DE69133494T2

DE69133494T2 - Microbiologische Herstellung von L-Ascorbinsäure

Info

Publication number: DE69133494T2
Application number: DE69133494T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Kamakura-shi Hoshino; Peter Karl Matzinger; Setsuko Fujisawa-shi Ojima; Teruhide Yokohama-shi Sugisawa
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1990-09-17
Filing date: 1991-09-05
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2011-09-06
Also published as: EP0911415A2; EP0911415A3; EP0476442A3; DE69133494D1; EP0476442A2; ATE312193T1; ATE180831T1; DE69131286D1; JPH04281785A; EP0911415B1; DK0476442T3; JP3086301B2; CN1060111A; EP0476442B1; US5250428A; CN1209463C; DE69131286T2; CN1054637C; CN1274756A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren für die mikrobiologische Herstellung von L-Ascorbinsäure aus L-Gulono-gamma-lacton.
Wie vorstehend ausgewiesen, katalysiert die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte neue L-Gulono-gamma-lactondehydrogenase (nachstehend als GLDH bezeichnet) die Oxidation von L-Gulono-gamma-lacton zu L-Ascorbinsäure.
Enzyme, die die Oxidation von L-Gulono-gamma-lacton (I) zu L-Ascorbinsäure (II)
katalysieren, sind bekannt. Nishikimi et al. isolierten L-Gulono-gamma-lactonoxidase aus Rattenleber (Arch. Biochem. Biophy., 175, 427–435, 1976), Ziegenleber (Arch. Biochem. Biophy., 175, 427–435, 1976) und Hühnerniere (Biochemistry, 21, 5076–5082, 1982). Diese Enzyme nutzen molekularen Sauerstoff als direkten Elektronenakzeptor bei der Oxidation von I zu II – die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte GLDH allerdings nicht. Darüber hinaus bestehen viele von ihnen aus einer Untereinheit, während das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte GLDH aus drei Arten von Untereinheiten besteht. Nishikimi et al. isolierten auch L-Galactono-gamma-lactonoxidase aus Bäckerhefe (Arch. Biochem. Biophy., 191, 479–486, 1978). Dieses Enzym katalysiert die Oxidation von so wohl L-Galactono-gamma-lacton als auch L-Gulono-gamma-lacton zu L-Ascorbinsäure. Andererseits isolierten Bleeg et al. L-Galactono-gamma-lactonoxidase aus Saccharomyces cerevisiae (Eur. J. Biochem., 127, 391–396, 1982). Von diesem Enzym wurde mitgeteilt, dass es auf L-Galactono-gamma-lacton, jedoch nicht auf L-Gulono-gamma-lacton aktiv ist. Jedoch kann die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte GLDH nicht L-Galactono-gamma-lacton als ihr Substrat nutzen.
Somit unterscheidet sich die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte GLDH deutlich von L-Galactono-gamma-lactonoxidase von Hefe in ihrer Substratspezifität. Andererseits berichteten Shigeoka et al. über die Eigenschaften von ungereinigter L-Gulono-gamma-lactondehydrogenase von Euglena gracilis z (Agric. Biol. Chem., 43, 2187–2188, 1979); d.h. das Enzym katalysierte die Oxidation von sowohl L-Gulono-gamma-lacton als auch L-Galactono-gamma-lacton und war nicht in der Lage, Sauerstoff als Elektronenakzeptor zunutzen. Weiterhin ist es Allgemeinwissen, dass Algen auf Grund Problemen, denen man beim Züchten dieser Mikroorganismen (Fragilität, Zellteilung und lange Zeiträume, die einbezogen sind) begegnet, schwierig zu handhaben sind.
Die neue, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte GLDH unterscheidet sich deutlich in ihrer Substratspezifität. Außerdem gibt es bislang keine Mitteilung über die Isolierung von L-Gulono-gamma-lactondehydrogenase aus Euglena gracilis z.
Es gab bislang keine Mitteilungen über die Umwandlung von L-Gulono-gamma-lacton zu L-Ascorbinsäure unter Anwendung von Bakterien. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde jedoch gefunden, dass Bakterien L-Ascorbinsäure aus L-Gulono-gamma-lacton erzeugen können. Dies ist die erste Möglichkeit für eine solche Erzeugung von L-Ascorbinsäure aus L-Gulono-gamma-lacton durch Nutzen von Bakterien.
Wie vorstehend beschrieben, gibt es keine Offenbarung eines gereinigten Enzyms, beispielsweise bakteriellen Ur sprungs, welches Dehydrogenaseaktivität zum Oxidieren von L-Gulono-gamma-lacton zu L-Ascorbinsäure aufweist. Es wurde gefunden, dass das gereinigte Enzym, beispielsweise aus der löslichen Fraktion von Bakterienzellen von speziellen Mikroorganismen isoliert, die Oxidation von L-Gulono-gamma-lacton zu L-Ascorbinsäure katalysiert. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieses Auffindens ausgeführt.
Wie ausgewiesen, ist es eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure durch Fermentation mit Hilfe von Bakterien bereitzustellen.
