DE68924761T2

DE68924761T2 - Neue coenzym unabhängige l-sorbosone dehydrogenase.

Info

Publication number: DE68924761T2
Application number: DE68924761T
Authority: DE
Inventors: Akiko Fujiwara; Tatsuo Hoshino; Masako Dai Ohfuna Park Shinjoh
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1988-01-14
Filing date: 1989-01-09
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2009-01-10
Also published as: WO1989006688A2; EP0373181A1; DK454689D0; JPH03500844A; WO1989006688A3; EP0373181B1; DE68924761D1; ATE130030T1; JP2799380B2; DK454689A; US5352599A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Enzym, nämlich L-Sorboson-Dehydrogenase, ein Verfahren zur Herstellung desselben und ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure unter Verwendung dieses Enzyms. Außerdem betrifft die Erfindung gentechnische Verfahren, die ein verbessertes Verfahren zur Klonierung und Expression des Gens dieses Enzyms liefern und transformierte Mikroorganismen, die 2-Keto-L- gulonsäure mit hoher Effizienz erzeugen können.
Die Verbindung 2-Keto-L-gulonsäure (2-KGA) ist ein wichtiges zwischenprodukt bei der Synthese von Ascorbinsäure (Vitamin C). Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen 2-KGA aus D-Sorbit oder L-Sorbose erzeugen, z.B. Mitglieder der Gattungen Acetobacter und Pseudomonas, obwohl die erzeugten Gehalte von 2-KGA geringer als 6 g/l sind (Japanische Patentschrift Nr. 40,154/1976). Allgemein kann der Weg von D-Sorbit zu 2- KGA wie folgt dargestellt werden (Makover et al. 1975, Biotechnol and Bioeng. 17, 1485-1514):
D-Sorbit T L-Sorbose T L-Sorboson T 2-KGA
Reaktionen, um L-Sorboson in 2-KGA unter Verwendung von Mikroorganismen umzuwandeln, sind bekannt. Die 2-KGA-Erzeugung aus L-Sorboson unter Verwendung von zellfreien Extrakten von Mikroorganismen wurde in verschiedenen früheren Publikationen berichtet.
In US-PS Nr. 3,907,639 wurde berichtet, daß Mikroorganismen, die zu den Gattungen Acetobacter, Pseudomonas, Escherichia, Serratia, Bacillus, Staphylococcus, Aerobacter, Alcaligenes, Penicillium, Candida und Gluconobacter gehören, eine solche Umwandlung durchführen können.
Weiterhin berichteten Kitamura et al. (Europ. J. Appl. Microbiol., (2) 1, 1975), daß ein L-Sorboson oxidierendes Enzym in Gluconobacter melanogenes IFO 3293 gefunden wurde, das weder ein Coenzym noch einen Elektronenakzeptor für die Entwicklung der Enzymaktivität benötigte.
Es gibt jedoch bis heute keine Offenbarung über ein gereinigtes Enzym mit der Aktivität, L-Sorboson zu 2-KGA zu oxidieren, das unabhängig von Coenzymen ist, z.B. Nicotinamid- Adenin-Dinucleotid (NAD) oder Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid- Phosphat (NADP) etc.. Es wurde gefunden, daß das aus der Membranfraktion von Zellen spezifischer Mikroorganismen isolierte gereinigte Enzym die Oxidation von L-Sorboson zu 2-KGA unabhängig von Coenzymen, wie NAD und NADP, katalysiert. Die vorliegende Erfindung basiert auf dieser Erkenntnis.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue, von einem Coenzym unabhängige L-Sorboson-Dehydrogenase bereitzustellen, die die Oxidation von L-Sorboson zu 2-KGA katalysiert. Es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen L-Sorboson-Dehydrogenase durch ein Fermentationsverfahren bereitzustellen. Es ist auch eine Aufgabe, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 2-KGA aus L-Sorbone bereitzustellen mit Hilfe der neuen L-Sorboson- Dehydrogenase oder eines Mikroorganismus, der dieses Enzym erzeugt.
Weiterhin ist ein weiterer Aspekt der Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein gentechnisches Verfahren bereitzustellen, das die Herstellung der L-Sorboson-Dehydrogenase mit einem verbesserten Verfahren ermöglicht und auch die Herstellung von 2-KGA aus L-Sorboson unter Verwendung dieses von einem rekombinanten Mikroorganismus erzeugten Enzyms oder unter Verwendung dieses rekombinanten Mikroorganismus durch Fermentation ermöglicht. In dieser Hinsicht sind DNA, die das die neue L-Sorboson-Dehydrogenase kodierende Gen umfaßt, Vektoren und rekombinante Organismen, die diese DNA enthalten auch im Bereich der vorliegenden Erfindung.
Es versteht sich, daß im Hinblick auf die Teilaminosäuresequenzen, die im Zusammenhang mit der DNA, den DNA-Fragmenten, den rekombinanten DNA-Molekülen, den rekombinanten Mikroorganismen und den betroffenen Verfahren angegeben sind, die funktionellen Äquivalente dieser Aminosäuresequenzen, d.h. Äquivalente, die das gleiche Ziel erreichen, auch enthalten sind.

Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pVK 102. Figur 2 zeigt die Restriktionskarten der Plasmide der vorliegenden Erfindung.
Figur 3 zeigt die Restriktionskarte einer DNA, die das strukturelle Gen enthält, das L-Sorboson-Dehydrogenase kodiert.
Figur 4 zeigt die DNA-Sequenz, die L-Sorboson-Dehydrogenase aus Gluconobacter oxydans IFO 12258 kodiert.
Die unterstrichenen Teile zeigen Teilaminosäuresequenzen, die auch durch Aminosäuresequenzanalyse der Peptidfragmente des Enzymproteins bestimmt wurden.
Die neue L-Sorboson-Dehydrogenase der vorliegenden Erfindung ist charakteristisch bezüglich ihrer Unabhängigkeit von Coenzymen wie NAD, NADP, Flavin-Mono-Nucleotid (FMN), Flavin- Adenin-Dinucleotid (FAD) etc. in der Oxidationsreaktion von L-Sorboson zu 2-KGA.
Die Eigenschaften des Enzyms und das Herstellungsverfahren können wie folgt zusammengefaßt werden:

(1) Enzymaktivität

Die L-Sorboson-Dehydrogenase der vorliegenden Erfindung katalysiert die Qxidation von L-Sorboson zu 2-KGA in Gegenwart eines Elektronenakzeptors gemäß der folgenden Gleichung:
L-Sorboson &spplus; Elektronenakzeptor
2-KGA &spplus; reduzierter Elektronenakzeptor
Das Enzym verwertet keinen molekularen Sauerstoff als Akzeptor. Als Akzeptor kann 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCIP), Phenazinmethosulfat, Wurster's Blau, Eisen(III)cyanid, Coenzym Q oder Cytochrom c verwendet werden.
Ein Enzymtest wurde durchgeführt bei 25ºC, indem die Abnahme der Absorption von DCIP bei 600 nm spektrophotometrisch gemessen wurde. Eine Enzymaktivitätseinheit wurde definiert als die Menge an Enzym, die die Reduktion von 1 umol DCIP pro Minute katalysierte.
Der Extinktions-Koeffizient von DCIP bei pH 7,0 wurde mit 9,45 mM&supmin;¹ angenommen. Die Grundreaktionsmischung ist unten gezeigt. Die Mischung wurde direkt vor dem Test hergestellt.

Grundmischung:

0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) enthaltend 0,3 % Triton X-100 6 ml
2,5 mM DCIP 0,45 ml
H&sub2;O 10,35 ml
Eine Küvette mit einem Lichtweg von 1 cm enthielt 0,4 ml der Grundmischung, 20 ul lO mM Phenazinmethosulfat, 10 ul Enzymlösung und 20 ul 110 mM L-Sorbosonlösung in einem Endvolumen von 0,45 ml. Eine Referenzküvette enthält alle Komponenten außer dem Substrat. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe des Substrats. Die Enzymaktivität wurde als Anfangsreduktionsrate von DCIP gemessen.

(2) Substratspezifität

Die Substratspezifität des Enzyms kann bestimmt werden mit dem gleichen Enzymtestverfahren, wie oben unter (1) beschrieben unter Verwendung verschiedener Substratlösungen. Das Enzym der vorliegenden Erfindung katalysiert die Oxidation verschiedener Arten von Aldehydverbindungen, wie in Beispiel 3 später beispielhaft ausgeführt.

(3) Physikalisch-chemische Eigenschaften

Das Enzym der vorliegenden Erfindung hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
a) optimaler pH: etwa 7,0.
b) optimale Temperatur: etwa 30 bis etwa 40ºC.
c) Molekülstruktur: das Enzym besteht aus einer einzigen Art von Einheiten mit einem Molekulargewicht von etwa 47.500±5.000, gemessen mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
d) Thermostabilität: stabil unter 30ºC.
e) Inhibitor: wird gehemmt durch Cu²&spplus;-Ionen.
Es ist anzumerken, daß der optimale Temperaturbereich sich auf den Temperaturbereich bezieht, wo das Enzym hohe Anf angsreaktionsraten aufweist, unabhängig von der Tatsache, daß das Enzym nach einer Inkubation bei dem optimalen Temperaturbereich über längere Zeit zersetzt werden kann.

