JP3086301B2 - Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素 - Google Patents
Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
Description
【０００１】本発明は、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン
からＬ−アスコルビン酸を微生物学的に製造する新規な
方法、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンの微生物学的酸化
に対応する酵素の製造法、およびＬ−グロノ−ガンマ−
ラクトン脱水素酵素である精製された状態の酵素に関す
る。
からＬ−アスコルビン酸を微生物学的に製造する新規な
方法、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンの微生物学的酸化
に対応する酵素の製造法、およびＬ−グロノ−ガンマ−
ラクトン脱水素酵素である精製された状態の酵素に関す
る。
【０００２】前記したように、本発明によって提供され
る新規なＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素（以
後、ＧＬＤＨと称する）は、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラク
トンからＬ−アスコルビン酸への酸化を触媒する。
る新規なＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素（以
後、ＧＬＤＨと称する）は、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラク
トンからＬ−アスコルビン酸への酸化を触媒する。
【０００３】Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン（Ｉ）のＬ
−アスコルビン酸（ＩＩ）への酸化を触媒する酵素は知
られている。
−アスコルビン酸（ＩＩ）への酸化を触媒する酵素は知
られている。
【化１】 錦見らは、ラットの肝臓（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙ．，１７５，４２７−４３５，１９７
６）、ヤギの肝臓（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙ．，１７５，４２７−４３５，１９７６）及びニ
ワトリの腎臓（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１，５０
７６−５０８２，１９８２）からＬ−グロノ−ガンマ−
ラクトン酸化酵素を単離した。これらの酵素は、Ｉから
ＩＩへの酸化において直接電子の受容体として酸素分子
を利用するが、本発明により提供されるＧＬＤＨはそれ
を利用しない。さらに、それらは、いずれも単一のユニ
ットから構成されているが、本発明で提供されるＧＬＤ
Ｈは、３種類のサブユニットから構成されている。ま
た、錦見らはパン酵母（ｂａｋｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ）
からＬ−ガラクトノ−ガンマ−ラクトン酸化酵素を単離
した（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．，１
９１，４７９−４８６，１９７８）。この酵素は、Ｌ−
ガラクトノ−ガンマ−ラクトン及びＬ−グロノ−ガンマ
−ラクトン両者の、Ｌ−アスコルビン酸への酸化を触媒
する。他方、Ｂｌｅｅｇらは、サッカロミセスセレヴィ
シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）からＬ−ガラクトノ−ガンマ−ラクトン酸化酵素
を単離した（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２７，
３９１−３９６，１９８２）。この酵素は、Ｌ−ガラク
トノ−ガンマ−ラクトンに対して活性を示す事が報告さ
れているが、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンに対しては
活性を示さない。しかし、本発明で提供されるＧＬＤＨ
は、基質としてＬ−ガラクトノ−ガンマ−ラクトンを利
用できない。
Ｂｉｏｐｈｙ．，１７５，４２７−４３５，１９７
６）、ヤギの肝臓（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙ．，１７５，４２７−４３５，１９７６）及びニ
ワトリの腎臓（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１，５０
７６−５０８２，１９８２）からＬ−グロノ−ガンマ−
ラクトン酸化酵素を単離した。これらの酵素は、Ｉから
ＩＩへの酸化において直接電子の受容体として酸素分子
を利用するが、本発明により提供されるＧＬＤＨはそれ
を利用しない。さらに、それらは、いずれも単一のユニ
ットから構成されているが、本発明で提供されるＧＬＤ
Ｈは、３種類のサブユニットから構成されている。ま
た、錦見らはパン酵母（ｂａｋｅｒ’ｓ ｙｅａｓｔ）
からＬ−ガラクトノ−ガンマ−ラクトン酸化酵素を単離
した（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．，１
９１，４７９−４８６，１９７８）。この酵素は、Ｌ−
ガラクトノ−ガンマ−ラクトン及びＬ−グロノ−ガンマ
−ラクトン両者の、Ｌ−アスコルビン酸への酸化を触媒
する。他方、Ｂｌｅｅｇらは、サッカロミセスセレヴィ
シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）からＬ−ガラクトノ−ガンマ−ラクトン酸化酵素
を単離した（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２７，
３９１−３９６，１９８２）。この酵素は、Ｌ−ガラク
トノ−ガンマ−ラクトンに対して活性を示す事が報告さ
れているが、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンに対しては
活性を示さない。しかし、本発明で提供されるＧＬＤＨ
は、基質としてＬ−ガラクトノ−ガンマ−ラクトンを利
用できない。
【０００４】このように本発明で提供されるＧＬＤＨ
は、その基質特異性において酵母のＬ−ガラクトノ−ガ
ンマ−ラクトン酸化酵素とは明らかに異なる。他方、重
岡らは、ユーグレナ ガラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇ
ｒａｃｉｌｉｓ）Ｚ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，４３，２１８７−２１８８，１９７９）の粗精の
Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素、すなわちＬ
−グロノ−ガンマ−ラクトンとＬ−ガラクトノ−ガンマ
−ラクトンの両者の酸化を触媒し、電子受容体として酸
素を利用しない酵素の特徴を報告した。さらに藻類は、
それらの微生物の生育に対して遭遇する問題点（こわれ
やすさ、細胞分裂及び長期間を要することを含む）によ
って取扱うことが難しいことがよく知られている。
は、その基質特異性において酵母のＬ−ガラクトノ−ガ
ンマ−ラクトン酸化酵素とは明らかに異なる。他方、重
岡らは、ユーグレナ ガラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇ
ｒａｃｉｌｉｓ）Ｚ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，４３，２１８７−２１８８，１９７９）の粗精の
Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素、すなわちＬ
−グロノ−ガンマ−ラクトンとＬ−ガラクトノ−ガンマ
−ラクトンの両者の酸化を触媒し、電子受容体として酸
素を利用しない酵素の特徴を報告した。さらに藻類は、
それらの微生物の生育に対して遭遇する問題点（こわれ
やすさ、細胞分裂及び長期間を要することを含む）によ
って取扱うことが難しいことがよく知られている。
【０００５】本発明で提供される新規なＧＬＤＨは、そ
の基質特異性の点で明らかにそれとは異なる。加うる
に、ユーグレナ グラシリスＺのＬ−グロノ−ガンマ−
ラクトン脱水素酵素の単離に関して、現在まで報告はな
い。
の基質特異性の点で明らかにそれとは異なる。加うる
に、ユーグレナ グラシリスＺのＬ−グロノ−ガンマ−
ラクトン脱水素酵素の単離に関して、現在まで報告はな
い。
【０００６】バクテリアを用いることによるＬ−グロノ
−ガンマ−ラクトンからＬ−アスコルビン酸への変換
は、現在まで報告されていない。しかし、本発明によれ
ば、バクテリアがＬ−グロノ−ガンマ−ラクトンからＬ
−アスコルビン酸を生産しうることが見出された。この
ことは、バクテリアを利用することによるＬ−グロノ−
ガンマ−ラクトンからＬ−アスコルビン酸の生産を、初
めて可能にする。
−ガンマ−ラクトンからＬ−アスコルビン酸への変換
は、現在まで報告されていない。しかし、本発明によれ
ば、バクテリアがＬ−グロノ−ガンマ−ラクトンからＬ
−アスコルビン酸を生産しうることが見出された。この
ことは、バクテリアを利用することによるＬ−グロノ−
ガンマ−ラクトンからＬ−アスコルビン酸の生産を、初
めて可能にする。
【０００７】上述したような、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラ
クトンをＬ−アスコルビン酸に酸化する脱水素酵素活性
を有する例えばバクテリア由来の精製酵素の開示は存在
しない。即ち、特定の微生物のバクテリア細胞の可容性
画分から単離した精製酵素がＬ−グロノ−ガンマ−ラク
トンのＬ−アスコルビン酸への酸化を触媒するというこ
とを発見し、本発明はこの発見に基いてなされたもので
ある。
クトンをＬ−アスコルビン酸に酸化する脱水素酵素活性
を有する例えばバクテリア由来の精製酵素の開示は存在
しない。即ち、特定の微生物のバクテリア細胞の可容性
画分から単離した精製酵素がＬ−グロノ−ガンマ−ラク
トンのＬ−アスコルビン酸への酸化を触媒するというこ
とを発見し、本発明はこの発見に基いてなされたもので
ある。
【０００８】指摘したように、本発明の目的の１つは、
Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンに作用してＬ−アスコル
ビン酸を生産する新規なＧＬＤＨを提供するものであ
る。本発明のもう１つの目的は、細胞内に新規なＧＬＤ
Ｈを生産しうる微生物、例えば、グルコノバクター属に
属する微生物又はその突然変異株を培養し、細胞を破壊
し、破壊した細胞の無細胞抽出液、好ましくは微生物の