Die physiko-chemischen Eigenschaften der gereinigten neuen GLDH, beispielsweise wie nachstehend beispielhaft ausgeführt, sind wie nachstehend:
1) Enzymaktivität:
Die erfindungsgemäße neue GLDH katalysiert die Oxidation von L-Gulono-gamma-lacton zu L-Ascorbinsäure in Gegenwart eines Elektronenakzeptors gemäß den nachstehenden Reaktionen:
L-Gulono-gamma-lacton + Elektronenakzeptor
L-Ascorbinsäure + reduzierten Elektronenakzeptor
Das Enzym nutzt keinen Sauerstoff als Elektronenakzeptor. Dies wurde durch fehlende katalytische Aktivität des Enzyms zum Umwandeln von L-Gulono-gamma-lacton zu L-Ascorbinsäure bei Verwendung von Sauerstoff als dem Elektronenakzeptor bestätigt. Weiterhin wurde in dem Reaktionsgemisch mit einer Sauerstoffsonde kein Sauerstoffverbrauch nachgewiesen. Jedoch kann jede übliche Verbindung, die als ein Elektronenakzeptor wirken kann, in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Enzym verwendet werden. Als solcher Elektronenakzeptor kann ein Coenzym, oder eine Verbindung, die solche Coenzymfunktion zeigt, beispielsweise 2,6-Dichlorphenolindophenol (nachstehend als DCIP bezeichnet), Phenazinmethosulfat, Wurster's Blau, Hexacyanoferrat(II), Coenzym Q, oder Cytochrom c, usw., verwendet werden.
Das Enzymassay wurde spektrophotometrisch bei 25°C durch Messen der Abnahme der Extinktion von DCIP bei 600 nm ausgeführt. Eine Einheit von Enzymaktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die die Reduktion von 1 μMol DCIP pro Minute katalysiert. Der Extinktionskoeffizient von DCIP bei pH 7,0 wurde als 14,5 mM^–1 festgestellt. Eine Küvette mit 1 cm Lichtweglänge enthielt 0,16 mM DCIP, 1,6 mM Phenazinmethosulfat, 200 mM Kaliumphosphatpuffer, 400 mM L-Gulono-gamma-lacton, Enzymlösung und Wasser in einem Endvolumen von 0,5 ml. Eine Bezugsküvette enthielt alle Komponenten, ausgenommen L-Gulono-gamma-lacton. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von L-Gulono-gamma-lacton gestartet. Die Enzymaktivität wurde als die anfängliche Reduktionsgeschwindigkeit von DCIP gemessen.
2) Substratspezifität:
Die Substratspezifität des Enzyms wurde unter Verwendung des gleichen, wie vorstehend beschriebenen Enzymassayverfahrens bestimmt, ausgenommen, dass die verschiedenen Substratlösungen (400 mM) anstelle von L-Gulono-gamma-lacton verwendet wurden. Die Messergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Die GLDH ist sehr aktiv für L-Gulono-gamma-lacton und D-Xylose und wenig aktiv für D-Glucurono-gamma-lacton, D-Glucose und D-Mannose.
3) Optimaler pH-Wert:
Die Korrelation zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit der GLDH und dem pH-Wert wurde unter Verwendung des wie vorstehend unter 1) beschriebenen, gleichen Enzymassayverfahrens bestimmt, mit der Ausnahme, dass verschiedene pH-Puffer verwendet wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Das Enzym zeigte die höchste Enzymaktivität in einem pH-Bereich zwischen 7,0 und 8,0.
4) pH-Stabilität:
Das gereinigte Enzym wurde in Puffern mit verschiedenem pH-Wert für 192 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Die Restaktivität wurde unter Anwendung des gleichen, wie unter 1) beschriebenen Enzymassayverfahrens gemessen. Die Messergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Das gereinigte Enzym war bei jeglichem pH-Wert zwischen 6,5 und 9,2 relativ stabil.
5) Wärmestabilität:
Das gereinigte Enzym wurde 5 Minuten bei verschiedenen Temperaturen in 200 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) behandelt und dann sofort in Eiswasser gekühlt. Die Restaktivität wurde unter Anwendung des gleichen, wie unter 1) beschriebenen Enzymassayverfahrens gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Das gereinigte Enzym war bis zu 30°C stabil und verlor etwa 50 und 80% seiner Aktivität nach Inkubation bei 55° bzw. 60°C.
6) Optimale Temperatur:
Die Enzymaktivitäten von GLDH wurden bei Temperaturen von 25 bis 55°C durch das gleiche, wie unter 1) beschriebene Enzymassayverfahren gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt. Das Enzym hatte in dem untersuchten keinen ausgeprägten optimalen Temperaturbereich.
7) Molekulargewicht:
Das Molekulargewicht der GLDH wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie, unter Verwendung einer Größenausschluss-Gelsäule (TSK Gel G3000 SW × L Säule, 7,8 mm × 30 cm), ins Gleichgewicht gebracht mit 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 300 mM Natriumchlorid, bestimmt. Als Molekulargewichtsstandards wurden Cyanocobalamin (M.W. 1 350), Myoglobin (M.W. 17 000), Ovalbumin (M.W. 44 000), gamma-Globulin (M.W. 158 000) und Thyroglobulin (M.W. 670 000) ver wendet. Das Molekulargewicht der GLDH wurde mit 110 000 ± 2 000 bestimmt.