(4) Herstellung des Enzyms

Die L-Sorboson-Dehydrogenase, die erfindungsgemäß bereitgestellt wird, kann hergestellt werden, indem ein geeigneter Mikroorganismus gezüchtet wird, die Zellen zerstört werden und das Enzym aus dem zellfreien Extrakt der zerstörten Zellen isoliert und gereinigt wird, bevorzugt aus der Membranfraktion des Mikroorganismus.
Die für die vorliegende Erfindung verwendeten Mikroorganismen sind Mikroorganismen, die zur Gattung Gluconobacter gehören, oder Mutanten davon. Gemäß der neuesten Klassifizierung fallen alle Stämme, die zu Gluconobacter gehören, unter die Art Gluconobacter oxydans.
Morphologische und physiologische Eigenschaften der Stämme, die zu Gluconobacter oxydans gehören, werden in "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Band I, Seiten 275 bis 278, 1984 und F. Gosselle et al., International J. System. Bacteriol. Band 33, Seiten 65 bis 81, 1983 beschrieben.
Mikroorganismen, die zu der Gattung Gluconobacter gehören, die erfindungsgemäß verwendet wird, können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder sind bei Mikroorganismen-Sammlungen erhältlich. Die davon abgeleiteten Mutanten können auch erfindungsgemäß verwendet werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten können erhalten werden, indem ein Wildtypstamm mit einem Mutagen, z.B. Ultraviolett-Bestrahlung, Rönten-Bestrahlung, Gamma-Bestrahlung oder Kontakt mit salpetriger Säure oder anderen geeigneten Mutagenen behandelt wird oder indem ein Klon, der durch eine spontane Mutation auftritt, isoliert wird. Diese Mutationen eines Wildtypstamms oder eines Mutantenstamms davon können bewirkt werden in irgendeiner dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Art und Weise. Viele dieser Methoden wurden in verschiedenen Publikationen beschrieben, siehe z.B. "Chemical Mutagens" herausgegeben von Y. Tajima, T. Yoshida und T. Kada, veröffentlicht von Kodansha Scientific Inc., Tokyo, Japan, 1973.
Die erfindungsgemäßen Mutanten können auch erhalten werden durch Fusion der zu der Art Gluconobacter oxydans gehörenden Stämme und die Kombination von Mutagenese und/oder Fusion.
Beispiele für die Stämme, die am meisten bevorzugt für die Erfindung verwendet werden, sind Gluconobacter oxydans (in den Katalogen aufgeführt als melanogenes) IFO 12257, Gluconobacter oxydans (in den Katalogen als melanogenes aufgeführt) IFO 12258 und ähnliche.
Die Mikroorganismen können in einem wäßrigen Medium, das mit geeigneten Nährstoffen ergänzt ist, unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden. Die Züchtung kann bei pH 4,0 bis etwa 8,0, bevorzugt 5,5 bis 7,5 durchgeführt werden. Die Züchtungsperiode variiert abhängig von den Mikroorganismen und dem zu verwendenden Nährstoffmedium und ist bevorzugt etwa 10 bis 100 Stunden. Ein bevorzugter Temperaturbereich zur Durchführung der Züchtung ist etwa 10 bis 40ºC, bevorzugt 25 bis 30ºC.
Es ist gewöhnlich erforderlich, daß das Kulturmedium Nährstoffe enthält, wie assimilierbare Kohlenstoffquellen, z.B. Glycerin, D-Mannit, D-Sorbit, Erythrit, Ribit, Xylit, Arabit, Inosit, Dulcit, D-Ribose, Maltose und Saccharose, bevorzugt L-Sorbose, D-Sorbit oder Glycerin; verdaubare Stickstoffquellen, wie organische Substanzen, z.B. Pepton, Hefeextrakt, Sojamehl und Maisquellwasser und anorganische Substanzen, z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Kaliumnitrit, Vitamine und Spurenelemente.
Unten ist eine Zusammenfassung einer der Ausführungsformen zur Isolierung und Reinigung von L-Sorboson-Dehydrogenase aus den Mikroorganismen nach der Züchtung beschrieben.
(1) Die Zellen werden aus der Fermentationsbrühe durch Zentrifugation geerntet.
(2) Die Zellen werden in der Pufferlösung suspendiert und mit Hilfe eines Homogenisators, eines Beschallungsgerätes oder durch Behandlung mit Lysozym und dergleichen aufgeschlossen, was die aufgeschlossene Lösung der Zellen ergibt.
(3) L-Sorboson-Dehydrogenase wird isoliert und gereinigt aus dem zellfreien Extrakt der aufgeschlossenen Zellen, bevorzugt aus der Membranfraktion der Mikroorganismen.
Die erfindungsgemäß bereitgestellte L-Sorboson-Dehydrogenase ist geeignet als Katalysator zur Herstellung von 2-KGA aus L-Sorboson. Die Reaktion sollte bei pH-Werten von etwa 5,0 bis etwa 10,0 in Gegenwart eines Elektronenakzeptors, z.B. DCIP, Phenazin-Methosulfat, Wurster's Blau, Eisen(III)cyanid, Coenzym Q, Cytochrom c und dergleichen in einem Lösungsmittel, wie Phosphatpuffer, Tris-HCL-Puffer und dergleichen durchgeführt werden. Ein bevorzugter Temperaturbereich zur Durchführung der Reaktion ist etwa 10 bis etwa 50 C. Wenn pH und Temperatur auf etwa 7,0 bis 8,0 bzw. 30ºC eingestellt werden, bringt die Reaktion gewöhnlich die am meisten bevorzugten Ergebnisse. Die Konzentration von L-Sorboson in einem Lösungsmittel kann variieren abhängig von anderen Reaktionsbedingungen, ist aber im allgemeinen wünschenswerterweise etwa 10 bis 100 g/l, am meisten bevorzugt etwa 30 bis 40 g/l.
Bei der Reaktion kann das Enzym auch immobilisiert an einem geeigneten Träger verwendet werden. Jedes Mittel zur Immobilisierung von Enzymen, das allgemein im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden. Zum Beispiel kann das Enzym direkt an eine Membran, an Körnchen oder dergleichen aus einem Harz mit funktionellen Gruppen gebunden werden oder es kann an das Harz durch verbrückende Verbindungen mit bifunktioneller(n) Gruppe(n), z.B. Glutaraldehyd, gebunden werden.
Bezüglich des Enzyms als solchem, des Verfahrens zur Herstellung desselben und des Verfahrens zur Herstellung von 2-KGA unter Verwendung des oben aufgeführten Enzyms, umfaßt die vorliegende Erfindung ein gentechnisches Verfahren zur Klonierung und Expression des Enzymgens, von genetischen Materialien, die zur Erzeugung des Enzyms geeignet sind und ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 2-KGA unter Verwendung dieser genetischen Materialien.
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung einer von Coenzymen unabhängigen L-Sorboson-Dehydrogenase unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus, dem ein rekombinantes DNA-Molekül zugeführt wurde, das ein Gen enthält, das ein Polypeptid mit der Aktivität des Enzyms kodiert, und den rekombinanten Mikroorganismus per se.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Gen und das rekombinante Molekül, das dieses Gen enthält, das verwendet werden kann, um die obigen rekombinanten Mikroorganismen zu konstruieren.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 2-KGA, indem L-Sorboson mit dem durch den rekombinanten Mikroorganismus erzeugten Enzym in Kontakt gebracht wird, und Verfahren zur Herstellung von 2-KGA aus D-Sorbit, L-Sorbose oder L-Sorboson durch Fermentation mit dem obigen rekombinanten Mikroorganismus.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Transkonjuganten des obigen rekombinanten Mikroorganismus unter Verwendung von Gluconobacter-Stämmen.
Kurz gesagt kann der rekombinante Mikroorganismus, der für die vorliegende Erfindung verwendet wird, mit folgenden Stufen erhalten werden:
(1) Man konstruiert eine Genbibliothek aus der chromosomalen DNA eines geeigneten Stamms, der zur Gattung Gluconobacter gehört, der eine Coenzym-unabhängige L- Sorboson-Dehydrogenase herstellen kann.
(2) Man screent die obige Genbibliothek, um einen Klon zu erhalten, der das Enzym oder ein Derivat davon exprimiert.
(3) Falls erwünscht, wird der obige Klon subkloniert, um einen Subklon zu erhalten, der ein kleineres DNA-Fragment, das zur Expression des Enzyms notwendig ist, enthält und
(4) falls erwünscht, rekonstruiert man das rekombinante DNA-Molekül, um eine hohe Produktivität zu ermöglichen.
Die Materialien und die Techniken, die bei dem obigen Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden im Detail wie folgt erklärt:
Klonieren des Gens, das die neue L-Sorboson-Dehydrogenase kodiert und Konstruktion eines rekombinanten Mikroorganismus.