可溶性画分から単離、精製することを特徴とする、新規
なＧＬＤＨの製造法を提供することにある。また、本発
明の他の目的は前記の酵素を利用するＬ−アスコルビン
酸の製造法を提供することにある。さらに本発明の目的
はバクテリアを用いた発酵法によるＬ−アスコルビン酸
の製造法を提供することにある。また、本発明の別の目
的は、前記した酵素活性を有する微生物を提供すること
にある。これらの目的は以下の記載からより明らかにな
る。
Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンに作用してＬ−アスコル
ビン酸を生産する新規なＧＬＤＨを提供するものであ
る。本発明のもう１つの目的は、細胞内に新規なＧＬＤ
Ｈを生産しうる微生物、例えば、グルコノバクター属に
属する微生物又はその突然変異株を培養し、細胞を破壊
し、破壊した細胞の無細胞抽出液、好ましくは微生物の
可溶性画分から単離、精製することを特徴とする、新規
なＧＬＤＨの製造法を提供することにある。また、本発
明の他の目的は前記の酵素を利用するＬ−アスコルビン
酸の製造法を提供することにある。さらに本発明の目的
はバクテリアを用いた発酵法によるＬ−アスコルビン酸
の製造法を提供することにある。また、本発明の別の目
的は、前記した酵素活性を有する微生物を提供すること
にある。これらの目的は以下の記載からより明らかにな
る。
【０００９】後記に例示した精製された新規なＧＬＤＨ
の物理化学的諸性質は、次の通りである：
の物理化学的諸性質は、次の通りである：
【００１０】１）酵素活性：本発明の新規なＧＬＤＨ
は、以下に示す反応に従って電子受容体の存在下、Ｌ−
グロノ−ガンマ−ラクトンのＬ−アスコルビン酸への酸
化を触媒する：
は、以下に示す反応に従って電子受容体の存在下、Ｌ−
グロノ−ガンマ−ラクトンのＬ−アスコルビン酸への酸
化を触媒する：
【００１１】該酵素は、電子受容体として酸素を利用し
ない。これは、上記の電子受容体として、酸素を用いた
時、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンをＬ−アスコルビン
酸に変換する酵素の触媒活性が認められなかった事によ
り、確認した。さらに、酸素電極によって検知される酸
素消費は、反応混合液中において見出されなかった。し
かし、電子受容体として作用する能力を有する従来のど
の化合物も、本発明の酵素に関連して用いることができ
る。そのような電子受容体として、補酵素又はそのよう
な補酵素作用を示す化合物、例えば、２，６−ジクロロ
フェノールインドフェノール（以後、ＤＣＩＰと称す
る）、フェナジンメト硫酸、ウルスターブルー、フェリ
シアニド、補酵素Ｑ、チトクロームＣなどを用いること
ができる。
ない。これは、上記の電子受容体として、酸素を用いた
時、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンをＬ−アスコルビン
酸に変換する酵素の触媒活性が認められなかった事によ
り、確認した。さらに、酸素電極によって検知される酸
素消費は、反応混合液中において見出されなかった。し
かし、電子受容体として作用する能力を有する従来のど
の化合物も、本発明の酵素に関連して用いることができ
る。そのような電子受容体として、補酵素又はそのよう
な補酵素作用を示す化合物、例えば、２，６−ジクロロ
フェノールインドフェノール（以後、ＤＣＩＰと称す
る）、フェナジンメト硫酸、ウルスターブルー、フェリ
シアニド、補酵素Ｑ、チトクロームＣなどを用いること
ができる。
【００１２】酵素活性の測定は、６００ｎｍにおけるＤ
ＣＩＰの吸光度の減少を２５℃で分光光度測定的に測定
することで行なった。酵素活性は、１分間当り、１μＭ
のＤＣＩＰを還元するに要する酵素量を１単位と定義し
た。ｐＨ７．０におけるＤＣＩＰの吸光係数は、１４．
５ｍＭ-1とした。１ｃｍ光路のセルは最終容積０．５ｍ
ｌ中に０．１６ｍＭ ＤＣＩＰ、１．６ｍＭフェナジン
メト硫酸、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、４００ｍ
Ｍ Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンと、酵素溶液及び水
を含む。対照用セルは、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン
を除く上記全ての成分を含む。反応は、Ｌ−グロノ−ガ
ンマ−ラクトンの添加によって開始した。酵素活性は、
ＤＣＩＰの初期還元速度として測定した。
ＣＩＰの吸光度の減少を２５℃で分光光度測定的に測定
することで行なった。酵素活性は、１分間当り、１μＭ
のＤＣＩＰを還元するに要する酵素量を１単位と定義し
た。ｐＨ７．０におけるＤＣＩＰの吸光係数は、１４．
５ｍＭ-1とした。１ｃｍ光路のセルは最終容積０．５ｍ
ｌ中に０．１６ｍＭ ＤＣＩＰ、１．６ｍＭフェナジン
メト硫酸、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、４００ｍ
Ｍ Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンと、酵素溶液及び水
を含む。対照用セルは、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン
を除く上記全ての成分を含む。反応は、Ｌ−グロノ−ガ
ンマ−ラクトンの添加によって開始した。酵素活性は、
ＤＣＩＰの初期還元速度として測定した。
【００１３】２）基質特異性：酵素の基質特異性は、Ｌ
−グロノ−ガンマ−ラクトンの代わりに各種の基質溶液
（４００ｍモル）を用いた以外前記したと同様な酵素活
性測定法を用いて測定した。測定結果を表１に示す。Ｇ
ＬＤＨは、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン及びＤ−キシ
ロースに強く作用し、Ｄ−グロノ−ガンマ−ラクトン、
Ｄ−グルコース及びＤ−マンノースに弱く作用する。
−グロノ−ガンマ−ラクトンの代わりに各種の基質溶液
（４００ｍモル）を用いた以外前記したと同様な酵素活
性測定法を用いて測定した。測定結果を表１に示す。Ｇ
ＬＤＨは、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン及びＤ−キシ
ロースに強く作用し、Ｄ−グロノ−ガンマ−ラクトン、
Ｄ−グルコース及びＤ−マンノースに弱く作用する。
【００１４】３）至適ｐＨ：ＧＬＤＨの反応速度と反応
液中のｐＨとの相関関係は、各種ｐＨ緩衝液を用いた以
外１）に述べたと同様の酵素測定法を用いて調べた。結
果を表２に示す。該酵素は、７．０から８．０のｐＨの
範囲で最も高い酵素活性を示した。
液中のｐＨとの相関関係は、各種ｐＨ緩衝液を用いた以
外１）に述べたと同様の酵素測定法を用いて調べた。結
果を表２に示す。該酵素は、７．０から８．０のｐＨの
範囲で最も高い酵素活性を示した。
【００１５】４）ｐＨ安定性：精製酵素を、４℃、各種
ｐＨ緩衝液中に１９２時間放置した。残存酵素活性は、
１）に記載したのと同様な酵素測定法を用いて測定し
た。測定結果を表３に示す。精製酵素は、ｐＨ６．５か
ら９．２の範囲のいかなるｐＨにおいても比較的安定で
あった。
ｐＨ緩衝液中に１９２時間放置した。残存酵素活性は、
１）に記載したのと同様な酵素測定法を用いて測定し
た。測定結果を表３に示す。精製酵素は、ｐＨ６．５か
ら９．２の範囲のいかなるｐＨにおいても比較的安定で
あった。
【００１６】５） 熱安定性：精製酵素を、２００ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、各種の温度で
５分間処理し、次いで冷水で急速に冷却した。残存酵素
活性を１）に記載したのと同様の酵素測定方法を用いて
測定した。この結果を表４に示す。精製酵素は、３０℃
まで安定であり、５５℃および６０℃における処理後の
活性は、それぞれ約５０％、及び８０％失活した。
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、各種の温度で
５分間処理し、次いで冷水で急速に冷却した。残存酵素
活性を１）に記載したのと同様の酵素測定方法を用いて
測定した。この結果を表４に示す。精製酵素は、３０℃
まで安定であり、５５℃および６０℃における処理後の
活性は、それぞれ約５０％、及び８０％失活した。
【００１７】６） 至適温度：ＧＬＤＨの酵素活性を
１）に記載したのと同様の酵素測定方法を用いて２５℃
から５５℃の温度で測定した。結果を表５に示す。測定
範囲内では本酵素は明瞭な至適温度をもたなかった。
１）に記載したのと同様の酵素測定方法を用いて２５℃
から５５℃の温度で測定した。結果を表５に示す。測定
範囲内では本酵素は明瞭な至適温度をもたなかった。
【００１８】７） 分子量：ＧＬＤＨの分子量を、３０
０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した大きさ排除型（ｓｉ
ｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）ゲルカラム（ＴＳＫ ｇｅ
ｌ Ｇ３０００ ＳＷ×Ｌカラム、７．８ｍｍ×３０ｃ
ｍ）を用い、高速液体クロマトグラフィーで測定した。
分子量の標準としてシアノコバラミン（Ｍ．Ｗ．１，３
５０）、ミオグロビン（Ｍ．Ｗ．１７，０００）、卵白
アルブミン（Ｍ．Ｗ．４４，０００）、ガンマ−グロブ
リン（Ｍ．Ｗ．１５８，０００）及びチログロビン
（Ｍ．Ｗ．６７０．０００）を用いた。ＧＬＤＨの分子
量は１１０，０００±２，０００であった。
０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した大きさ排除型（ｓｉ
ｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）ゲルカラム（ＴＳＫ ｇｅ
ｌ Ｇ３０００ ＳＷ×Ｌカラム、７．８ｍｍ×３０ｃ
ｍ）を用い、高速液体クロマトグラフィーで測定した。
分子量の標準としてシアノコバラミン（Ｍ．Ｗ．１，３
５０）、ミオグロビン（Ｍ．Ｗ．１７，０００）、卵白
アルブミン（Ｍ．Ｗ．４４，０００）、ガンマ−グロブ
リン（Ｍ．Ｗ．１５８，０００）及びチログロビン
（Ｍ．Ｗ．６７０．０００）を用いた。ＧＬＤＨの分子
量は１１０，０００±２，０００であった。
【００１９】次に、精製したＧＬＤＨのサブユニット−
成分の分子量を測定した。精製したＧＬＤＨを、β−メ
ルカプトエタノールの存在下、ドデシル硫酸ナトリウム
（以後、ＳＤＳ．と称する）で処理し、０．１％ＳＤＳ
を含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化した前記と同様のカラムにかけた。分子量
の標準としてリゾチウム（Ｍ．Ｗ．１４，０００）、大
豆トリプシンインヒビター（Ｍ．Ｗ．２１，５００）、
炭酸脱水素酵素（Ｍ．Ｗ．３１，０００）、卵白アルブ
ミン（Ｍ．Ｗ．４５，０００）、牛血清アルブミン
（Ｍ．Ｗ．６６，２００）、及びホスホリラーゼＢ