Nun wurden Untereinheitskomponenten der gereinigten GLDH bestimmt. Die gereinigte GLDH wurde mit Natriumdodecylsulfat (nachstehend als SDS bezeichnet) in Gegenwart von beta-Mercaptoethanol behandelt und auf die gleiche, wie vorstehend beschriebene, Säule aufgetragen, die mit 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,1% SDS, ins Gleichgewicht gebracht wurde. Als Molekulargewichtsstandards wurden Lysozym (M.W. 14 000), Sojabohnentrypsininhibitor (M.W. 21 500), Carbonanhydrase (M.W. 31 000), Ovalbumin (M.W. 45 000), Rinderserumalbumin (M.W. 66 200) und Phosphorylase B (M.W. 92 500) verwendet. Das Enzym bestand aus drei Untereinheiten, deren Molekularqewichte 61 000, 32 500 und 16 500 waren. Die Summe dieser Molekulargewichte ist 110 000, das gesamte Molekulargewicht von nativer GLDH.
Die größte Komponente (M.W. 61 000) ist möglicherweise ein Flavoprotein, da es nach Gelelektrophorese in SDS intensive Fluoreszenz zeigte, wenn das nicht angefärbte Gel Ultraviolettlicht ausgesetzt wurde. Die zweite Komponente (M.W. 32 500), die mit Häm angefärbt wurde, ist ein Cytochrom.
Die dritte Verbindung (M.W. 16 500 ± 500) ist ein einfaches Protein; d.h. ein Protein, das keine prostethische Gruppe trägt. Zusammenfassend sind die entsprechenden Molekulargewichte
61 000 ± 1 000
32 500 ± 1 000
16 500 ± 500
Die Standardabweichungen wurden durch übliche Mittel, beispielsweise SDS-Elektrophorese, bestimmt.
Das Häm-Anfärben des vorstehenden Elektrophoresegels wurde gemäß dem von P.E. Thomas et al. in Analytical Biochemistry 75, 168–176 (1976) beschriebenen Verfahren ausgeführt, welches wie nachstehend zusammengefasst werden kann:
Eine 6,3 mM 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-(TMBZ)-Lösung wurde in Methanol frisch hergestellt. Unmittelbar vor der Verwendung wurden 3 Teile der TMBZ-Lösung mit 7 Teilen 0,25 M Natriumacetat, pH 5,0, vermischt. Das Gel wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 Stunden unter gelegentlichem Mischen in dieses Gemisch eingetaucht. H₂O₂ wurde zu einer Endkonzentration von 30 mM hinzugesetzt, um die zweite Proteinkomponente, die ein Cytochrom einschließt, anzufärben.
8) Absorptionsspektrum:
Das Absorptionsspektrum der gereinigten GLDH, reduziert mit Natriumdithionit, zeigte Maxima bei 416, 521 und 552 nm im sichtbaren Bereich, was das Vorliegen einer Cytochrom-c-Komponente, wie in 1 gezeigt, ausweist.
9) Messen des Km-Werts:
Unter Anwendung des gleichen, wie vorstehend beschriebenen Enzymassayverfahrens wurde die Geschwindigkeit der Oxidationsreaktion unter Variieren der Konzentrationen von L-Gulono-gamma-lacton von 0,18 mM bis 90 mM gemessen, um den Km-Wert für L-Gulono-gamma-lacton zu bestimmen. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit wurde mit der Substratkonzentration von etwa 71,8 mM gefunden. Die scheinbare Michaelis-Konstante (Km) wurde mit 34,8 mM, mit DCIP als dem Elektronenakzeptor, berechnet.
10) Wirkung auf Metallionen:
Unter Anwendung des gleichen, wie unter 1) beschriebenen Enzymassayverfahrens wurde die Wirkung von verschiedenen Metallionen auf die Enzymaktivität geprüft. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt. Cu²⁺ und Mn²⁺ zeigten starke Inhibierung des Enzyms.
11) Wirkung von Inhibitoren:
Unter Anwendung des gleichen, wie vorstehend beschriebenen Enzymassayverfahrens wurde die Wirkung von verschiedenen Inhibitoren auf die Enzymaktivität geprüft. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt. Keine getesteten Verbindungen ergaben eine inhibitorische Wirkung auf die GLDH.
12) Reinigungsverfahren:
Reinigung von L-Gulono-gamma-lactondehydrogenase wird durch die Kombination von bekannten Reinigungsverfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, Flüssigchromatographie, Adsorptionschromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Gel-Elektrophorese, Aussalzen und Dialyse, bewirkt.
Die angewendeten Mikroorganismen schließen alle Stämme, die zur Gattung Gluconobacter gehören, welche gutes Wachstum, wenn in Gegenwart von Bacillus megaterium gezüchtet, zeigen, ein. Mutanten und Varianten des Mikroorganismus können in der vorliegenden Erfindung auch angewendet werden. Der bevorzugte Stamm ist Gluconobacter oxydans.