A) Ursprung des Gens

Das die Coenzym-unabhängige L-Sorboson-Dehydrogenase der vorliegenden Erfindung kodierende Gen kann aus Mikroorganismen kloniert werden, die zu der Gattung Gluconobacter gehören, die dieses Enzym produzieren können, bevorzugt aus Gluconobacter oxydans IFO 12258, Gluconobacter oxydans IFO 12257 oder einer Mutante davon.

B) Konstruktion einer Genbibliothek

Mit einem im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren wird die Chromosomen-DNA, die aus dem obigen Originalstamm isoliert wurde, mit einem Restriktionsenzym, wie Sall, Hindlll, xhol oder EcoRI teilweise verdaut. Die entstehenden DNA-Fragmente, die eine große Molekülgröße haben, bevorzugt 15 bis 35 kb, werden gesammelt und mit einer geeigneten Vektor-DNA ligiert, die mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut wird, und bevorzugt mit alkalischer Phosphatase aus Bakterien oder Kälberdünndarm behandelt. Als Vektor kann entweder ein Plasmid oder ein Phage verwendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung ist der am meisten bevorzugte Vektor ein Cosmid- Vektor, z.B. pVK100 (ATCC 37156) oder pVK102 (ATCC 37158) oder ein Derivat davon, d.h. ein Derivat, das eine Cos-Stelle des Lambda-Phagen, eine Mob-Stelle, einen Replikationsursprung von RK2 und ein oder mehrere Markergene, z.B. Antibiotikaresistenzgene, beinhaltet.
Die erhaltene rekombinante DNA auf geeigneten Vektoren wird in einen geeigneten Wirtsorganismus eingeführt unter Verwendung irgendeines DNA-Transfersystems, z.B. durch Transformation, Transduktion oder Konjugation.
Im vorliegenden Fall kann die Genbibliothek, die aus den oben erhaltenen rekombinanten DNA's besteht, geeigneterweise in einem Stamm von Gluconobacter oxydans als Wirt konstruiert werden mit dem folgenden Verfahren:
(1) Um eine Genbibliothek in einem Stamm von Gluconobacter oxydans zu erhalten, werden die rekombinanten DNA's zuerst in irgendeinen Stamm von Escherichia coli überführt, um eine Genbibliothek in E. coli zu konstruieren. Für diesen Zweck kann das in vitro Verpackungssystem des Lambda-Phagen, worin der Vektor ein Cosmid- Vektor ist, verwendet werden. Dieses System unter Verwendung eines Cosmid-Vektors ist geeignet für das Klonieren von großen DNA-Fragmenten. Ein bevorzugter Wirt für das in vitro-Verpackungssystem ist E. coli C600, E. coli HB101 oder E. coli ED8767. Das in vitro Verpackungssystem ist im Handel erhältlich und kann nach den Anleitungen des Herstellers verwendet werden. Ein solches System kann auch hergestellt und verwendet werden nach der Beschreibung in der Literatur, z.B. T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 256-268 (1982), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
(2) Dann werden die rekombinanten DNA's in einen E. coli Stamm als Donor in einen geeigneten Stamm von Gluconobacter als Rezipient überführt, unter Verwendung einer biparentalen Konjugation oder einer triparentalen Konjugation.
Wenn eine biparentale Konjugation verwendet wird, ist es notwendig, daß der Donorstamm von E. coli Tra-Gene auf der Chromosomen-DNA besitzt. Und wenn die Genbibliothek in E. coli in einem Stamm konstruiert wurde, der keine Tra-Gene hat, sollten die rekombinanten DNA's in einen anderen E. coli-Stamm mit Tra-Genen überführt werden, E. coli S17-1 kann bevorzugt als solcher Donorstamm verwendet werden. Die rekombinanten DNA's in einem Stamm von E. coli können in den anderen Stamm mit Tra-Genen überführt werden durch ein übliches Transformationsverfahren, um eine neue Genbibliothek in E. coli zu konstruieren, die als Donorstamm für die Konjugation verwendet werden kann.
Es ist für die biparentale Konjugation auch erforderlich, daß das Vehikel, das durch Konjugation überführt werden soll, eine mob-Stelle besitzt. Die erwähnten Vektoren pVK10o, pVK102 oder Derivate davon, die eine Mob-Stelle haben, sind auch bevorzugt, um dieses Vehikel mit einer Mob-Stelle zu konstruieren.
Dann wird jeder Klon der Genbibliothek, der in E. coli als Donor oben hergestellt wurde, in einem flüssigen Medium gezüchtet. Gleichzeitig wird ein Stamm von Gluconobacter als Rezipient in einem Teströhrchen, das ein geeignetes Medium enthält, bis zur log-Phase oder einer frühen stationären Phase gezüchtet. Die Gluconobacter-Brühe wird dann mit jeder Brühe von E. coli in einem Verhältnis von etwa 1:10 bis etwa 10:1 vermischt. Jede Mischung wird auf ein Nitrocellulosefilter auf der Oberfläche einer Agarplatte eines für das Wachstum sowohl von Gluconobacter als auch von E. coli geeigneten Mediums getupft und die Zellen auf dem Filter werden drei Stunden bis 7 Tage lang inkubiert.
(3) Die Transkonjuganten können aus der Mischung von Donor E. coli, nicht transkonjugiertem Gluconobacter und transkonjugiertem Gluconobacter durch geeignete Methoden ausgewählt werden, z.B. durch Selektion über die Antibiotika-Resistenz und Erfordernisse bezüglich einer Aminosäure.
(4) Die Genbibliothek in einem Stamm von Gluconobacter kann hergestellt werden, indem eine geeignete Anzahl der obigen Transkonjuganten gesammelt wird.
Transkonjuganten können auch durch triparentale Konjugation erhalten werden, unter Verwendung von E. coli, der ein rekombinantes Plasmid als Donor beinhaltet, E. coli, der ein Helferplasmid mit Tra-Genen beinhaltet, z.B. RK2 oder pRK2013, als Helfer und einem Stamm von Gluconobacter als Rezipient.
Der als Rezipient verwendete Gluconobacter-Stamm kann irgendein Stamm sein, der zu der Gattung Gluconobacter gehört. Insbesondere können 2-KGA-Produzenten, wie Gluconobacter oxydans IFO 3292, Gluconobacter oxydans IFO 3293 (FERM-P Nr. 8356), Gluconobacter oxydans IFO 3294 und deren Derivate, ein L-Sorboson-Akkumulator wie Gluconobacter oxydans OX-4 oder ein stark 2-KGA produzierender Stamm wie Gluconobacter oxydans N44-1 oder Gluconobacter oxydans U-13 (FERM-BP Nr. 1269) und deren Derivate verwendet werden. Diese Derivatstämme können durch übliche Mutagenese, wie vorher beschrieben, erhalten werden.

