.2％からなる培地100ml（500ml容
三角フラスコ）にクリプトコッカス ユニグトラータス
Y0033を１白金耳移植後、30℃で50時間振盪培養を行っ
た。培養液を4500r.p.m.10分間の遠心分離にかけ菌体を
得た。菌体を10mlの10mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁
後ブラウンのホモゲナイザーで菌体を破砕し15000r.p.
m.10分間の遠心分離で菌体残滓を除去し粗酵素液10mlを
得た（0.6単位/ml）。
コースデヒドロゲナーゼの製造 （ｉ）粉末酵母エキス0.5％，牛肉エキス1.0％，グルコ
ース1.0％,KH2PO4 0.15％,CaCl2・2H2O 0.033％,MgSO4
・7H2O 0.05％,Nacl 0.2％からなる培地100ml（500ml容
三角フラスコ）にクリプトコッカス ユニグトラータス
Y0033を１白金耳移植後、30℃で50時間振盪培養を行っ
た。培養液を4500r.p.m.10分間の遠心分離にかけ菌体を
得た。菌体を10mlの10mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁
後ブラウンのホモゲナイザーで菌体を破砕し15000r.p.
m.10分間の遠心分離で菌体残滓を除去し粗酵素液10mlを
得た（0.6単位/ml）。
（ii）粉末酵母エキス0.5％，カザミノ酸1.0％，スクロ
ース２％,KH2PO4 0.15％,CaCl2・2H2o 0.033％,MgSO4・
7H2O 0.05％,NaCl 0.2％からなる培地100mlにクリプト
コッカスユニグトラータスY0033を１白金耳移植後30℃
で50時間振盪培養を行った。上記（ｉ）と同様にして粗
酵素液10mlを得た（14単位/ml）。
ース２％,KH2PO4 0.15％,CaCl2・2H2o 0.033％,MgSO4・
7H2O 0.05％,NaCl 0.2％からなる培地100mlにクリプト
コッカスユニグトラータスY0033を１白金耳移植後30℃
で50時間振盪培養を行った。上記（ｉ）と同様にして粗
酵素液10mlを得た（14単位/ml）。
（iii）ミースト0.5％，カツオエキス1.0％，マルトー
ス１％,KH2PO4 0.15％,CaCl2・2H2O 0.033％,MgSO4・7H
2O 0.05％,NaCl 0.2％からなる培地 100mlにクリプトコッカスユニグトラータスY0033を１
白金耳移植後、30℃で50時間振盪培養を行った。実施例
１と同様にして粗酵素10mlを得た（６単位/ml）。
ス１％,KH2PO4 0.15％,CaCl2・2H2O 0.033％,MgSO4・7H
2O 0.05％,NaCl 0.2％からなる培地 100mlにクリプトコッカスユニグトラータスY0033を１
白金耳移植後、30℃で50時間振盪培養を行った。実施例
１と同様にして粗酵素10mlを得た（６単位/ml）。
（iv）上記（ii）に示した方法で培養液1050mlから得ら
れた粗酵素液150mlを50℃で15分間加温し、4500r.p.m.1
0分間の遠心分離で上清を得、これをDEAEセファロースC
L−6Bカラム（4.8×4cm）に通して酵素を吸着させ、0.1
MKCl 100ml,0.2MKCl 100ml,0.3MKCl 100mlを流した。0.
3MKCl 75mlでグルコースデヒドロゲナーゼは溶出した。
酵素液をアミコン社のダイアフローメンブランを用いて
脱塩し、次いでこれをシグマ社のハイドロキシルアパタ
イトカラム（4.8×1cm）に通して酵素を吸着させ、0.1M
リン酸緩衝液（pH7.0）50ml0.2Mリン酸緩衝液50ml,0.3M
リン酸緩衝液50mlを流した。0.3Mリン酸緩衝液20mlでグ
ルコースデヒドロゲナーゼは溶出し、23.6単位/mlの活
性を有する酵素液20mlが得られた。
れた粗酵素液150mlを50℃で15分間加温し、4500r.p.m.1
0分間の遠心分離で上清を得、これをDEAEセファロースC
L−6Bカラム（4.8×4cm）に通して酵素を吸着させ、0.1
MKCl 100ml,0.2MKCl 100ml,0.3MKCl 100mlを流した。0.