Die Stämme wurden denominiert und als Gluconobacter oxydans, mit Bezug auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1974, und insbesondere im Hinblick auf die Tatsache, dass sie die nachstehenden Eigenschaften zeigen, klassifiziert:

a) 2-Keto-L-gulonsäure wird aus L-Sorbose erzeugt,
b) Ethanol wird zu Essigsäure oxidiert,
c) D-Glucose wird zu D-Gluconsäure und 2-Keto-D-gluconsäure oxidiert,
d) Ketogenese von Polyalkoholen,
e) Membran- und Ringwachstum in Mannitbrühe (24 Stunden Züchtung) bei pH 4 und 5, und Membranwachstum in D-Glucosebrühe bei pH 9,5.

Außerdem zeigen sie die nachstehenden Eigenschaften:

f) Dihydroxyaceton wird im Wesentlichen nicht aus Glycerin erzeugt,
g) 2-Keto-D-glucarsäure wird aus D-Sorbit und D-Glucarsäure hergestellt, jedoch nicht aus D-Glucose, D-Fructose, D-Gluconsäure, D-Mannit oder 2-Keto-D-gluconsäure,
h) polymorph, keine Flagella beobachtet,
i) ein braunes Pigment wird aus D-Fructose hergestellt,
j) gutes Wachstum, wenn in Gegenwart von Bacillus megaterium oder einem Zellextrakt davon gezüchtet,
k) Streptomycin-empfindlich.

Der spezifische und bevorzugte Gluconobacter oxydans-Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen unter DSM 4025 am 17. März 1987 hinterlegt.
Die Zellen des Gluconobacter oxydans-Stamms sind stabförmig mit runden Enden. Der Durchmesser einer Zelle des Gluconobacter oxydans-Stamms ist im Durchschnitt etwa 0,3–0,6 μm, seine Länge etwa 0,9–1,6 μm, hauptsächlich 1–1,5 μm.
Für die Zubereitung der GLDH kann der Mikroorganismus in einem wässrigen Medium, ergänzt mit geeigneten Nährmitteln, unter aerober Bedingung, gezüchtet werden. Die Züchtung kann bei einem pH-Wert zwischen etwa 4,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen etwa 6,0 und 8,0, durchgeführt werden. Obwohl der Züchtungszeitraum in Abhängigkeit von pH-Wert, Temperatur und angewendetem Nährmittelmedium variiert, werden gewöhnlich 2 bis 5 Tage bevorzugte Ergebnisse hervorbringen. Ein bevorzugter Temperaturbereich zum Ausführen der Züchtung ist etwa 13 bis 36°C, vorzugsweise 18 bis 33°C.
Es wird gewöhnlich erforderlich sein, dass das Kulturmedium solche Nährmittel, wie assimilierbare Kohlenstoffquellen, verdaubare Stickstoffquellen und anorganische Substanzen, Vitamine, Spurenelemente und andere Wachstum fördernde Faktoren, enthält. Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können L-Sorbose, Glycerin, D-Glucose, D-Mannit, D-Fructose, D-Arabit und dergleichen verwendet werden. Verschiedene organische oder anorganische Substanzen können auch als Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Casein, Maisquellwasser, Harnstoff, Aminosäuren, Nitrate, Ammoniumsalze und derglei chen, verwendet werden. Als anorganische Substanzen kann Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Eisen(II)- und Eisen(III)chlorid, Calciumcarbonat und dergleichen verwendet werden.
Nachstehend wird eine Ausführungsform zur Isolierung und Reinigung der GLDH aus den vorstehend ausgewiesenen Mikroorganismen nach der Züchtung kurz beschrieben.

(1) Zellen werden aus der Fermentationsbrühe durch Zentrifugierung oder Filtration geerntet.
(2) Die Zellen werden in der Pufferlösung suspendiert und mit Hilfe eines Homogenisators, Ultraschallgeräts oder durch Behandlung mit Lysozym oder dergleichen aufgebrochen, unter Gewinnung einer Lösung von aufgebrochenen Zellen.
(3) Die GLDH wird isoliert und aus dem zellfreien Extrakt von aufgebrochenen Zellen, vorzugsweise aus der löslichen Fraktion von Mikroorganismen, gereinigt.

Bei diesen Schritten verwendet man vorzugsweise Säulenchromatographie, beispielsweise

1) DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie,
2) Q-Sepharose-Säulenchromatographie,
3) Hydroxylapatit-Säulenchromatographie,
4) Sephacryl S-300-Säulenchromatographie,
5) Polyacrylamid-Gelelektrophorese, usw.

Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte GLDH ist als Katalysator für die Erzeugung von L-Ascorbinsäure aus L-Gulono-gamma-lacton verwendbar. Diese Reaktion sollte bei pH-Werten von etwa 6,0 bis 9,0, in Gegenwart eines Elektronenakzeptors, beispielsweise DCIP, PMS, Wurster's Blau, Hexacyanoferrat(III), Coenzym Q, Cytochrom c und dergleichen, in einem Lösungsmittel, wie McIlvaine-Puffer, Kaliumphosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer und dergleichen, durchgeführt werden.