C) Screening

Im allgemeinen kann eine Genbibliothek gescreent werden unter Verwendung der folgenden Methoden:
(1) Koloniehybridisierung einer Genbibliothek mit einer nach einer geeigneten Aminosäuresequenz des Enzyms synthetisierten Oligonucleotidsonde
(2) Immunologisches Screening einer Genbibliothek unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Enzym als Antigen.
(3) Direktes Expressionsscreening einer Genbibliothek in einem geeigneten Wirt.
Bei der vorliegenden Erfindung wird das direkte Expressions- Screening bevorzugt verwendet, indem die in Gluconobacter erstellte Genbibliothek gemäß den obigen Erklärungen untersucht wird. Das direkte Expressions-Screening kann mit dem später beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Jeder Stamm einer Genbibliothek in Gluconobacter wird auf einer Agarplatte, die geeignete Antibiotika enthält, die als Marker nützlich sind, bei 10 bis 40ºC, bevorzugt bei 25 bis 30ºC, 1 bis 7 Tage lang gezüchtet. Die so erhaltenen Zellen werden einem Ruhesystem unterzogen, wo die Zellen in der Reaktionsmischung, die 1 bis 5 % L-Sorboson oder L-Sorbose, 0,3 % NaCl und 1 % CaCO&sub3; enthält, suspendiert werden und 1 bis 7 Tage lang bei 10 bis 40ºC, bevorzugt 25 bis 30ºC inkubiert werden. Die entstehende Reaktionsmischung wird auf Dünnschicht-Chromatographie aufgetragen, um positive Klone nachzuweisen. Die positiven Klone werden ausgewählt durch Ansammlung von 2-KGA aus L-Sorboson oder L-Sorbose oder, wenn ein L-Sorboson-Akkumulatorstamm verwendet wird, ausgewählt durch Verbrauch von L-Sorboson, das aus L-Sorbose angesammelt wird.
Die obige klonierte DNA, die eine Coenzym-unabhängige L- Sorboson-Dehydrogenase kodiert, kann durch Restriktionskarten und/oder Nucleotidsequenzierung mit den im Stand der Technik wohlbekannten Methoden charakterisiert werden.

D) Stabilität des rekombinanten Plasmids

Wie es auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technik wohlbekannt ist, benötigen die meisten rekombinanten Mikroorganismen einen selektiven Druck, z.B. durch Antibiotika, um einen Verlust des fremden Plasmids zu verhindern. Jedoch sollte die Zugabe von Antibiotika oder anderen Arzneimitteln zu der Fermentationsbrühe vermieden werden, wenn die Produkte einer solchen Fermentation Nahrungsmittel, Getränke oder pharmazeutische Produkte betreffen. Sie sollte auch zur Vereinfachung des Verfahrens vermieden werden. Daher wurde versucht, die Stabilität des rekombinanten Systems durch spezielle Techniken zu verbessern, z.B. die Einführung einer par-Region in das Plasmid, die Verwendung von low-copy-number-Plasmiden oder die kontrollierte Expression eines Gen durch Temperaturverschiebung, Induktion mit IPTG (Isopropylthiogalactosid) etc..
Es ist bekannt, daß die Stabilität eines Plasmids von der Kombination aus Wirtsorganismus und plasmid abhängt.
Es wurde nun gefunden, daß die rekombinanten Plasmide, die aus den Plasmiden pVK10o und pVK102 abgeleitet sind, in einem Stamm von Gluconobacter bei irgendwelchen Züchtungen stabil sind, z.B. in MB-Medium, FB-Medium und dem Produktionsmedium für die 2-KGA-Fermentation, ebenso wie pVK100 und pVK102 selbst.
Somit liefert die vorliegende Erfindung auch rekombinante Plasmide, dig in einem Stamm von Gluconobacter stabil sind, wobei die Plasmide geeignet sind zur Herstellung der Coenzymunabhängigen L-Sorboson-Dehydrogenase in Gluconobacter und für die Herstellung von 2-KGA aus D-Sorbit, L-Sorbose oder L- Sorboson.
Das stabile rekombinante Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es aus mindestens einem DNA-Fragment besteht, das von dem Plasmid pVK100 oder pVK102 abgeleitet ist, einem in einem Stamm von Gluconobacter zu exprimierenden Strukturgen und, falls erwünscht, einer Expressions-Kontrollregion, die mit dem Strukturgen funktionell konjugiert ist.