3MKCl 75mlでグルコースデヒドロゲナーゼは溶出した。
酵素液をアミコン社のダイアフローメンブランを用いて
脱塩し、次いでこれをシグマ社のハイドロキシルアパタ
イトカラム（4.8×1cm）に通して酵素を吸着させ、0.1M
リン酸緩衝液（pH7.0）50ml0.2Mリン酸緩衝液50ml,0.3M
リン酸緩衝液50mlを流した。0.3Mリン酸緩衝液20mlでグ
ルコースデヒドロゲナーゼは溶出し、23.6単位/mlの活
性を有する酵素液20mlが得られた。
得られたグルコースデヒドロゲナーゼは次の理化学的
性質を有するものであった。
性質を有するものであった。
酵素作用 下記式に示すように、グルコースおよびNADPからグル
コノ−δ−ラクトンおよび還元型NADPを生成する反応を
触媒する。
コノ−δ−ラクトンおよび還元型NADPを生成する反応を
触媒する。
pH安定性 １単位/ml（40mMの緩衝液）で53℃10分間処理後の残
存活性を測定した。第１図に示すようにpH6.0〜7.5で安
定である。
存活性を測定した。第１図に示すようにpH6.0〜7.5で安
定である。
はジメチルグルタル酸， はリン酸， はトリス塩酸緩衝液を表わす（記号は第２図以下同
じ）。
じ）。
至適pH 第２図に示すとおりであり、pH6〜８に至適pHを有す
る。
る。
は酢酸緩衝液を表わす。
熱安定性 １単位/mlの酵素溶液（40mMリン酸緩衝液pH6.0）を各
温度で10分間処理後、残存活性を測定した。第３図に示
すように50℃まで安定である。
温度で10分間処理後、残存活性を測定した。第３図に示
すように50℃まで安定である。
至適温度 第４図に示すとおりであり、55℃付近に至適温度を有
する。
する。
分子量 11×104±11000（Sephacryl Ｓ−200 superfineに
よる値） 等電点 pH4.9±0.5 Km値 約2.6×10-3±2.6×10-4M（グルコース，トリス−塩
酸緩衝液pH7.5） 約4.2×10-6±4.2×10-7M（NADP,トリス−塩酸緩衝液
pH7.5） 金属イオン界面活性剤の影響 第１表に示すとおりである。
よる値） 等電点 pH4.9±0.5 Km値 約2.6×10-3±2.6×10-4M（グルコース，トリス−塩
酸緩衝液pH7.5） 約4.2×10-6±4.2×10-7M（NADP,トリス−塩酸緩衝液
pH7.5） 金属イオン界面活性剤の影響 第１表に示すとおりである。
基質特異性 第２表に示すとおりである。基質50mM,酵素0.005Uの
反応時間10分間。
反応時間10分間。
なお、上記において、酵素活性および残存活性は次の
酵素活性測定法により求めた。
酵素活性測定法により求めた。
酵素活性測定法 0.2M トリス−塩酸緩衝液（pH7.5） 0.4 10mM NADP 0.05 10％ Triton X−100 0.01 0.5M グルコース 0.1 精製水 0.44 1.0 上記組成の反応液1.0mlを37℃で２〜３分間予備加熱
した後、20μの酵素溶液を加えて反応を開始し、37℃
で10分間反応を行う。0.1N塩酸溶液2mlを添加して反応
を止め、340nmの吸光度を測定した。酵素１単位は１分
間に１μmolの還元型NADPを生成する活性とした。
した後、20μの酵素溶液を加えて反応を開始し、37℃
で10分間反応を行う。0.1N塩酸溶液2mlを添加して反応
を止め、340nmの吸光度を測定した。酵素１単位は１分
間に１μmolの還元型NADPを生成する活性とした。
実施例２ カンジダ サケ Y0192によるグルコースデヒドロゲナ
ーゼの製造 （ｉ）カンジダ サケ Y0192を実施例１の（ｉ）と同
様に培養し粗酵素液10mlを得た（0.1単位/ml）。
ーゼの製造 （ｉ）カンジダ サケ Y0192を実施例１の（ｉ）と同
様に培養し粗酵素液10mlを得た（0.1単位/ml）。
（ii）カンジダ サケを実施例１の（ii）と同様に培養
し、粗酵素液10mlを得た（2.5単位/ml）。
し、粗酵素液10mlを得た（2.5単位/ml）。
（iii）カンジダ サケを実施例１の（iii）と同様に培
養し粗酵素液10mlを得た（0.7単位/ml）。
養し粗酵素液10mlを得た（0.7単位/ml）。
（iv）上記（ii）に示した方法で培養液2000mlから得ら
れた粗酵素液200mlを4500r.p.m.10分間の遠心分離によ
り上清を得、これをDEAEセファロースCL−6Bカラム（4.