（Ｍ．Ｗ．９２，５００）を用いた。本酵素は各々の分
子量が６１，０００、３２，５００及び１６，５００の
３つのサブユニットから成る。これらの３種の分子量の
合計は、天然のＧＬＤＨの総分子量である１１０，００
０である。
成分の分子量を測定した。精製したＧＬＤＨを、β−メ
ルカプトエタノールの存在下、ドデシル硫酸ナトリウム
（以後、ＳＤＳ．と称する）で処理し、０．１％ＳＤＳ
を含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化した前記と同様のカラムにかけた。分子量
の標準としてリゾチウム（Ｍ．Ｗ．１４，０００）、大
豆トリプシンインヒビター（Ｍ．Ｗ．２１，５００）、
炭酸脱水素酵素（Ｍ．Ｗ．３１，０００）、卵白アルブ
ミン（Ｍ．Ｗ．４５，０００）、牛血清アルブミン
（Ｍ．Ｗ．６６，２００）、及びホスホリラーゼＢ
（Ｍ．Ｗ．９２，５００）を用いた。本酵素は各々の分
子量が６１，０００、３２，５００及び１６，５００の
３つのサブユニットから成る。これらの３種の分子量の
合計は、天然のＧＬＤＨの総分子量である１１０，００
０である。
【００２０】前記したＳＤＳのゲル電気泳動において染
色されないゲルに紫外線を照射すると強いケイ光を示す
事から最も大きな成分（Ｍ．Ｗ．６１，０００）は、お
そらくフラボプロティンであると思われる。ヘム染色に
よって染色される第２の成分（Ｍ．Ｗ．３２，５００）
は、おそらくチトクロームであると思われる
色されないゲルに紫外線を照射すると強いケイ光を示す
事から最も大きな成分（Ｍ．Ｗ．６１，０００）は、お
そらくフラボプロティンであると思われる。ヘム染色に
よって染色される第２の成分（Ｍ．Ｗ．３２，５００）
は、おそらくチトクロームであると思われる
【００２１】第３の成分（Ｍ．Ｗ．１６，５００±５０
０）は、単純蛋白、たとえば、補欠分子族を持たない蛋
白である。要約すると、各々の分子量は、 ６１，０００±１，０００ ３２，５００±１，０００ １６，５００± ５００ であり、標準偏差は、ＳＤＳ電気泳動で普通に見られる
ようなものである。
０）は、単純蛋白、たとえば、補欠分子族を持たない蛋
白である。要約すると、各々の分子量は、 ６１，０００±１，０００ ３２，５００±１，０００ １６，５００± ５００ であり、標準偏差は、ＳＤＳ電気泳動で普通に見られる
ようなものである。
【００２２】前記電気泳動ゲルのヘム染色は、以下に述
べる様なＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ７５、１６８−１７６（１９７６）にＰ．Ｅ．Ｔ
ｈｏｍａｓらによって報告された方法に従って実施し
た。
べる様なＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ７５、１６８−１７６（１９７６）にＰ．Ｅ．Ｔ
ｈｏｍａｓらによって報告された方法に従って実施し
た。
【００２３】６．３ｍＭ３，３′，５，５′−テトラメ
チルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液をメタノール中で新た
に調整した。使用直前にＴＭＢＺ溶液の３部をｐＨ５．
０、０．２５Ｍの酢酸ナトリウム７部と混合した。ゲル
を混合液中に浸し、室温、暗所で２時間間欠的に攪拌し
た。チトクロームを含む第２のタンパク質成分を染色す
るために、過酸化水素を最終濃度が、３０ｍＭになるよ
うに加えた。
チルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液をメタノール中で新た
に調整した。使用直前にＴＭＢＺ溶液の３部をｐＨ５．
０、０．２５Ｍの酢酸ナトリウム７部と混合した。ゲル
を混合液中に浸し、室温、暗所で２時間間欠的に攪拌し
た。チトクロームを含む第２のタンパク質成分を染色す
るために、過酸化水素を最終濃度が、３０ｍＭになるよ
うに加えた。
【００２４】８） 吸収スペクトル：ジチオン酸ナトリ
ウムで還元した精製ＧＬＤＨの吸収スペクトルは、可視
領域で４１６、５２１及び５５２ｎｍに極大吸収を示
し、図１に示すようにチトクロームｃ成分の存在を示
す。
ウムで還元した精製ＧＬＤＨの吸収スペクトルは、可視
領域で４１６、５２１及び５５２ｎｍに極大吸収を示
し、図１に示すようにチトクロームｃ成分の存在を示
す。
【００２５】９） Ｋｍ値の測定：前記したと同様の酵
素測定方法を用いて、０．１８ｍＭから９０ｍＭのＬ−
グロノ−ガンマ−ラクトンの濃度変化に伴う酸化反応速
度を測定し、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンに対するＫ
ｍ値を求めた。最大反応速度は、約７１．８ｍＭの基質
濃度においてみられた。ミハエリス定数（Ｋｍ）は、電
子受容体としてＤＣＩＰを用いた時、３４．８ｍＭと算
出された。
素測定方法を用いて、０．１８ｍＭから９０ｍＭのＬ−
グロノ−ガンマ−ラクトンの濃度変化に伴う酸化反応速
度を測定し、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトンに対するＫ
ｍ値を求めた。最大反応速度は、約７１．８ｍＭの基質
濃度においてみられた。ミハエリス定数（Ｋｍ）は、電
子受容体としてＤＣＩＰを用いた時、３４．８ｍＭと算
出された。
【００２６】１０） 金属イオンの影響：１）に記載し
たと同様の酵素測定方法を用いて、酵素活性に対する各
種金属イオンの影響を調べた。結果は表６に示した。Ｃ
ｕ2+及びＭｎ2+は、酵素の強い阻害活性を示した。
たと同様の酵素測定方法を用いて、酵素活性に対する各
種金属イオンの影響を調べた。結果は表６に示した。Ｃ
ｕ2+及びＭｎ2+は、酵素の強い阻害活性を示した。
【００２７】１１） インヒビターの影響 前記したと同様の酵素測定方法を用いて、酵素活性に対
する各種インヒビターの影響を調べた。結果は表７に示
した。調べられたいずれの化合物もＧＬＤＨに対して阻
害作用を示さなかった。
する各種インヒビターの影響を調べた。結果は表７に示
した。調べられたいずれの化合物もＧＬＤＨに対して阻
害作用を示さなかった。
【００２８】１２） 精製方法：Ｌ−グロノ−ガンマ−
ラクトン脱水素酵素の精製を、たとえば、イオン交換ク
ロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ゲル−
電気泳動、塩析及び透析など既知の精製方法の組合せに
よって行った。
ラクトン脱水素酵素の精製を、たとえば、イオン交換ク
ロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ゲル−
電気泳動、塩析及び透析など既知の精製方法の組合せに
よって行った。
【００２９】用いられる微生物は、バチルス、メガテリ
ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の存在
下、共に培養した時に、良好な増殖を示すグルコノバク
ター属に属する全ての株を含む。該微生物の突然変異株
及び誘導体も、本発明で使用しうる。好しい株はグルコ
ノバクターオキシダンスである。
ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の存在
下、共に培養した時に、良好な増殖を示すグルコノバク
ター属に属する全ての株を含む。該微生物の突然変異株
及び誘導体も、本発明で使用しうる。好しい株はグルコ
ノバクターオキシダンスである。
【００３０】該菌株はＢｅｒｇｅｙ′ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｕｅ Ｂａｃｔｃｒｉ
ｏｌｇｙ，第８版、１９７４に参照し、特に菌株が以下
の様な特徴をもつという事実にもとづいて、グルコノバ
クター、オキシダンスとして命名、分類されている。
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｕｅ Ｂａｃｔｃｒｉ
ｏｌｇｙ，第８版、１９７４に参照し、特に菌株が以下
の様な特徴をもつという事実にもとづいて、グルコノバ
クター、オキシダンスとして命名、分類されている。
【００３１】ａ） Ｌ−ソルボースから２−ケト−Ｌ−
グロン酸を生産する、 ｂ） エタノールを酢酸に酸化する。 ｃ） Ｄ−グルコースをＤ−グルコン酸及び−２−ケト
−Ｄ−グルコン酸に酸化する、 ｄ） 多価アルコールのケトジェネシス、 ｅ） ｐＨ４及び５においてマンニトール培養液（２４
時間培養）中、薄膜及 び環状の生育を示し、ｐＨ４．５においてＤ−グルコー
ス培養液中、薄膜状の生育を示す。
グロン酸を生産する、 ｂ） エタノールを酢酸に酸化する。 ｃ） Ｄ−グルコースをＤ−グルコン酸及び−２−ケト
−Ｄ−グルコン酸に酸化する、 ｄ） 多価アルコールのケトジェネシス、 ｅ） ｐＨ４及び５においてマンニトール培養液（２４
時間培養）中、薄膜及 び環状の生育を示し、ｐＨ４．５においてＤ−グルコー
ス培養液中、薄膜状の生育を示す。
【００３２】さらに次の様な性質を示す： ｆ） グリセロールからジヒドロキシアセトンを本質的
には生産しない、 ｇ） Ｄ−ソルビトール及びＤ−グルカル酸から２−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸を産生するが、Ｄ−グルコース、Ｄ
−フルクト−ス、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−マンニトール又
は２−ケト−Ｄ−グルコン酸からは産生しない、 ｈ） 多形であり、ベン毛はない、 ｉ） Ｄ−フルクトースから茶色の色素を産出する、 ｊ） バチルスメガテリウム又はその細胞抽出物と共に
培養すると成育が良い、 ｋ） ストレプトマイシン感受性、
には生産しない、 ｇ） Ｄ−ソルビトール及びＤ−グルカル酸から２−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸を産生するが、Ｄ−グルコース、Ｄ
−フルクト−ス、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−マンニトール又
は２−ケト−Ｄ−グルコン酸からは産生しない、 ｈ） 多形であり、ベン毛はない、 ｉ） Ｄ−フルクトースから茶色の色素を産出する、 ｊ） バチルスメガテリウム又はその細胞抽出物と共に
培養すると成育が良い、 ｋ） ストレプトマイシン感受性、
【００３３】特に好ましいグルコノバクターオキシダン
ス株は１９８７年３月１７日にＤＳＭ４０２５としてＧ
ｏｅｔｔｉｎｇｅｎのＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｎ
ｕｕｇｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｒｉｓｍｅｒに寄託
されている。
ス株は１９８７年３月１７日にＤＳＭ４０２５としてＧ
ｏｅｔｔｉｎｇｅｎのＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｎ
ｕｕｇｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｒｉｓｍｅｒに寄託
されている。
【００３４】グルコノバクターオキシダンス株の細胞
は、端が丸い棹状である。グルコノバクターオキシダン
ス株細胞の直径は、平均で約０．３ないし０．６μｍで
あり、その長さは約０．９ないし１．６μｍであり、多
くは１ないし１．５μｍである。
は、端が丸い棹状である。グルコノバクターオキシダン
ス株細胞の直径は、平均で約０．３ないし０．６μｍで
あり、その長さは約０．９ないし１．６μｍであり、多
くは１ないし１．５μｍである。
【００３５】ＧＬＤＨの調製に際して、本微生物を好気
的条件下で、適当な栄養物を加えた水性培地中で培養し
てもよい。培養は、約４．０ないし９．０、好ましくは
約６．０ないし８．０のｐＨで行なうことができる。培
養期間は、ｐＨ、温度又は栄養培地によって種々異なる
が通常２〜５日間で好ましい結果が得られる。培養を行
なうのに好ましい温度範囲は約１３ないし３６℃、より
好ましくは、１８ないし３３℃である。
的条件下で、適当な栄養物を加えた水性培地中で培養し
てもよい。培養は、約４．０ないし９．０、好ましくは
約６．０ないし８．０のｐＨで行なうことができる。培
養期間は、ｐＨ、温度又は栄養培地によって種々異なる
が通常２〜５日間で好ましい結果が得られる。培養を行
なうのに好ましい温度範囲は約１３ないし３６℃、より
好ましくは、１８ないし３３℃である。
【００３６】培養液は、同化炭素源、消化窒素源及び無
機物、ビタミン類、微量元素及び他の成育促進因子など
を含むことが通常必要である。同化炭素源として、Ｌ−
ソルボース、グリセロール、Ｄ−グルコース、Ｄ−マン
ニトール、Ｄ−フルクトース、Ｄ−アラビトール等を用
いることができる。種々の有機又は無機物質、例えば酵
母抽出物、肉抽出物、ペプトン、カゼイン、コーンステ
ィープリカー、尿素アミノ酸、硝酸塩、アンモニウム塩
等も窒素源として用いることができる。無機物質とし
て、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化第一及び
第二鉄、炭酸カルシウム等を用いることができる。
機物、ビタミン類、微量元素及び他の成育促進因子など
を含むことが通常必要である。同化炭素源として、Ｌ−
ソルボース、グリセロール、Ｄ−グルコース、Ｄ−マン
ニトール、Ｄ−フルクトース、Ｄ−アラビトール等を用
いることができる。種々の有機又は無機物質、例えば酵
母抽出物、肉抽出物、ペプトン、カゼイン、コーンステ
ィープリカー、尿素アミノ酸、硝酸塩、アンモニウム塩
等も窒素源として用いることができる。無機物質とし
て、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化第一及び
第二鉄、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００３７】以下、培養後の微生物からのＧＬＤＨの単
離、精製の実施様態について要約する。
離、精製の実施様態について要約する。
【００３８】（１） 菌体を、遠心又はろ過によって培
養液から回収する。 （２） その菌体を、緩衝液に懸濁し、ホモジェナイザ
ー、超音波粉砕機又はリゾチーム処理等によって破壊す
る。 （３） ＧＬＤＨを、破壊細胞の無細胞抽出液、好しく
は、微生物の可溶性画分から単離、精製する。
養液から回収する。 （２） その菌体を、緩衝液に懸濁し、ホモジェナイザ
ー、超音波粉砕機又はリゾチーム処理等によって破壊す
る。 （３） ＧＬＤＨを、破壊細胞の無細胞抽出液、好しく
は、微生物の可溶性画分から単離、精製する。
【００３９】これらの工程において、 １） ＤＥＡＥセルロース カラム クロマトグラフィ ２） Ｑ−セファロース カラム クロマトグラフィ、 ３） ヒドロキシアパタイト カラム クロマトグラフ
ィ ４） セファクリル Ｓ−３００ カラム クロマトグ
ラフィ又は ５） ポリアクリルアミド ゲル電気泳動等 のカラム クロマトグラフィを用いることが好ましい。
ィ ４） セファクリル Ｓ−３００ カラム クロマトグ
ラフィ又は ５） ポリアクリルアミド ゲル電気泳動等 のカラム クロマトグラフィを用いることが好ましい。
【００４０】本発明で提供されるＧＬＤＨは、Ｌ−グロ
ノ−ガンマ−ラクトンからＬ−アスコルビン酸製造用の
触媒として有用である。反応は、マッキルベイン緩衝
液、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの
溶媒中、ＤＣＩＰ、ＰＭＳ、ウルステルブルー、フェリ
チアニド、補酵素Ｑ、チトクロームＣなどの電子受容体
の存在下、６．０ないし９．０のｐＨ値において行な
う。
ノ−ガンマ−ラクトンからＬ−アスコルビン酸製造用の
触媒として有用である。反応は、マッキルベイン緩衝
液、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの
溶媒中、ＤＣＩＰ、ＰＭＳ、ウルステルブルー、フェリ
チアニド、補酵素Ｑ、チトクロームＣなどの電子受容体
の存在下、６．０ないし９．０のｐＨ値において行な
う。
【００４１】反応を行なうための好ましい温度は、２５
から５５℃である。ｐＨと温度をそれぞれ７．０から
８．０及び３０から５０℃に設定した時、通常最も好ま
しい反応結果が得られる。溶媒中の基質としてのＬ−グ
ロノ−ガンマ−ラクトンの濃度は、他の反応条件によっ
て種々異なるが、一般的に約１０から１５０ｇ／ｌ、最
も好しくは約１０から１００ｇ／ｌが好ましい。
から５５℃である。ｐＨと温度をそれぞれ７．０から
８．０及び３０から５０℃に設定した時、通常最も好ま
しい反応結果が得られる。溶媒中の基質としてのＬ−グ
ロノ−ガンマ−ラクトンの濃度は、他の反応条件によっ
て種々異なるが、一般的に約１０から１５０ｇ／ｌ、最
も好しくは約１０から１００ｇ／ｌが好ましい。
【００４２】この反応用に、酵素を適当なキャリアと共
に固定化状態で使用してもよい。当業界において一般に
知られているいかなる酵素の固定化方法を用いてもよ
い。例えば酵素を官能基を有する樹脂膜、顆粒等に直接
結合してもよく、又はグルタールアルデヒド等の二官能
性基を有する架橋化合物を介して樹脂に結合させてもよ
い。
に固定化状態で使用してもよい。当業界において一般に
知られているいかなる酵素の固定化方法を用いてもよ
い。例えば酵素を官能基を有する樹脂膜、顆粒等に直接
結合してもよく、又はグルタールアルデヒド等の二官能
性基を有する架橋化合物を介して樹脂に結合させてもよ
い。
【００４３】培養方法に関する限り、次の様なパラメー
タが適用され、その方法は、それぞれ次の様な方法に従
って好適に実施される：ＩＩを産生しうる微生物を、化
合物Ｉの存在下、栄養培地中で培養するか、又はその成
育後、緩衝液中、Ｉと接触させ、さらに培養する。
タが適用され、その方法は、それぞれ次の様な方法に従
って好適に実施される：ＩＩを産生しうる微生物を、化
合物Ｉの存在下、栄養培地中で培養するか、又はその成
育後、緩衝液中、Ｉと接触させ、さらに培養する。
【００４４】微生物の例としては、例えば、アセトバク
ター属に属するバクテリア：例えば、アセトバクターサ
ブオキシダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘ
ｙｄａｎｓ）（ＤＳＭ５９３５）、アセトバクターオキ
シダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）
（ＤＳＭ５９３６）、アセトバクターメラノゲネス（Ａ
ｃｔｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）（ＮＣ
ＩＭＢ８０８６）グルコノバクター属、に属するバクテ
リア：例えば、グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕ
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）（ＡＴＣＣ６
２１） グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃ
ｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）（ＤＳＭ４０２５） さらに適当なバクテリアとしては：アクチノマイセス
属、に属するバクテリア：例えばストレプトマイセス、
例えば、ストレプトマイセス アンチバイオティカス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕ
ｓ）（ＡＴＣＣ ８６３３）、ストレプトマイセス ユ
ーロシジカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｕｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １９５５１）、ストレプト
マイセス ラヴェンズラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）（ＤＳＭ ５９２６）、ストレ
プトマイセス オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）（ＡＴＣＣ ３３３５）、ス
トレプトマイセス ネトロプシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ）（ＮＲＲＬ ２２６８）
ター属に属するバクテリア：例えば、アセトバクターサ
ブオキシダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘ
ｙｄａｎｓ）（ＤＳＭ５９３５）、アセトバクターオキ
シダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）
（ＤＳＭ５９３６）、アセトバクターメラノゲネス（Ａ
ｃｔｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｓ）（ＮＣ
ＩＭＢ８０８６）グルコノバクター属、に属するバクテ
リア：例えば、グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕ
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）（ＡＴＣＣ６
２１） グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃ
ｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）（ＤＳＭ４０２５） さらに適当なバクテリアとしては：アクチノマイセス
属、に属するバクテリア：例えばストレプトマイセス、
例えば、ストレプトマイセス アンチバイオティカス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕ
ｓ）（ＡＴＣＣ ８６３３）、ストレプトマイセス ユ
ーロシジカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｕｒｏｃ
ｉｄｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １９５５１）、ストレプト
マイセス ラヴェンズラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）（ＤＳＭ ５９２６）、ストレ
プトマイセス オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）（ＡＴＣＣ ３３３５）、ス
トレプトマイセス ネトロプシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｎｅｔｒｏｐｓｉｓ）（ＮＲＲＬ ２２６８）
【００４５】〔ＮＲＲＬ＝Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｕｔｉｌ
ｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄ Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｕ．Ｓ．Ｄ．
Ａ．，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ＵＳＡ ＡＴＣＣ＝Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ ＮＣＩＭＢ＝Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ＋ Ｍａｒｉｎｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉａ，Ｔｏｒｒｙ ＲｅｓｅａｒｃｈＳｔａ
ｔｉｏｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ９８ＤＧ，Ｓｃｏｔ
ｌａｎｄ〕
ｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄ Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｕ．Ｓ．Ｄ．
Ａ．，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ＵＳＡ ＡＴＣＣ＝Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ ＮＣＩＭＢ＝Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ＋ Ｍａｒｉｎｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉａ，Ｔｏｒｒｙ ＲｅｓｅａｒｃｈＳｔａ
ｔｉｏｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ９８ＤＧ，Ｓｃｏｔ
ｌａｎｄ〕
【００４６】本反応のために特に適した微生物は、アセ
トバクター属及びグルコノバクタ−属に属する種で、特
にアセトバクターサブオキシダンス株とグルコノバクタ
ーオキシダンス株である。これらの株は、本製法の保全
のために寄託されている。
トバクター属及びグルコノバクタ−属に属する種で、特
にアセトバクターサブオキシダンス株とグルコノバクタ
ーオキシダンス株である。これらの株は、本製法の保全
のために寄託されている。
【００４７】本発明に従って使用される全ての微生物
は、本発明の醗酵工程に供せられる前に栄養培地中で十
分生育すべきであることが理解される。その生育は、水
性培地中で可能である。
は、本発明の醗酵工程に供せられる前に栄養培地中で十
分生育すべきであることが理解される。その生育は、水
性培地中で可能である。
【００４８】生育した微生物を含む栄養培地を直接、本
変換反応に用いることができる。
変換反応に用いることができる。
【００４９】反応培地の成分は、いかなる添加物をも加
えていない緩衝液中で別個に生育させた微生物と基質
（ｅｄｕｃｔ）Ｉの溶液を合する等によってより単純な
ものでよい。
えていない緩衝液中で別個に生育させた微生物と基質
（ｅｄｕｃｔ）Ｉの溶液を合する等によってより単純な
ものでよい。
【００５０】培地のｐＨは、２ないし９の範囲にするこ
とが好ましく、更に好ましくは、約４ないし７の範囲で
ある。所望により、ｐＨ値は緩衝液系で調節してもよ
い。
とが好ましく、更に好ましくは、約４ないし７の範囲で
ある。所望により、ｐＨ値は緩衝液系で調節してもよ
い。
【００５１】最適な収率を得るために、約１から１０％
（重量）の範囲の基質使用することが望ましい。
（重量）の範囲の基質使用することが望ましい。
【００５２】好ましい培養時間は、２から１００時間で
あり、特に４から７２時間が好ましい。基質Ｉの連続供
給は、培養時間を延長せしめる。
あり、特に４から７２時間が好ましい。基質Ｉの連続供
給は、培養時間を延長せしめる。
【００５３】本反応は、好気的な方法で行われる事が理
解される。この様な条件は、空気下、又は追加的通気条
件下で反応培地を激しく振とう又は攪拌することによっ
て満足される。
解される。この様な条件は、空気下、又は追加的通気条
件下で反応培地を激しく振とう又は攪拌することによっ
て満足される。
【実施例】以下の実施例によって本発明を更に詳細に説
明する。
明する。
【００５４】実施例１ Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の調製 （１） グルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０２５
の培養 グルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０２５を、マン
ニトール５．０％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２５
％、コーンスティープリカー１．７５％、パン酵母５．
０％、尿素０．５％、ＣａＣＯ3 ０．５％及び寒天２．
０％を含む寒天斜面培地上、２７℃で４日間生育させ
た。寒天斜面培地に生育したグルコノバクターオキシダ
ンスＤＳＭ４０２５の一白金耳を５００ｍｌ容のエレン
マイヤーフラスコ中、Ｌ−ソルボース８．０％、グリセ
ロール０．０５％、尿素０．５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ ０．２５％、コーンスティープリカー１．７５％、
パン酵母５．０％及びＣａＣＯ3 １．５％を含む種培地
５０ｍｌに接種し、回転型振とう機（１８０ｒｐｍ）
上、３０℃で１日培養した。この培養液５ｍｌを、５０
０ｍｌ容エレンマイヤーフラスコ中の同一の培地５０ｍ
ｌに移し、前記したのと同様の方法で培養した。このよ
うに調製した種培養２リットルを、Ｌ−ソルボース８．
０％、グリセロール０．０５％、尿素１．２％、ＭｇＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２５％、コーンスティープリカー
３．０％、パン酵母５．０％及びＣａＣＯ3 １．５％を
含む２０リットルの培地が入った３０リットル容醗酵槽
に接種した。醗酵槽を、３０℃、４００ｒｐｍ攪拌及び
０．５ｖｖｍ（空気の体積／培地の体積／分）の通気で
操作した。４０時間培養後、培養液を１，５００ｒｐｍ
で１０分間遠心して炭酸カルシウムを除去し、８，００
０ｒｐｍ（１０，０００×ｇ）で遠心して培養菌体を得
た。菌体を０．８５％のＮａＣｌ溶液で１回洗浄した。
２０リットルの培養液から、約１００ｇ（湿重量）の菌
体が得られた。
の培養 グルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０２５を、マン
ニトール５．０％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２５
％、コーンスティープリカー１．７５％、パン酵母５．
０％、尿素０．５％、ＣａＣＯ3 ０．５％及び寒天２．
０％を含む寒天斜面培地上、２７℃で４日間生育させ
た。寒天斜面培地に生育したグルコノバクターオキシダ
ンスＤＳＭ４０２５の一白金耳を５００ｍｌ容のエレン
マイヤーフラスコ中、Ｌ−ソルボース８．０％、グリセ
ロール０．０５％、尿素０．５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ ０．２５％、コーンスティープリカー１．７５％、
パン酵母５．０％及びＣａＣＯ3 １．５％を含む種培地
５０ｍｌに接種し、回転型振とう機（１８０ｒｐｍ）
上、３０℃で１日培養した。この培養液５ｍｌを、５０
０ｍｌ容エレンマイヤーフラスコ中の同一の培地５０ｍ
ｌに移し、前記したのと同様の方法で培養した。このよ
うに調製した種培養２リットルを、Ｌ−ソルボース８．
０％、グリセロール０．０５％、尿素１．２％、ＭｇＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２５％、コーンスティープリカー
３．０％、パン酵母５．０％及びＣａＣＯ3 １．５％を
含む２０リットルの培地が入った３０リットル容醗酵槽
に接種した。醗酵槽を、３０℃、４００ｒｐｍ攪拌及び
０．５ｖｖｍ（空気の体積／培地の体積／分）の通気で
操作した。４０時間培養後、培養液を１，５００ｒｐｍ
で１０分間遠心して炭酸カルシウムを除去し、８，００
０ｒｐｍ（１０，０００×ｇ）で遠心して培養菌体を得
た。菌体を０．８５％のＮａＣｌ溶液で１回洗浄した。
２０リットルの培養液から、約１００ｇ（湿重量）の菌
体が得られた。
【００５５】（２） 可溶性画分の調製 前記工程（１）からのグルコノバクターオキシダンスＤ
ＳＭ４０２５（９５ｇ、湿重量）の菌体を、０．８５％
ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。洗浄菌体を、１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３８０ｍｌ中に懸濁
し、菌体懸濁液の菌体を、フレンチプレスホモジェナイ
ザーを用い、１５００ｋｇ／ｃｍ2で潰した。１８００
×ｇで１０分間遠心して菌体残査を除去し、次にその上
清（以後無細胞抽出物と称する）を、１００，０００×
ｇで、６０分間遠心した。得られた上清（４５０ｍｌ）
を、グルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０２５細胞
の可溶性画分として集めた。
ＳＭ４０２５（９５ｇ、湿重量）の菌体を、０．８５％
ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。洗浄菌体を、１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３８０ｍｌ中に懸濁
し、菌体懸濁液の菌体を、フレンチプレスホモジェナイ
ザーを用い、１５００ｋｇ／ｃｍ2で潰した。１８００
×ｇで１０分間遠心して菌体残査を除去し、次にその上
清（以後無細胞抽出物と称する）を、１００，０００×