Ein bevorzugter Temperaturbereich zum Ausführen der Reaktion ist etwa 25 bis 55°C. Wenn der pH-Wert und die Temperatur bei etwa 7,0–8,0 bzw. 30–50°C eingestellt sind, bringt die Reaktion gewöhnlich die bevorzugtesten Ergebnisse hervor. Die Konzentration von L-Gulono-gamma-lacton als Substrat in einem Lösungsmittel variiert in Abhängigkeit von anderen Reaktionsbedingungen, jedoch ist es im Allgemeinen erwünscht, dass sie etwa 10–150 g/l, besonders bevorzugt etwa 10–100 g/l, beträgt.
Für diese Reaktion kann das Enzym in einem immobilisierten Zustand mit einem geeigneten Träger eingesetzt werden. Beliebige Mittel zum Immobilisieren von Enzym, die im Allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannt sind, können verwendet werden. Beispielsweise kann das Enzym direkt an eine Membran, Granulat oder dergleichen eines Harzes mit funktioneller/funktionellen Gruppe(n) gebunden sein, oder es kann durch Brückenverbindungen mit bifunktioneller/bifunktionellen Gruppe(n), beispielsweise Glutaraldehyd, an das Harz gebunden sein.
Hinsichtlich des Fermentationsverfahrens sind die nachstehenden Parameter anzuwenden bzw. das Verfahren wird geeigneterweise gemäß der nachstehenden Vorgehensweise ausgeführt: ein Mikroorganismus mit der Fähigkeit, II herzustellen, wird in einer wässrigen Nährmittellösung in Gegenwart von Verbindung I gezüchtet, oder wird nach ihrem Wachstum in Kontakt mit I in eine Pufferlösung gebracht und dann weiter inkubiert.
Beispiele für Mikroorganismen sind: z.B.
Bakterien, beispielsweise der Gattung:
Acetobacter, beispielsweise Acetobacter suboxydans (DSM 5935) [Hinterlegungsdatum: 5. Mai 1990), Acetobacter oxydans (DSM 5936) [5. Mai 1990), Acetobacter melanogenus (NCIMB 8086);
Gluconobacter, beispielsweise Gluconobacter oxydans (ATCC 621),
Gluconobacter oxydans (DSM 4025).
Weitere geeignete Bakterien sind: z.B.
Actinomyces, beispielsweise von der Gattung Streptomyces, wie Streptomyces antibioticus (ATCC 8633), Streptomyces eurocidicus (ATCC 19551), Streptomyces lavendulae (DSM 5926) [5. Mai 1990], Streptomyces olivaceus (ATCC 3335), Streptomyces netropsis (NRRL 2268).

NRRL: = Northern Utilization Research and Development Division of U.S.D.A., Peoria, Illinois. USA
ATCC: = American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA
NCIMB: = National Collection of Industrial + Marine Bakterien, Torry Research Station; Aberdeen AB 9 8DG, Schottland
DSM: = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig

Speziell ausgewählt für die Reaktion wurden Arten der Gattung Acetobacter und Gluconobacter, speziell die Stämme Acetobacter suboxydans und Gluconobacter oxydans. Diese Stämme wurden als Vorsichtsmaßnahme für das Verfahren hinterlegt.
Es ist verständlich, dass alle gemäß der Erfindung verwendeten Mikroorganismen vorzugsweise in einem Nährmedium wachsen sollten, bevor sie für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Ihr Wachstum ist in wässrigem Medium möglich.
Das Nährmedium mit dem Wachstumsmikroorganismus kann direkt für die Fermentationsreaktion verwendet werden.
Die Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Reaktionsmediums kann viel einfacher sein, beispielsweise eine Lösung von Edukt I, kombiniert mit den getrennt wachsenden Mikroorganismen in einer Pufferlösung, ohne jede andere Zusätze.
Der pH-Wert des Mediums sollte vorzugsweise zwischen 2 und 9, bevorzugter ca. 4–7, liegen. Falls erwünscht, kann der pH-Wert durch ein Puffersystem eingestellt werden.
Für optimale Ausbeuten ist es bevorzugt, das Edukt in einer Konzentration zwischen ca. 1 und ca. 10% (pro Gewicht) zu verwenden.
Die bevorzugte Fermentationszeit liegt zwischen 2 und 100 Stunden, insbesondere zwischen 4 und 72 Stunden. Ein Zuführen von Edukt I kann die Fermentationszeit verlängern.