8×5cm）に通して酵素を吸着させ、実施例１の（iv）と
同様の方法により処理した。0.3MKCl 100mlでグルコー
スデヒドロゲナーゼは溶出した。酵素液を実施例１の
（iv）と同様にして脱塩し、ハイドロキシルアパタイト
カラム（4.8×1cm）に通して酵素を吸着させ、実施例１
の（iv）と同様にして3.1単位/mlの活性を有する酵素液
20mlを得た。
れた粗酵素液200mlを4500r.p.m.10分間の遠心分離によ
り上清を得、これをDEAEセファロースCL−6Bカラム（4.
8×5cm）に通して酵素を吸着させ、実施例１の（iv）と
同様の方法により処理した。0.3MKCl 100mlでグルコー
スデヒドロゲナーゼは溶出した。酵素液を実施例１の
（iv）と同様にして脱塩し、ハイドロキシルアパタイト
カラム（4.8×1cm）に通して酵素を吸着させ、実施例１
の（iv）と同様にして3.1単位/mlの活性を有する酵素液
20mlを得た。
得られたグルコースデヒドロゲナーゼは次の理化学的
性質を有するものであった。
性質を有するものであった。
酵素作用 下記式に示すように、グルコースおよびNADPからグル
クロン酸および還元型NADPを生成する反応を触媒する。
またNADPの代りにNADを用いても、同一反応を触媒す
る。
クロン酸および還元型NADPを生成する反応を触媒する。
またNADPの代りにNADを用いても、同一反応を触媒す
る。
pH安定性 １単位/ml（40mMの緩衝液）で50℃15分間処理後の残
存活性を測定した。第５図に示すようにpH6.0〜6.5で安
定である。
存活性を測定した。第５図に示すようにpH6.0〜6.5で安
定である。
至適pH 第６図に示すとおりである。pH6.0〜7.0に至適pHを有
する。
する。
熱安定性 第７図に示すように45℃まで安定である。
至適温度 第８図に示すとおりであり35℃付近に至適温度を有す
る。
る。
分子量 11.5×104付近（Sephacryl Ｓ−200 super fineに
よる値） 等電点 pH4.6付近 Km値 約32.5×10-3M（グルコース，トリス−塩酸緩衝液pH
7.5） 約3.74×10-3M（NAD,トリス−塩酸緩衝液pH7.5） 金属イオン．界面活性剤の影響 第３表に示す通りである。
よる値） 等電点 pH4.6付近 Km値 約32.5×10-3M（グルコース，トリス−塩酸緩衝液pH
7.5） 約3.74×10-3M（NAD,トリス−塩酸緩衝液pH7.5） 金属イオン．界面活性剤の影響 第３表に示す通りである。
基質特異性 第４表に示すとおりである。
なお上記において、酵素活性は次の酵素活性測定法に
より求めた。
より求めた。
酵素活性測定法 0.2M トリス−塩酸緩衝液（pH7.5） 0.40 10mM NAD 0.05 10％ Triton Ｘ−100 0.01 0.5M グルコース 0.1 精製水 0.44 1.0 前記組成の反応液1.0mlを37℃で２〜３分間予備加熱
した後、20μの酵素溶液を加えて反応を開始し、37℃
で10分間反応を行う。0.1N塩酸溶液2mlを添加して反応
を止め、340nmの吸光度を測定した。酵素１単位は１分
間に１μmolの還元型NADを生成する活性とした。
した後、20μの酵素溶液を加えて反応を開始し、37℃
で10分間反応を行う。0.1N塩酸溶液2mlを添加して反応
を止め、340nmの吸光度を測定した。酵素１単位は１分
間に１μmolの還元型NADを生成する活性とした。
実施例３〜５ 以上、クリプトコッカス属およびカンジダ属に属する
グルコースデヒドロゲナーゼ生産菌による方法について
詳細に示したが、デバリオマイセス属，ハンセヌラ属ま
たはピチア属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産
菌を用いる場合も、上記実施例と同様である。これら３
種のグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌の場合について
次に示す。
グルコースデヒドロゲナーゼ生産菌による方法について
詳細に示したが、デバリオマイセス属，ハンセヌラ属ま
たはピチア属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産
菌を用いる場合も、上記実施例と同様である。これら３
種のグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌の場合について
次に示す。
ただし使用した酵母は 実施例３…デバリオマイセス ハンセニイ HUT 7012 実施例４…ハンセヌラ アノマラ HUT 7083 実施例５…ピチア ボビス ATCC 24208 であり、実施例１の（iv）の方法で酵素を製造した。