ｇで、６０分間遠心した。得られた上清（４５０ｍｌ）
を、グルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０２５細胞
の可溶性画分として集めた。
【００５６】（３） ジエチルアミノエチル（以後、Ｄ
ＥＡＥと称する）セルロースカラムクロマトグラフィー 前記工程で得られた可溶性画分（４５０ｍｌ）を、１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。
透析物（５００ｍｌ）を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衡させたＤＥＡＥ−セルロースカ
ラム（２．５×１２０ｃｍ）にかけた。カラムを、同一
の緩衝液で洗浄し、次に０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含
む同一の緩衝液で洗浄した。ＧＬＤＨを、０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む同一の緩衝液で溶出させた。
ＥＡＥと称する）セルロースカラムクロマトグラフィー 前記工程で得られた可溶性画分（４５０ｍｌ）を、１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。
透析物（５００ｍｌ）を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衡させたＤＥＡＥ−セルロースカ
ラム（２．５×１２０ｃｍ）にかけた。カラムを、同一
の緩衝液で洗浄し、次に０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含
む同一の緩衝液で洗浄した。ＧＬＤＨを、０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む同一の緩衝液で溶出させた。
【００５７】（４） Ｑセファロースカラムクロマトグ
ラフィー 前記工程から得られた活性画分（２００ｍｌ）を、１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２リットルで
２回透析し、同一の緩衝液で平衡にしたＱ−セファロー
スカラム（２．５×５０ｃｍ）にかけた。同一の緩衝液
でカラムを洗浄した後、０．３Ｍから０．５Ｍ ＮａＣ
ｌの直線勾配でＧＬＤＨを溶出させた。
ラフィー 前記工程から得られた活性画分（２００ｍｌ）を、１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２リットルで
２回透析し、同一の緩衝液で平衡にしたＱ−セファロー
スカラム（２．５×５０ｃｍ）にかけた。同一の緩衝液
でカラムを洗浄した後、０．３Ｍから０．５Ｍ ＮａＣ
ｌの直線勾配でＧＬＤＨを溶出させた。
【００５８】（５） ハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ
−ｇｅｌ ＨＴＰ）カラムクロマトグラフィー 前記工程から得られた活性画分（２１０ｍｌ）を、１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２リットルで
２回透析し、同一の緩衝液で平衡にしたハイドロキシア
パタイトカラム（２．５×２５ｃｍ）にかけた。カラム
を同一の緩衝液で洗浄し、１０ｍＭから４０ｍＭリン酸
カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）の直線勾配でＧＬＤＨ
を溶出させた。酵素活性をもつ画分を、合し、限外ろ過
膜（ｐＭ１０、Ａｍｉｃｏｍ）を用いた限外ろ過法によ
って約２０ｍｌまで濃縮した。
−ｇｅｌ ＨＴＰ）カラムクロマトグラフィー 前記工程から得られた活性画分（２１０ｍｌ）を、１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２リットルで
２回透析し、同一の緩衝液で平衡にしたハイドロキシア
パタイトカラム（２．５×２５ｃｍ）にかけた。カラム
を同一の緩衝液で洗浄し、１０ｍＭから４０ｍＭリン酸
カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）の直線勾配でＧＬＤＨ
を溶出させた。酵素活性をもつ画分を、合し、限外ろ過
膜（ｐＭ１０、Ａｍｉｃｏｍ）を用いた限外ろ過法によ
って約２０ｍｌまで濃縮した。
【００５９】（６） セファクリルＳ−３００カラムク
ロマトグラフィー 前記工程からの酵素画分（２ｍｌ）の一部を、５０ｍＭ
ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したセファクリルＳ−３００カラム
（１．０×１００ｃｍ）にかけ、同一の緩衝液で展開し
た。電気泳動的に均質なＧＬＤＨを含む画分を合し、−
８０℃で保存した。
ロマトグラフィー 前記工程からの酵素画分（２ｍｌ）の一部を、５０ｍＭ
ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したセファクリルＳ−３００カラム
（１．０×１００ｃｍ）にかけ、同一の緩衝液で展開し
た。電気泳動的に均質なＧＬＤＨを含む画分を合し、−
８０℃で保存した。
【００６０】前記の精製工程を用いて、ＧＬＤＨを約９
００倍に精製した。ＧＬＤＨの精製工程の要約を表８に
示した。
００倍に精製した。ＧＬＤＨの精製工程の要約を表８に
示した。
【００６１】（７） 分離した酵素の純度 分離したＧＬＤＨの純度を推定するために、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（分離ゲル：１０％ポリアクリル
アミド：電気泳動の条件：２０ｍＡ、４℃で６時間）を
行なった。酵素は、クマシーブリリアントブルーＲ−２
５０で染色される単一のバンドをもたらした。染色され
ないゲルを、５０ｍＭ Ｌ−グロノ−ガンマラクトン、
ニトロブルーテトラゾリウム２０μｇ／ｍｌ及びフェナ
ジンメト硫酸４０μｇ／ｍｌを含む５０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）に２０分間浸した際、上記単
一バンドの位置にＧＬＤＨ活性を示した。
ルアミドゲル電気泳動（分離ゲル：１０％ポリアクリル
アミド：電気泳動の条件：２０ｍＡ、４℃で６時間）を
行なった。酵素は、クマシーブリリアントブルーＲ−２
５０で染色される単一のバンドをもたらした。染色され
ないゲルを、５０ｍＭ Ｌ−グロノ−ガンマラクトン、
ニトロブルーテトラゾリウム２０μｇ／ｍｌ及びフェナ
ジンメト硫酸４０μｇ／ｍｌを含む５０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）に２０分間浸した際、上記単
一バンドの位置にＧＬＤＨ活性を示した。
【００６２】（８） 反応生成物の同定 精製ＧＬＤＨ ０．５ｍｌ（７．５μｇ、４６９単位／
ｍｇタンパク）、０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）１．０ｍｌ、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン
０．１ｇ、１０ｍＭフェナジンメト硫酸０．１ｍｌ及び
最終容積を２．０ｍｌにする水を含む反応混合物を、３
０℃で２時間インキュベートした。反応生成物を、薄層
クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィの両
方で分析した。薄層クロマトグラフィは次の様に行なっ
た：サンプル（１μｌ）を、シリカゲルプレート（Ｍｅ
ｒｃｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）上にスポットし、室温で２時
間、ｎ−プロパノール−水−１％リン酸−ギ酸（４０
０：１００：１０：１）の溶媒系で展開した。次にプレ
ートを乾燥し、紫外線ランプのもとで観察した。生成物
は、Ｌ−アスコルビン酸の標準サンプルと同一の位置
（Ｒｆ値：約０．７）に、紫外線吸収スポットとして認
められた。高速液体クロマトグラフィーは以下の様に行
なった：サンプルを、アセトニトリル−水−酢酸（８
７：１１：２）の溶媒系で平衡にしたＬｉＣｈｒｏｓｏ
ｒｂ ＮＨ2 カラムにかけた。流速を３．０ｍｌ／分に
し、２５４ｎｍにおいて生成物の検出を行なった。結果
として、生成物は、Ｌ−アスコルビン酸の標準サンプル
と同一の保持時間で溶出した。
ｍｇタンパク）、０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）１．０ｍｌ、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン
０．１ｇ、１０ｍＭフェナジンメト硫酸０．１ｍｌ及び
最終容積を２．０ｍｌにする水を含む反応混合物を、３
０℃で２時間インキュベートした。反応生成物を、薄層
クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィの両
方で分析した。薄層クロマトグラフィは次の様に行なっ
た：サンプル（１μｌ）を、シリカゲルプレート（Ｍｅ
ｒｃｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）上にスポットし、室温で２時
間、ｎ−プロパノール−水−１％リン酸−ギ酸（４０
０：１００：１０：１）の溶媒系で展開した。次にプレ
ートを乾燥し、紫外線ランプのもとで観察した。生成物
は、Ｌ−アスコルビン酸の標準サンプルと同一の位置
（Ｒｆ値：約０．７）に、紫外線吸収スポットとして認
められた。高速液体クロマトグラフィーは以下の様に行
なった：サンプルを、アセトニトリル−水−酢酸（８
７：１１：２）の溶媒系で平衡にしたＬｉＣｈｒｏｓｏ
ｒｂ ＮＨ2 カラムにかけた。流速を３．０ｍｌ／分に
し、２５４ｎｍにおいて生成物の検出を行なった。結果
として、生成物は、Ｌ−アスコルビン酸の標準サンプル
と同一の保持時間で溶出した。
【００６３】その結果として、生成物は、Ｌ−アスコル
ビン酸であると同定された。Ｌ−アスコルビン酸の生産
能力は０．７１ｇ／ｌ／時であった。
ビン酸であると同定された。Ｌ−アスコルビン酸の生産
能力は０．７１ｇ／ｌ／時であった。
【００６４】実施例２ 培養生育菌体によるＬ−グロノ−ガンマ−ラクトンから
Ｌ−アスコルビン酸の生産
Ｌ−アスコルビン酸の生産
【００６５】実施例１−（１）で記載したのと同様な方
法で調製したグルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０
２５の種培養２００ｍｌを、３リットル容醗酵槽中のＬ
−グロノ−ガンマ−ラクトン８％、グリセロール０．０
５％、パン−酵母５．０％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．２５％、コーンスティプリカー１．７５％、尿素
０．５％及びＣａＣＯ3 １．５％（初期ｐＨを７．０に
設定）を含む２リットルの培地に接種した。培養を７０
０ｒｐｍで攪拌し、０．５ｖｖｍで通気しながら３０℃