E) Transformierte Mikroorganismen

Der Transformant, der das betreffende Enzym exprimieren kann, kann erhalten werden, indem das oben klonierte Plasmid, das das Strukturgen des Enzyms enthält, in einen geeigneten Wirtsorganismus eingeführt wird. Wenn das Plasmid nicht die richtige Expressionskontrollregion für das Strukturgen aufweist, kann ein Expressionsplasmid konstruiert werden, indem eine Promotorsequenz und eine SD-(Shine-Dalgarno)-Sequenz stromaufwärts des Strukturgens funktionell eingeführt wird.
In dem Beispiel wird ein DNA-Fragment, das sowohl eine Expressions-Kontrollregion als auch das Strukturgen des Enzyms, das aus einem Stamm von Gluconobacter kloniert wurde, enthält, beispielhaft dargestellt. In diesem Fall kann ein Plasmid, dem das DNA-Fragment insertiert wurde, das Strukturgen des betreffenden Enzyms in einem Stamm von Gluconobacter oder einem geeigneten Organismus als Wirtsorganismus exprimieren.

Herstellung von L-Sorboson-Dehydrogenase unter Verwendung des transformierten Mikroorganismus

A) Herstellung und Isolierung

Der oben erhaltene transformierte Mikroorganismus kann für die Herstellung von L-Sorboson-Dehydrogenase durch ein Fermentations- und Isolierungsverfahren erhalten werden.
Die Bedingungen für die Fermentation des Transformanten können wie üblich ausgewählt werden abhängig von dem Wirtsstamm. Wenn der Wirtsorganismus ein Gluconobacter- Stamm ist, können Fermentationsbedingungen, wie vorher beschrieben, auch für den Transformanten angewendet werden.
Die Isolierung der L-Sorboson-Dehydrogenase, die von dem Transformanten erzeugt wurde, kann mit den auf dem Gebiet der Proteinchemie wohlbekannten Verfahren durchgeführt werden.

B) Vergleich des rekombinanten Produkts mit dem natürlichen Produkt

Die Überprüfung der Identität der L-Sorboson-Dehydrogenase, die von dem rekombinanten Organismus erzeugt wurde, mit dem natürlichen Enzym kann mit einem immunologischen Test, der im Stand der Technik wohlbekannt ist, ebenso wie durch Vergleich der katalytischen Eigenschaften, z.B. pH-Optimum, optimale Temperatur, Molekulargewicht, Thermostabilität etc., der beiden Enzyme durchgeführt werden.
So ist die mit dem gentechnischen Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugte L-Sorboson-Dehydrogenase als Katalysator zur Herstellung von 2-KGA aus L-Sorboson geeignet. Die Herstellung von 2-KGA aus L-Sorboson kann nicht nur mit diesem Enzym bewirkt werden, sondern auch mit dem zellfreien Extrakt, den ruhenden Zellen oder den wachsenden Zellen des rekombinanten Organismus.
Der rekombinante Organismus ist auch geeignet zur Herstellung von 2-KGA aus D-Sorbit oder L-Sorbose in einem ruhenden Zellsystem oder in einem wachsenden Zellsystem.
Typische Bedingungen für die Umwandlung von L-Sorboson in 2-KGA unter Verwendung des isolierten rekombinanten Enzyms oder des zellfreien Extrakts sind genauso, wie für das Verfahren mit natürlicher L-Sorboson-Dehydrogenase vorher beschrieben.
Der rekombinante Organismus der vorliegenden Erfindung hat beträchtliche Vorteile gegenüber dem Stammorganismus bei der 2-KGA-Herstellung aus D-Sorbit oder L-Sorbose, wenn der Wirtsorganismus ein Gluconobacter-Stamm ist. Der rekombinante Organismus kann in einem wäßrigen Medium, das mit geeigneten Nährstoffen ergänzt ist, unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden. Bei der Züchtung können D-Sorbit oder L-Sorbose, die als Ausgangsmaterial verwendet werden, dem Medium zugegeben werden zu einem geeigneten Zeitpunkt der Fermentation, bevorzugt zu Beginn. Der Konzentrationsbereich des Ausgangsmaterials, z.B. D-Sorbit, ist ein Gehalt von 10 bis 400 g/l und die Kultur wird auf etwa 10 bis 40 ºC, bevorzugt 25 bis 30ºC, gehalten. Die Züchtung kann bei pH-Werten von etwa 4,0 bis 8,0, bevorzugt etwa 5,5 bis 7,5, durchgeführt werden. Der Züchtungszeitraum variiert abhängig von den rekombinanten Organismen und dem verwendeten Nährmedium und ist bevorzugt etwa 20 bis 200 Stunden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von 2-KGA aus L-Sorboson durch Gluconobacter oxydans-Stämme

Die G. oxydans-Stämme IFO3292, IFO3294, IFO12257, IFO12258, ATCC 9937 und IFO3293 (FERM-P Nr. 8356), die auf Agarplatten Nr. 4 (5 g/l Glycerin, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l MgSO&sub4; 7H&sub2;O) gezüchtet wurden, wurden in 5 ml B.G.-Medium Nr. 3, das 70 g/l Glycerin, 15 g/l Hefeextrakt, 2,5 g/l MgSO&sub4; 7H&sub2;O und 10 g/l CaCO&sub3; in einem Teströhrchen enthielt, geimpft. Nach 3tägiger Inkubation bei 30ºC auf einem Teströhrchenschüttler wurde 1 ml der entstehenden Kultur verwendet, um 50 ml frisches B.G. Medium Nr. 3 in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben zu impfen. Die Kolben wurden 3 Tage bei 30ºC auf einem Rundschüttler, der mit 180 Upm betrieben wurde, inkubiert. 20 ml jeder Kultur wurden mit 5.000 Upm 15 Minuten lang zentrifugiert. Die Feststoffe, die die Zellen und verbleibendes CaCO&sub3; enthielten, wurden gesammelt, zweimal mit 10 ml sterilem 0,3 % NaCl gewaschen und in 6 ml Reaktionslösung, die 3 g/l NaCl, 30 g/l L-Sorboson und 10 g/l CaCO&sub3; enthielt, suspendiert. Die Reaktion wurde in einem Teströhrchen 23 Stunden lang bei 30ºC auf einem Röhrchenschüttler durchgeführt. Die Ausbeute an 2-KGA ist in Tabelle 1 zusammengefaßt. Ein Verlust durch Verdampfen während der Züchtung wurde nicht korrigiert.