得られた酵素の理化学的性質および各酵素の培養力価
（実施例１の（ii）の培地を用いた）を次に示す。
（実施例１の（ii）の培地を用いた）を次に示す。
酵素作用 実施例3,実施例４および実施例５のいずれの酵素も、
カンジダ サケY0192における酵素作用と同一反応を触
媒する。
カンジダ サケY0192における酵素作用と同一反応を触
媒する。
Km値 実施例３ 約7.10×10-2M 実施例４ 約3.07×10-2M 実施例５ 約5.48×10-2M 培養力価 D.hansenii HUT 7012 0.01u/ml H.anomala HUT 7083 0.03u/ml P.bovis HUT 7311 0.01u/ml pH安定性 実施例３…第９図に示す。
実施例４…第11図に示す。
実施例５…第13図に示す。
至適pH 実施例３…第10図に示す。
実施例４…第12図に示す。
実施例５…第14図に示す。
［発明の効果］ 本発明は新規なグルコースデヒドロゲナーゼの製造方
法を提供するものである。
法を提供するものである。
本発明の製造方法のうち、特にクロプトコッカス属に
属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌により製造し
たグロコースデヒドロゲナーゼはKm値が低く（2.6×10
-3M）、これは例えば従来の製造法によるグルコースデ
ヒドロゲナーゼが２×10-2M（バチルス セレウスによ
る場合、メソッド イン エンチモロジー Method in
Enzymology 9 106参照）かあるいはそれ以上であるのに
対し、約10倍の活性を有するもので、特に良好な酵素で
ある。。
属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌により製造し
たグロコースデヒドロゲナーゼはKm値が低く（2.6×10
-3M）、これは例えば従来の製造法によるグルコースデ
ヒドロゲナーゼが２×10-2M（バチルス セレウスによ
る場合、メソッド イン エンチモロジー Method in
Enzymology 9 106参照）かあるいはそれ以上であるのに
対し、約10倍の活性を有するもので、特に良好な酵素で
ある。。
第１図，第２図，第３図および第４図はそれぞれクリプ
トコッカス ユニグトラータス Y0033により製造した
グルコースデヒドロゲナーゼのpH安定性，至適pH,熱安
定性および至適温度を表わすグラフ、第５図，第６図，
第７図および第８図はそれぞれカンジダ サケ Y0192
により製造したグルコースデヒドロゲナーゼのpH安定
性，至適pH,熱安定性および至適温度を表わすグラフ、
第９図および第10図はそれぞれデバリオマイセス ハン
セニイ HUT7012により製造したグルコースデヒドロゲ
ナーゼのpH安定性および至適pHを表わすグラフ、第11図
および第12図はハンセヌラ アノマラ HUT7083により
製造したグルコースデヒドロゲナーゼのpH安定性および
至適pHを表わすグラフ、第13図および第14図はそれぞれ
ピチア ボビス ATCC 24208により製造したグルコース
デヒドロゲナーゼのpH安定性および至適pHを表わすグラ
フである。
トコッカス ユニグトラータス Y0033により製造した
グルコースデヒドロゲナーゼのpH安定性，至適pH,熱安
定性および至適温度を表わすグラフ、第５図，第６図，
第７図および第８図はそれぞれカンジダ サケ Y0192
により製造したグルコースデヒドロゲナーゼのpH安定
性，至適pH,熱安定性および至適温度を表わすグラフ、
第９図および第10図はそれぞれデバリオマイセス ハン
セニイ HUT7012により製造したグルコースデヒドロゲ
ナーゼのpH安定性および至適pHを表わすグラフ、第11図
および第12図はハンセヌラ アノマラ HUT7083により
製造したグルコースデヒドロゲナーゼのpH安定性および
至適pHを表わすグラフ、第13図および第14図はそれぞれ
ピチア ボビス ATCC 24208により製造したグルコース
デヒドロゲナーゼのpH安定性および至適pHを表わすグラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:72）
Claims (6)
- 【請求項１】クリプトコッカス（Cryptococcus）属，カ
ンジダ（Candida）属，デバリオマイセス（Debariomyce
s）属，ハンセヌラ（Hansenula）属またはピチア（Pich
ia）属に属するグルコースデヒドロゲナーゼ生産菌を培
地に培養し、その培養物から、グルコースおよびNADPか
らグルコーノ−δ−ラクトンおよび還元型NADPを生成す