Es ist verständlich, dass die Oxidation einen aerobes Vorgang darstellt. Diese Bedingungen werden durch starkes Schütteln oder Rühren des Reaktionsmediums unter Luft oder unter zusätzlicher Belüftung erfüllt.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung von L-Gulono-gamma-lactondehydrogenase
(1) Züchtung von Gluconobacter oxydans DSM 4025
Gluconobacter oxydans DSM 4025 wurde auf einem Agarschrägmedium, enthaltend Mannit 5,0%, MgSO₄·7H₂O 0,25%, Maisquellwasser 1,75%, Bäckerhefe 5,0%, Harnstoff 0,5%, CaCO₃ 0,5% und Agar 2,0% bei 27°C für 4 Tage wachsen lassen. Eine Schleife voll Agarschrägkultur von Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 wurde in 50 ml eines Impfkulturmediums, enthaltend L-Sorbose 8,0%, Glycerin 0,05%, Harnstoff 0,5%, MgSO₄·7H₂O 0,25%, Maisquellwasser 1,75%, Bäckerhefe 5,0% und CaCO₃ 1,5% in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert und bei 30°C für 1 Tag an einem Rotationsschüttler (180 U/min) gezüchtet. Fünf ml dieser Kultur wurden in 50 ml des gleichen Mediums in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben überführt und in der gleichen, wie vorstehend beschriebenen Weise gezüchtet. Zwei Liter der so hergestellten Impfkultur wurden als ein Inokulum für ein 30 l-Fermentergefäß, enthaltend 20 Liter Medium, enthaltend L-Sorbose 8,0%, Glycerin 0,05%, Harnstoff 1,2%, MgSO₄·7H₂O 0,25%, Maisquellwasser 3,0%, Bäckerhefe 5,0% und CaCO₃ 1,5%, verwendet. Das Fermentergefäß wurde bei 30°C mit 400 U/min Bewegung und 0,5 VVM (Volumen Luft/Volumen Medium/Minute) zur Belüftung arbeiten lassen. Nach 40 Stunden Fermentation wurde die Kulturbrühe bei 1 500 U/min für 10 Minuten zum Entfernen von Calciumcarbonat zentrifugiert, dann bei 8 000 U/min (10 000 × G) die Zellen pelletisiert bzw. sedimentiert. Der Zellkuchen wurde mit 0,85 NaCl-Lösung einmal gewaschen. Aus 20 Liter der Brühe wurden etwa 100 g (Feuchtgewicht) der Zellen erhalten.
(2) Herstellung der löslichen Fraktion
Die Zellen von Gluconobacter oxydans DSM 4025 (95 g, Feuchtgewicht) aus dem vorstehenden Schritt (1) wurden zweimal mit 0,85%iger NaCl-Lösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 380 ml 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und die Zellsuspension wurde mit einem French-press-Homogenisator bei 1 500 kg/cm² homogenisiert. Zelldebris wurde durch Zentrifugierung bei 1 800 × G für 10 Minuten entfernt und dann wurde der Überstand (nachstehend als zellfreier Extrakt bezeichnet) bei 100 000 × G für 60 Minuten zentrifugiert. Der erhaltene Überstand (450 ml) wurde als die lösliche Fraktion der Zellen von Gluconobacter oxydans DSM 4025 gesammelt.
(3) Diethylaminoethyl- (nachstehend als DEAE bezeichnet) -Cellulosesäulenchromatographie
Die in dem vorangehenden Schritt erhaltene lösliche Fraktion (450 ml) wurde gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert. Das Dialysat (500 ml) wurde auf eine DEAE-Cellulosesäule (2,5 × 120 cm), äquilibriert mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), aufgetragen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und dann mit dem gleichen Puffer, enthaltend 0,25 M NaCl, gewaschen. Die GLDH wurde mit dem gleichen, 0,5 M NaCl enthaltenden Puffer eluiert.
(4) Q-Sepharose-Säulenchromatographie
Die vereinigte aktive Fraktion (200 ml) aus dem vorangehenden Schritt wurde gegen zwei Chargen von 2 Litern 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und auf eine Q-Sepharosesäule (2,5 × 50 cm), äquilibriert mit dem gleichen Puffer, aufgetragen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen, die GLDH wurde mit dem linearen Gradienten von NaCl von 0,3 M bis 0,5 M eluiert.
(5) Hydroxylapatit-(Bio-Gel HTP)-Säulenchromatographie
Die vereinigte aktive Fraktion (210 ml) aus dem vorangehenden Schritt wurde gegen zwei Chargen von 2 Litern 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und auf eine Hydroxylapatitsäule (2,5 × 25 cm), äquilibriert mit dem gleichen Puffer, aufgetragen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und die GLDH wurde mit dem Lineargradienten von Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) von 10 mM bis 40 mM eluiert. Fraktionen mit Enzymaktivität wurden vereinigt und auf etwa 20 ml durch Ultrafiltration, unter Anwendung eines Ultrafilters (pM10, Amicon) aufkonzentriert.
(6) Sephacryl S-300-Säulenchromatographie
Eine Portion der Enzymfraktion (2 ml) aus dem vorangehenden Schritt wurde auf eine Sephacryl S-300-Säule (1,0 × 100 cm), äquilibriert mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 50 mM NaCl, aufgetragen und mit dem gleichen Puffer entwickelt. Die elektrophoretisch homogene GLDH enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bei –80°C gelagert.
Unter Verwendung der wie vorstehend beschriebenen Reinigungsschritte wurde die GLDH etwa 900-fach gereinigt. Eine Zusammenfassung der Reinigungsschritte der GLDH wird in Tabelle 8 gezeigt.