Beispiel 2

Isolierung und Reinigung von L-Sorboson-Dehydrogenase aus Gluconobacter oxydans IFO12258

(1) Züchtung von G. oxydans IFO12258

Die Agarschrägkultur von G. oxydans IFO12258 wurde in 5 ml des Mediums, das aus 70 g/l Glycerin, 15 g/l Hefeextrakt (Oriental Co., Ltd.) und 2,5 g/l MgSO&sub4; 7H&sub2;O in einem Teströhrchen bestand, geimpft und 2 Tage lang bei 30ºC auf einem Röhrchenschüttler (280 Upm) inkubiert. 2 ml dieser Kultur wurden in 100 ml des gleichen Mediums in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben überführt und 20 Stunden lang bei 30ºC auf einem Rundschüttler (180 Upm) gezüchtet. Die so hergestellte Kultur wurde als Inoculum für einen 30 l Rüttelfermenter, der 20 l desselben Mediums enthielt, verwendet. Der Rüttelfermenter wurde bei 30ºC mit 250 Upm (zur Bewegung) und 20 l pro Minute (zur Belüftung) betrieben. Nach 40 Stunden Fermentation wurde die Kultur geerntet, um die Zellen durch Zentrifugation (8.000 Upm) zu sammeln. Aus 20 l Brühe wurden 500 g (Naßgewicht) Zellen erhalten. Die Zellen wurden bis zur Verwendung bei -20ºC eingefroren.

(2) Herstellung der Membranfraktion

Die gefrorenen Zellen von G. oxydans IFO12258 (500 g, Naßgewicht) wurden aufgetaut und in 2.500 ml 0,85 % NaCl-Lösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann mit einem Dyno Mill Homogenisator (Willy A. Bachofen Co., Basel) in Gegenwart von Glasperlen (0,1 mm Durchmesser) mit 2.000 Upm 4 Minuten lang bei 4ºC homogenisiert.
Das so hergestellte Homogenisat wurde mit 1.800 g 10 Minuten lang zentrifugiert, um Zellbruchstücke und Glasperlen zu entfernen. Der entstehende Überstand wurde mit 80.000 x g 60 Minuten lang zentrifugiert, dann wurde der Niederschlag als Membranfraktion ges ammelt (200 g, Naßgewicht).

(3) Solubilisierung der L-Sorboson-Dehydrogenase aus der Membranfraktion

Die Membranfraktion (200 g, Naßgewicht) wurde in 900 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7), der 1 % Triton X-100 enthielt, suspendiert, 15 Stunden lang gerührt und mit 80.000 x g eine Stunde lang zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten (850 ml).

(4) Säulenchromatographie auf DEAE (Diethylaminoethyl)- Toyopearl (Polyvinylart) 6505 (Toyo Soda)

Der so erhaltene Überstand (330 ml) wurde gegen 20 l 1 mM Kaliumphosphatpuffer, der 0,1 % Triton X-100 enthielt, 15 Stunden lang dialysiert und auf eine DEAE- Toyopearl 6505- Säule (2,3 x 40 cm) aufgetragen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und das Enzym mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0,0 M bis 0,4 M eluiert.

(5) Säulenchromatographie mit DEAE-Sepharose CL-68

Die aktiven Fraktionen der vorherigen Stufe wurden vereinigt und gegen 1 mM Kaliumphosphatpuffer, der 0,1 % Triton X-100 enthielt, 15 Stunden lang dialysiert und dann auf eine DEAE-Sepharose CL-68-Säule (2,5 x 10 cm), die mit dem Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und das Enzym mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0,0 M bis 0,4 M eluiert.

(6) Säulenchromatographie mit CM-Sepharose CL-68

Die aktiven Fraktionen der vorherigen Stufe wurden vereinigt und gegen 1,0 mM Acetatpuffer, pH 5,5, der 0,1 % Triton X-100 enthielt, 15 Stunden lang dialysiert und dann auf eine CM-Sepharose CL-68-Säule (2,5 x 14,5 cm), die mit. dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und das Enzym mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0,0 M bis 0,4 M eluiert.

(7) Säulenchromatographie mit Hydroxyapatit HCA 100 S

Die aktiven Fraktionen der vorherigen Stufe wurden vereinigt und gegen 1,0 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 % Triton X-100 enthielt, 15 Stunden lang dialysiert und dann auf eine Hydroxyapatit HCA 100 S- Säule (1,7 x 18 cm), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und das Enzym mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer (ph 7,0), der 0,1 % Triton X-100 enthielt, eluiert.

(8) Chromatographie auf einer TSK-GEL Toyopearl HW60S-Säule (Polyvinylart)

Die aktiven Fraktionen der vorherigen Stufe wurden vereinigt und mit Ultrafiltration unter Verwendung eines Membranfilters (Diaflo PM-30, Amicon) auf ein geringes Volumen (ca. 1,5 ml) eingeengt. Dann wurde das Konzentrat auf eine TSK-GEL-Toyopearl HW60S-Säule (1,5 x 80 cm) aufgetragen, die mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer, der 0,1 % Triton X-100 enthielt, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer entwickelt.
Eine Zusammenfassung des Reinigungsverfahrens der membrangebundenen L-Sorboson-Dehydrogenase ist in Tabelle 2 gezeigt.