る反応を触媒するグルコースデヒドロゲナーゼを採取す
ることを特徴とするグルコースデヒドロゲナーゼの製造
方法。 - 【請求項２】クルプトコッカス属に属するグルコースデ
ヒドロゲナーゼ生産菌がクリプトコッカス ユニグトラ
ータス（Cryptococcus uniguttulatus）Y0033（微工研
条寄第1352号）である特許請求の範囲第１項記載のグル
コースデヒドロゲナーゼの製造方法。 - 【請求項３】カンジダ属に属するグルコースデヒドロゲ
ナーゼ生産菌がカンジダ サケ（Candida sake）Y0192
（微工研菌寄第8710号）である特許請求の範囲第１項記
載のグルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。 - 【請求項４】デバリオマイセス属に属するグルコースデ
ヒドロゲナーゼ生産菌がデバリオマイセス ハンセニイ
（Debariomyces hansenii）HUT 7012（微工研菌寄第871
1号）である特許請求の範囲第１項記載のグルコースデ
ヒドロゲナーゼの製造方法。 - 【請求項５】ハンセヌラ属に属するグルコースデヒドロ
ゲナーゼ生産菌がハンセヌラ アノマラ（Hansenula an
omala）HUT 7083（微工研菌寄第8712号）である特許請
求の範囲第１項記載のグルコースデヒドロゲナーゼの製
造方法。 - 【請求項６】ピチア属に属するグルコースデヒドロゲナ
ーゼ生産菌がピチア ボビス（Pichia bovis）ATCC 242
08である特許請求の範囲第１項記載のグルコースデヒド
ロゲナーゼの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/042,655 US4877733A (en) | 1986-05-02 | 1987-04-28 | Glucose dehydrogenase and its production |
| IT20338/87A IT1204549B (it) | 1986-05-02 | 1987-04-30 | Glucosio deidrogenasi e sua produzione |
| FR878706182A FR2598156B1 (fr) | 1986-05-02 | 1987-04-30 | Glucose deshydrogenase et son procede de production |
| DE3714544A DE3714544C2 (de) | 1986-05-02 | 1987-04-30 | Glucosedehydrogenase und Verfahren zu deren Herstellung |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10118386 | 1986-05-02 | ||
| JP61-101183 | 1986-05-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63109773A JPS63109773A (ja) | 1988-05-14 |
| JP2566943B2 true JP2566943B2 (ja) | 1996-12-25 |
Family
ID=14293875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62058874A Expired - Lifetime JP2566943B2 (ja) | 1986-05-02 | 1987-03-16 | グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2566943B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK2202303T3 (en) | 2007-09-26 | 2017-02-06 | Kaneka Corp | NEW GLUCOSEDE HYDROGENASE |
-
1987
- 1987-03-16 JP JP62058874A patent/JP2566943B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 84TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY=1984 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63109773A (ja) | 1988-05-14 |
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