(7) Reinheit des isolierten Enzyms
Um die Reinheit der isolierten GLDH zu schätzen, wurde Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Abtrenngel: 10% Polyacrylamid; Bedingungen der Elektrophorese: 20 mA bei 4°C für 6 Stunden) ausgeführt. Das Enzym ergab eine einzelne Bande, angefärbt durch Coomassie brilliant blue R-250. Die Proteinbande zeigte GLDH-Aktivität, wenn nicht angefärbtes Gel in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 50 mM L-Gulono-gamma-lacton, 20 μg/ml Nitroblautetrazolium und 40 μg/ml Phenazinmethosulfat, für 20 Minuten getaucht wurde.
(8) Identifizierung des Reaktionsprodukts
Das 0,5 ml der gereinigten GLDH (7,5 μg, 469 Einheiten/mg Protein), 1,0 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 0,1 g L-Gulono-gamma-lacton, 0,1 ml 10 mM Phenazinmethosulfat und Wasser zu einem Endvolumen von 2,0 ml enthaltende Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 30°C inkubiert. Das Reaktionsprodukt wurde durch sowohl Dünnschichtchromatographie als auch Hochleistungsflüssigchromatographie analysiert. Die Dünnschichtchromatographie erfolgte wie nachstehend: eine Probe (1 μl) wurde auf eine Kieselgelplatte (Merck, USA) punktmäßig aufgetragen, mit einem Lösungsmittelsystem von n-Propanol-Wasser-1%ige Phosphorsäure-Ameisensäure (400:100:10:1) bei Raumtemperatur 2 Stunden entwickelt. Die Platte wurde dann getrocknet und unter einer Ultraviolettlampe beobachtet. Das Produkt wurde als UV-Absorptionsfleck bei einem Rf-Wert von etwa 0,7 gefunden, was einer authentischen Probe von L-Ascorbinsäure entsprach. Hochleistungsflüssigchromatographie wurde wie nachstehend ausgeführt: eine Probe wurde auf eine LiChrosorb NH₂-Säule (Merck, USA, 0,4 × 25 cm), äquilibriert mit einem Lösungsmittelsystem von Acetonitril-Wasser-Essigsäure 87:11:2, aufgetragen. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 3,0 ml/min eingestellt und der Nachweis von Produkten erfolgte bei 254 nm. Im Ergebnis eluierte das Produkt zur gleichen Retentionszeit wie eine authentische Probe von L-Ascorbinsäure.
Folglich wurde das Produkt als L-Ascorbinsäure identifiziert.
Die Produktivität von L-Ascorbinsäure war 0,71 g/l/Stunde.
Beispiel 2
L-Ascorbinsäureerzeugung aus L-Gulono-gamma-lacton durch Fermentation (wachsende Zelle).
Eine 200 ml-Impfkultur von Gluconobacter oxydans DSM 4025, hergestellt in der gleichen, wie vorstehend in Beispiel 1-(1) beschriebenen Weise wurde verwendet, um 2 Liter Medium, das L-Gulono-gamma-lacton 8%, Glycerin 0,05%, Bäckerhefe 5,0%, MgSO₄·7H₂O 0,25%, Maisquellwasser 1,75%, Harnstoff 0,5% und CaCO₃ 1,5% (der Anfangs-pH-Wert eingestellt auf 7,0) enthielt, in einem 3-l-Gefäßfermenter verwendet. Die Fermentation wurde bei 30°C, 700 U/min zur Bewegung und 0,5 VVM zur Belüftung durchgeführt. Wie in Tabelle 9 gezeigt, wurden 8,6 g/l L-Ascorbinsäure in 66 Stunden Fermentation hergestellt.
Beispiel 3
L-Ascorbinsäureerzeugung aus L-Gulono-gamma-lacton unter einem ruhenden Zellsystem.
Die Zellen von Gluconobacter oxydans DSM 4025, hergestellt in der gleichen wie in Beispiel 1-(1) beschriebenen Weise, 0,1 g bis 0,67 g, wurden in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 47,6 mg/ml oder 89,3 mg/l L-Gulono-gamma-lacton in einem Gesamtvolumen von 3 ml, gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden bei 30°C, unter Schütteln (280 U/min), inkubiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 10 gezeigt. Die höchste Produktivität von L-Ascorbinsäure war 20 mg/Stunde/g-Zelle. Und die höchste Ausbeute von L-Ascorbinsäure war 13,92 g/l.
Beispiel 4
L-Ascorbinsäureerzeugung aus L-Gulono-gamma-lacton, unter Verwendung des zellfreien Extrakts von Gluconobacter oxydans DSM 4025.
Das Reaktionsgemisch, enthaltend 1,0 ml zellfreien Extrakt (Proteingehalt: 10,3 mg/ml) Gluconobacter oxydans DSM 4025, wurde in der gleichen wie in Beispiel 1-(1) und -(2) beschriebenen Weise hergestellt. 1 ml von 0,5 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) und 0,5 ml 17,8% L-Gulono-gamma-lacton wurde 17,5 Stunden bei 30°C inkubiert. Als ein Ergebnis wurden 2,19 g/l L-Ascorbinsäure hergestellt.
Beispiel 5
(wachsendes Zellsystem).