で行なった。表９に示すように、６６時間の培養でＬ−
アスコルビン酸８．６ｇ／ｌが生産された。
法で調製したグルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０
２５の種培養２００ｍｌを、３リットル容醗酵槽中のＬ
−グロノ−ガンマ−ラクトン８％、グリセロール０．０
５％、パン−酵母５．０％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．２５％、コーンスティプリカー１．７５％、尿素
０．５％及びＣａＣＯ3 １．５％（初期ｐＨを７．０に
設定）を含む２リットルの培地に接種した。培養を７０
０ｒｐｍで攪拌し、０．５ｖｖｍで通気しながら３０℃
で行なった。表９に示すように、６６時間の培養でＬ−
アスコルビン酸８．６ｇ／ｌが生産された。
【００６６】実施例３ 休止細胞系でのＬ−グロノ−ガンマ−ラクトンからＬ−
アスコルビン酸の生産
アスコルビン酸の生産
【００６７】実施例１−（１）に記載したのと同様な方
法で調製したグルコノバクタ−オキシダンスＤＳＭ４０
２５の菌体０．１ｇないし０．６７ｇを、Ｌ−グロノ−
ガンマ−ラクトン４７．６ｍｇ／ｍｌ又は８９．３ｍｇ
／ｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）に加え、総容積を３ｍｌとした。反応混合液を攪拌
（２８０ｒｐｍ）しながら、３０℃で６時間インキュベ
ートした。結果を表１０に示す。Ｌ−アスコルビン酸の
最大生産性は、２０ｍｇ／時／ｇ細胞であった。Ｌ−ア
スコルビン酸の最大収率は、１３．９２ｇ／ｌであっ
た。
法で調製したグルコノバクタ−オキシダンスＤＳＭ４０
２５の菌体０．１ｇないし０．６７ｇを、Ｌ−グロノ−
ガンマ−ラクトン４７．６ｍｇ／ｍｌ又は８９．３ｍｇ
／ｌを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）に加え、総容積を３ｍｌとした。反応混合液を攪拌
（２８０ｒｐｍ）しながら、３０℃で６時間インキュベ
ートした。結果を表１０に示す。Ｌ−アスコルビン酸の
最大生産性は、２０ｍｇ／時／ｇ細胞であった。Ｌ−ア
スコルビン酸の最大収率は、１３．９２ｇ／ｌであっ
た。
【００６８】実施例４ グルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０２５の無細胞
抽出液を用いてのＬ−グロノ−ガンマ−ラクトンからＬ
−アスコルビン酸の生産
抽出液を用いてのＬ−グロノ−ガンマ−ラクトンからＬ
−アスコルビン酸の生産
【００６９】実施例１−（１）及び（２）に記載したの
と同様の方法で調製したグルコノバクターオキシダンス
ＤＳＭ４０２５の無細胞抽出液（タンパク含有：１０．
３ｍｇ／ｍｌ）１．０ｍｌ、０．５Ｍリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ及び１７．８％Ｌ−グロノ−
ガンマ−ラクトン０．５ｍｌを含む反応混合液を、３０
℃で１７．５時間インキュベートした。結果としてＬ−
アスコルビン酸２．１９ｇ／ｌが生産された。
と同様の方法で調製したグルコノバクターオキシダンス
ＤＳＭ４０２５の無細胞抽出液（タンパク含有：１０．
３ｍｇ／ｍｌ）１．０ｍｌ、０．５Ｍリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌ及び１７．８％Ｌ−グロノ−
ガンマ−ラクトン０．５ｍｌを含む反応混合液を、３０
℃で１７．５時間インキュベートした。結果としてＬ−
アスコルビン酸２．１９ｇ／ｌが生産された。
【００７０】実施例５ （増殖菌体系）アセトバクターサブオキシダンス（ＤＳ
Ｍ５９３５) を、培地１（組成：ｐＨ６．５に調製した
水道水中の５０％酵母水、５％マンニット）の寒天斜面
上で生育させた。３０℃で２日間培養後、一白金耳の細
胞を、５ｍｌの液体培地１（寒天以外は前記と同一の成
分）に接種した。試験管を、３０℃，２２０ｒｐｍで３
日間攪拌した。１ｍｌの予備培養液を基質Ｉと共に１０
０ｍｌの培地１に接種した。フラスコを、３０℃，２２
０ｒｐｍで攪拌した。７２時間後に培養を終了した。分
析によって、３％の基質Ｉが生成物ＩＩに変換してい
た。
Ｍ５９３５) を、培地１（組成：ｐＨ６．５に調製した
水道水中の５０％酵母水、５％マンニット）の寒天斜面
上で生育させた。３０℃で２日間培養後、一白金耳の細
胞を、５ｍｌの液体培地１（寒天以外は前記と同一の成
分）に接種した。試験管を、３０℃，２２０ｒｐｍで３
日間攪拌した。１ｍｌの予備培養液を基質Ｉと共に１０
０ｍｌの培地１に接種した。フラスコを、３０℃，２２
０ｒｐｍで攪拌した。７２時間後に培養を終了した。分
析によって、３％の基質Ｉが生成物ＩＩに変換してい
た。
【００７１】実施例６ （休止菌体系）アセトバクターサブオキシダンス（ＤＳ
Ｍ５９３５）を、前記と同様にして、生育させた。培養
液１００ｍｌを遠心（１０，０００ｒｐｍ，１０分）で
集め、液体窒素を用いてプラスチックバイアル中に凍結
した。培地１を含む１００ｍｌフラスコに、バイアルか
ら各々０．５ｍｌずつを接種し、同時に１ｇの基質Ｉを
添加した。分析によって７２時間以内に１０％の遊離体
Ｉが生成物ＩＩに変換していた。
Ｍ５９３５）を、前記と同様にして、生育させた。培養
液１００ｍｌを遠心（１０，０００ｒｐｍ，１０分）で
集め、液体窒素を用いてプラスチックバイアル中に凍結
した。培地１を含む１００ｍｌフラスコに、バイアルか
ら各々０．５ｍｌずつを接種し、同時に１ｇの基質Ｉを
添加した。分析によって７２時間以内に１０％の遊離体
Ｉが生成物ＩＩに変換していた。
【００７２】実施例７ （休止菌体系）アセトバクターサブオキシダンス（ＤＳ
Ｍ５９３５）を、実施例６に記載したと同様にして生育
させた。バイアルから０．５ｍｌの接種を行なった１０
０ｍｌ培養液を、他の成育培養のための予備培養液とし
て用いた。１００ｍｌの培地１を含むこれらのフラスコ
に、５ｍｌの予備培養液を接種し、２２０ｒｐｍ、３０
℃で２４時間攪拌した。生育菌体を、遠心（１０，００
０ｒｐｍ、１０分）で集めた。湿菌体３ｇ（１つのフラ
スコからの細胞に対応）を、１０ｍｌの総容積になるよ
うに、基質Ｉ（粉末として添加）と共に緩衝液（ｐＨ
６．０、０．０５Ｍリン酸緩衝液）に懸濁させた。基質
Ｉの３０％が、４８時間以内に、生成物ＩＩに変換し
た。
Ｍ５９３５）を、実施例６に記載したと同様にして生育
させた。バイアルから０．５ｍｌの接種を行なった１０
０ｍｌ培養液を、他の成育培養のための予備培養液とし
て用いた。１００ｍｌの培地１を含むこれらのフラスコ
に、５ｍｌの予備培養液を接種し、２２０ｒｐｍ、３０
℃で２４時間攪拌した。生育菌体を、遠心（１０，００
０ｒｐｍ、１０分）で集めた。湿菌体３ｇ（１つのフラ
スコからの細胞に対応）を、１０ｍｌの総容積になるよ
うに、基質Ｉ（粉末として添加）と共に緩衝液（ｐＨ
６．０、０．０５Ｍリン酸緩衝液）に懸濁させた。基質
Ｉの３０％が、４８時間以内に、生成物ＩＩに変換し
た。
【００７３】実施例８ （休止菌体系）アセトバクターサブオキシダンス（ＤＳ
Ｍ５９３５）を、実施例１に記載したと同様にして寒天
斜面上で生育させた。生育菌体を生理食塩水（０．９
％）１０ｍｌに懸濁させた。この懸濁液１ｍｌずつが１
０個のフラスコ（１００ｍｌ培地１）に、接種された。
フラスコを、２２０ｒｐｍ、３０℃で４日間インキュベ
ートした。１０個の培養物を、１０リットルの回転羽型
バイオリアクター（９，０００ｍｌ培地１）の接種に用
いた。培養条件：温度：３０℃、通気量０．４ｖｖｍ、
攪拌速度５００ｒｐｍ。４４時間培養後、菌体を遠心分
離機（１２，０００ｒｐｍで連続遠心）で集めた。収率
は、ｌリットルあたり２１ｇ湿菌体であった。菌体はい
くつかに分けて凍結保存した。実施例中、凍結細胞１ｇ
を急速解凍し、０．４ｇの基質Ｉと共に、ｐＨ７．０の
０．０５Ｍリン酸緩衝液に添加した。反応混合液の総容
積は５ｍｌであった。分析結果として、Ｉの１９％が生
成物ＩＩに変換した。
Ｍ５９３５）を、実施例１に記載したと同様にして寒天
斜面上で生育させた。生育菌体を生理食塩水（０．９
％）１０ｍｌに懸濁させた。この懸濁液１ｍｌずつが１
０個のフラスコ（１００ｍｌ培地１）に、接種された。
フラスコを、２２０ｒｐｍ、３０℃で４日間インキュベ
ートした。１０個の培養物を、１０リットルの回転羽型
バイオリアクター（９，０００ｍｌ培地１）の接種に用
いた。培養条件：温度：３０℃、通気量０．４ｖｖｍ、
攪拌速度５００ｒｐｍ。４４時間培養後、菌体を遠心分
離機（１２，０００ｒｐｍで連続遠心）で集めた。収率
は、ｌリットルあたり２１ｇ湿菌体であった。菌体はい
くつかに分けて凍結保存した。実施例中、凍結細胞１ｇ
を急速解凍し、０．４ｇの基質Ｉと共に、ｐＨ７．０の
０．０５Ｍリン酸緩衝液に添加した。反応混合液の総容
積は５ｍｌであった。分析結果として、Ｉの１９％が生
成物ＩＩに変換した。
【００７４】
【表１】 表 １ Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の基質特異性 ─────────────────────────────── 基質 相対活性（％） ─────────────────────────────── Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン １００ Ｌ−ガラクトノ−ガンマ−ラクトン ０ Ｄ−グルクロノ−ガンマ−ラクトン ６．３８ Ｄ−グルコノ−デルタ−ラクトン ０ Ｄ−グルクロン酸 ０ Ｄ−グルコン酸 ０ Ｄ−グルコース ２３．４ Ｄ−マンノース ７．２３ Ｄ−ガラクトース ０ Ｌ−グロース ０ Ｄ−キシロース １１０．６ ───────────────────────────────
【００７５】
【表２】 表 ２ Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の至適ｐＨ ─────────────────────────────────── 相 対 活 性 （％） ──────────────────────────── ｐＨ値 緩衝液 McIlvain リン酸カリウム トリス−塩酸 ─────────────────────────────────── 4.0 0 − − 4.5 0 − − 5.0 8.2 − − 5.5 18.2 − − 6.0 58.5 − − 6.5 77.8 56.4 − 7.0 100 83.6 45.9 7.5 105.8 102.3 58.2 8.0 109.3 − 61.7 8.5 − − 60.0 ─────────────────────────────────── （−：未測定）
【００７６】