Das Bakterium Acetobacter suboxydans (DSM 5935) wird auf einer Agarschrägkultur in Medium 1 (Zusammensetzung: 50% Hefewasser, 5% Mannit, in Leitungswasser, eingestellt auf pH 6,5) wachsen lassen. Nach 2 Tagen Inkubation bei 30°C wurde eine Schleife voll Zellen zum Inokulieren von 5 ml flüssigem Medium 1 (die gleiche Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben, jedoch ohne Agar) verwendet. Das Röhrchen wird bei 30°C mit 220 U/min für 3 Tage geschüttelt. 1 ml Vorkultur wird verwendet, um 100 ml Medium 1, zusammen mit 1 g Edukt I, zu inokulieren. Die Kolben werden bei 30°C mit 220 U/min geschüttelt. Das Verfahren wurde nach 72 Stunden beendet. Gemäß den analytischen Bestimmungen wurden 3% Edukt I zu Produkt II umgewandelt.
Beispiel 6
(ruhendes Zellsystem).
Das Bakterium Acetobacter suboxydans (DSM 5935) wird wie vorstehend beschrieben wachsen lassen. Die 100 ml-Kulturen werden durch Zentrifugierung (10 000 U/min, 10 min) geerntet und in Kunststofffläschchen über flüssigem Stickstoff gefroren. 100 ml-Kolben mit Medium 1 werden mit 0,5 ml aus jedem der Fläschchen inokuliert, bei 30°C bei 220 U/min geschüttelt und 1 g Edukt I wird gleichzeitig zugesetzt. Gemäß den analytischen Bestimmungen wird 10% des Edukts I in Produkt II innerhalb 72 Stunden überführt.
Beispiel 7
(ruhendes Zellsystem).
Das Bakterium Acetobacter suboxydans (DSM 5935) wird wie in Beispiel 6 beschrieben wachsen lassen. Die 100 ml-Kulturen, inokuliert mit 0,5 ml der Fläschchen, dient als eine Vorkultur für eine weitere Wachstumskultur in dem gleichen Medium. Diese Kolben mit 100 ml Medium 1 werden mit 5 ml Vorkul tur inokuliert und 24 Stunden bei 30°C mit 220 U/min geschüttelt. Die gewachsenen Zellen werden durch Zentrifugierung (10 000 U/min, 10 min) geerntet. 3 g feuchte Zellen (entsprechend den Zellen aus einem Kolben) werden in einer Pufferlösung (pH 6,0, 0,05 M Phosphatpuffer), zusammen mit 0,1 g Edukt I (zugegeben als Pulver), in einem Gesamtvolumen von 10 ml suspendiert. 30% Edukt I wird innerhalb 48 Stunden in Produkt II überführt.
Beispiel 8
(ruhendes Zellsystem).
Das Bakterium Acetobacter suboxydans (DSM 5935) wird an Agarschrägen, wie in Beispiel 1 beschrieben, wachsen lassen. Die Schicht von gewachsenen Zellen wird in 10 ml einer physiologischen NaCl-Lösung (0,9%) suspendiert. Diese Suspension wird verwendet, um 10 Schüttelkolben (100 ml Medium 1) mit jeweils 1 ml zu inokulieren. Die Kolben werden 4 Tage bei 30°C mit 220 U/min inkubiert. Die 10 Kulturen werden verwendet, um einen Blatt-gerührten 10 Liter-Bioreaktor (9 000 ml Medium 1) zu inokulieren. Wachstumsbedingungen: Temperatur: 30°C, Belüftung 0,4 vvm, Rühren 500 U/min. Nach 44 Stunden Wachstum werden die Zellen durch Zentrifugierung (kontinuierliche Zentrifugierung mit 12 000 U/min) geerntet. Die Ausbeute war 21 g feuchte Zellen pro Liter. Die Zellen werden in Portionen tiefgefroren. In dem Beispiel wird 1 g der gefrorenen Zellen schnell aufgetaut und zusammen mit 0,4 g Edukt I zu 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gegeben. Das Gesamtvolumen des Assaygemisches war 5 ml. Gemäß analytischen Bestimmungen wurden 19% I in Produkt II überführt.

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure, wobei das Verfahren Oxidieren von L-Gulono-gamma-lacton mit Hilfe von Bakterien oder deren zellfreien Extrakten oder der löslichen Fraktion der Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, unter Anwenden von Bakterien der Gattung, ausgewählt aus Acetobacter, Gluconobacter und Streptomyces, oder einem zellfreien Extrakt davon.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Acetobacter suboxydans oder Gluconobacter oxydans verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das Oxidieren von L-Gulono-gamma-lacton mit Hilfe von einem Mikroorganismus mit den identifizierenden Eigenschaften des Stamms Gluconobacter oxydans DSM 4025 oder einem zellfreien Extrakt davon in einem Medium, in Gegenwart von L-Gulono-gamma-lacton als Substrat, und Isolieren von L-Ascorbinsäure aus dem Züchtungsmedium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus in einem L-Gulono-gamma-lacton und geeignete Nährmittel enthaltenden Medium gezüchtet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Konzentration des Substrats 10–150 g/l ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Konzentration des Substrats 10–100 g/l ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei L-Ascorbinsäure in einer Konzentration von mehr als 3–14 g/l hergestellt wird.