【表３】 表 ３ Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素のｐＨの安定性 ─────────────────────────────────── 相 対 活 性 （％） ──────────────────────────── ｐＨ値 緩 衝 液 McIlvaine リン酸カリウム トリス−塩酸 NH4OH-NH4Cl ─────────────────────────────────── 4.0 0 − − − 4.5 0 − − − 5.0 0 − − − 5.5 9.38 − − − 6.0 48.4 62.5 − − 6.5 75.0 50.3 − − 7.0 79.7 71.9 84.4 − 7.5 100 95.3 75.0 − 8.0 84.4 − 62.5 − 8.3 − − 53.2 57.8 8.85 − − − 115.6 9.2 − − − 100 9.7 − − − 68.8 ────────────────────────────────────
【００７７】
【表４】 表 ４ Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の温度安定性 ─────────────────────────── 温 度（℃） 相対活性（％） ─────────────────────────── 0 100 25 100 30 100 35 89.6 40 87.5 45 72.9 50 70.8 55 53.1 60 18.8 65 0 70 0 75 0 ───────────────────────────
【００７８】
【表５】 表 ５ Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の至適温度 ─────────────────────────── 温 度（℃） 相対活性（％） ─────────────────────────── 25 100 30 103.2 35 101.8 40 106.6 45 101.4 50 115.1 55 102.7 ───────────────────────────
【００７９】
【表６】
【００８０】
【表７】
【００８１】
【表８】 表 ８ Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の精製工程の要約 ──────────────────────────────────── 工 程 総括性 総タンパク 特異活性 回収率 （単位) （mg） （単位/mg ） （％） ──────────────────────────────────── 可溶性成分 1179.9 2289.5 0.52 100 ＤＥＡＥセルロース 766.9 66.44 11.54 65.0 Ｑセファロース 761.8 8.65 88.10 64.6 ヒドロキシアパタイト 473.1 3.24 146.0 40.1 セファクリル S-300 37.8 0.0806 469.0 − ────────────────────────────────────
【００８２】
【表９】 表 ９ 醗酵によるＬ−グロノ−ガンマ−ラクトンからＬ−アスコルビン酸の生産 ────────────────────────── 培養時間 Ｌ−アスコルビン酸生産量 （時間） （ｇ／ｌ） ────────────────────────── 0 0.0715 18.5 3.54 27 5.12 42 6.96 51 7.88 66 8.57 75 8.46 90 7.72 ──────────────────────────
【００８３】
【表１０】 表 １０ 休止菌体系によるＬ−グロノ−ガンマ−ラクトンからＬ−アスコルビン酸の生産 ──────────────────────────────────── Ｌ−グロノ−ガンマ− 菌 体 濃 度 生産されたＬ−アスコル ラクトンの初期濃度 （ｇ菌体湿重量／ml) ビン酸（mg／ml) （mg／ml) ３時間 ６時間 ──────────────────────────────────── 0 0.1 0 0 47.6 0.1 5.98 7.22 0.17 6.46 7.82 0.33 7.83 9.65 0.67 9.51 11.28 89.3 0.1 5.88 7.62 0.17 6.88 9.50 0.33 8.37 13.92 0.67 8.67 13.51 ─────────────────────────
───────────
───────────
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のＬ−グロノ−ガンマ−ラクト
ン脱水素酵素の吸収スペクトルを示すグラフである。
ン脱水素酵素の吸収スペクトルを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:02） (Ｃ１２Ｐ 17/04 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 尾島 せつ子 神奈川県藤沢市善行団地３−22−304 (72)発明者 杉沢 輝秀 神奈川県横浜市港南区港南台８−26−10 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 1/00 - 1/38 C12P 1/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (15)
- 【請求項１】 酸素とは異なる電子受容体の存在下で、
微生物に由来する酵素であり、Ｌ−グロノ−ガンマ−ラ
クトンからＬ−アスコルビン酸への酸化を触媒する、精
製された状態のＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵
素であって、以下の理化学的性質： ａ）基質特異性：Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン及びＤ
−キシロースに高い活性を有し、 ｂ）至適ｐＨ：約７〜８、 ｃ）分子量：１１０，０００±２，０００（それぞれ６
１，０００±１，０００、３２，５００±１，０００及
び１６，５００±５００の分子量を有するフラビンタン
パク質、チトクロームＣタンパク質及び単純タンパク質
を含む３つのサブユニットからなる）、 ｄ）補欠分子族：フラビン、 ｅ）金属イオンの影響：Ｃｕ2+とＭｎ2+は、強い酵素阻
害を示す、 ｆ）電子受容体：酸素とは異なる、 を有するＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素。 - 【請求項２】 酵素が、バクテリアに由来する請求項１
記載のＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素。 - 【請求項３】 微生物が、グルコノバクター（Ｇｌｕｃ
ｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属であり、例えばグルコノバクタ
ー オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘ
ｙｄａｎｓ）であり、例えばグルコノバクター オキシ
ダンス ＤＳＭ ４０２５株と同等の特徴を有するもの
である請求項１または２に記載のＬ−グロノ−ガンマ−
ラクトン脱水素酵素。 - 【請求項４】 微生物が、グルコノバクター オキシダ
ンス ＤＳＭ ４０２５に対応するか、その機能的同等
物、継代培養物、突然変異株もしくは誘導体である請求
項３に記載のＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵
素。 - 【請求項５】 細胞内に請求項１、２、３又は４のいず
れか１つに記載のＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素
酵素を生産しうる微生物を培養し、細胞を破壊し、破壊
した細胞の無細胞抽出液から単離、精製することを特徴
とするＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の製造
法。 - 【請求項６】 微生物が、グルコノバクター オキシダ
ンス ＤＳＭ ４０２５株と同等の特徴を有する請求項
５に記載のＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の
製造法。 - 【請求項７】 微生物が、グルコノバクター オキシダ
ンス ＤＳＭ ４０２５株、その機能的同等物、継代培
養物、突然変異株もしくは誘導体である請求項６に記載
のＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素の製造法。 - 【請求項８】 請求項１、２、３又は４のいずれか１つ
に記載のＬ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素及び
電子受容体の存在下でＬ−グロノ−ガンマ−ラクトンを
酸化することを特徴とするＬ−アスコルビン酸の製造
法。 - 【請求項９】 バクテリア、それらの無細胞抽出液又は
細胞の可溶性画分の働きによって、請求項１、２、３又
は４のいずれか１つに記載のＬ−グロノ−ガンマ−ラク
トン脱水素酵素によりＬ−グロノ−ガンマ−ラクトンを
酸化することを特徴とするＬ−アスコルビン酸の製造
法。 - 【請求項１０】 アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ）属、グルコノバクター属又はストレプトマイセス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａ）属のバクテリア、それ
らの機能的同等物、継代培養物、突然変異株もしくは誘
導体又はその無細胞抽出液を用いる請求項９記載の製造
法。 - 【請求項１１】 アセトバクター サブオキシダンス
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｏｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）又
はグルコノバクター オキシダンスを用いる請求項１０
記載の製造法。 - 【請求項１２】 基質としてＬ−グロノ−ガンマ−ラク
トンの存在下、培地中、請求項１又は２に記載のＬ−グ
ロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素を生産しうる、グル
コノバクター オキシダンス ＤＳＭ ４０２５株と同
等の特徴を有する微生物、その機能的同等物、継代培養
物、突然変異株もしくは誘導体又はそれから得られた無
細胞抽出液の働きによってＬ−グロノ−ガンマ−ラクト
ンを酸化し、培養液からＬ−アスコルビン酸を分離する
ことを特徴とするＬ−アスコルビン酸の製造法。 - 【請求項１３】 微生物をＬ−グロノ−ガンマ−ラクト
ン及び適当な栄養源を含む培地中で培養する請求項１２
記載の製造法。 - 【請求項１４】 基質濃度が１０ないし１５０ｇ、好ま
しくは約１０ないし１００ｇ／リットルである請求項１
３記載の製造法。 - 【請求項１５】 Ｌ−アスコルビン酸が約３ないし１４
ｇ／リットル以上の濃度で生産される請求項１４記載の
製造法。
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