Beispiel 3

Eigenschaften von L-Sorboson-Dehydrogenase

(1) Elektrophoretische Analyse

Das gereinigte Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 6,7 Einheiten pro mg Protein wurde mit Natriumdodecylsulfat (SDS) versetzt und auf seine Reinheit durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese analysiert. Es konnte bewiesen werden, daß das Enzym aus einer einzigen homogenen Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 47.500 ± 5.000 besteht.

(2) Katalytische Eigenschaften

Die gereinigte L-Sorboson-Dehydrogenase zeigte ihre Aktivität nur, wenn ein Elektronenakzeptor, wie 2,6- Dichlorphenolindophenol oder Phenazinmethosulfat vorhanden war.
Die Substratspezifität des gereinigten Enzyms ist in Tabelle 3 gezeigt. Verschiedene Arten von Aldehydverbindungen wurden oxidiert. Darunter wurde Methylglyoxal am effizientesten oxydiert und die Reaktionsrate war in diesem Fall zweimal höher als bei L-Sorboson.
Die scheinbare Michaelis-Konstante für L-Sorboson wurde mit 16,7 mM bei pH 7,0 bestimmt.
Wie in Tabelle 4 gezeigt wurde gefunden, daß die optimale Temperatur der L-Sorboson-Dehydrogenase für die Methylglyoxal-Oxidation zwischen 30 und 40ºC liegt.
Die Wirkung des pH's auf die L-Sorboson-Oxidation wird in Tabelle 5 gezeigt. Das Enzym zeigte ein pH-Optimum bei 7,0. Die Wirkung von Metallen auf die L-Sorboson- Oxidation wurde getestet. Es wurde gezeigt, daß von den getesteten Metallen Cu²&spplus; das Enzym stark inhibierte (Tabelle 6). Monoiodessigsäure inhibierte das Enzym mäßig, wie in Tabelle 7 gezeigt.
Die pH-Stabilität des gereinigten Enzyms wurde untersucht. Nachdem das Enzym in dem Puffer mit verschiedenen pH's 48 Stunden lang bei 4ºC behandelt worden war, wurde die restliche Enzymaktivität bei pH 7,0 gemessen. Wie in Tabelle 8 gezeigt, war das Enzym über dem getesteten pH-Bereich ziemlich stabil. Etwa 1/3 der Enzymaktivität war bei pH 4,0 verloren.
Die Thermostabilität von L-Sorboson-Dehydrogenase wurde untersucht. Wie in Tabelle 9 gezeigt, gingen etwa 70 % der Enzymaktivität bei lominütiger Behandlung bei 40ºC verloren.

Beispiel 4

Klonieren des L-Sorboson-Dehydrogenasegens von G. oxydans IFOL2258

(1) Konstruktion einer Cosmid-Genbibliothek in E. coli S17-1

(1)-a) Extraktion von chromosomaler DNA aus G. oxydans IFO12258

G. oxydans IFO12258 wurde in 200 ml Mannitbrühe (MB) (25 g/l Mannit, 3 g/l Bactopepton, 5 g/l Hefeextrakt) 48 Stunden lang bei 30ºC gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, mit 100 ml Tris (10 mM)-EDTA (1 mM)-Puffer gewaschen und wieder in 50 ml Tris (10 mM)-EDTA (20 mM)-Puffer suspendiert.
Die so hergestellte Zellsuspension wurde 30 Minuten lang bei 37ºC mit 2 ml Lysozymlösung (10 mg/ml) und anschließend 30 Minuten lang bei 37ºC mit Pronase (4.000 Einheiten) und eine Stunde bei 37ºC mit 10 ml 5 % SDS behandelt. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein klares Lysat erhalten. Die DNA wurde mit 60 ml neutralem Phenol:Chloroform, das 4 % Octanol (1:1) enthielt, extrahiert, indem langsam bei 4ºC 30 Minuten lang gedreht wurde. Die Mischung wurde mit 15.000 Upm 15 Minuten lang zentrifugiert und der erhaltene Überstand wurde mit 60 ml Chloroform:Octanol (96:4) extrahiert, indem 10 Minuten lang bei 4ºC langsam gedreht wurde.
Zu 50 ml des durch 15minütige Zentrifugation mit 15.000 Upm erhaltenen Überstands wurden 5,0 ml 3 M Natriumacetat und dann langsam 55 ml kalter Ethanol zugegeben. Die rohe DNA wurde erhalten, indem sie mit einem Glasstab herausgedreht wurde, der dann mit RNase T1 und A (37ºC, 30 Minuten) und wiederum Pronase (37ºC, 30 Minuten) behandelt wurde. Die Extraktionen mit Phenol und Chloroform wurden wiederholt, um reine chromosomale DNA zu erhalten.

(1)-b) Herstellung des Vektorplasmids

Ein Cosmid-Vektor, pVK102 (E.W. Nester et al., Plasmid 8, 45-54 (1982) wurde aus E. coli HB101 hergestellt, der pVK102 beinhaltet, durch die alkalische Methode (H. C.Birnboim und J.Doly, Nucleic Acids Research, 7, 1513- 1523, 1979). Die Restriktionskarte ist in Figur 1 dargestellt.

(1)-c) In vitro-Verpackung

Die gesamte chromosomale DNA von G. oxydans IFO12258, die in (1)-a) hergestellt worden war, wurde teilweise mit SalI (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut. Die entstehenden Fragmente mit 15 kb bis 35 kb wurden mit Gelelektrophorese von der Agarose isoliert. Das in (1)-b) hergestellte Plasmid pVK102 (ATCC 37158) wurde vollständig mit SalI verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdünndarm (Boehringer Mannheim GmbH) dephosphoryliert. Die DNA-Fragmente mit 15 kb bis 35 kb und die lineare pVK102-DNA wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert (Takara Shuzo Co., Ltd.).
Die ligierten Fragmente wurden für die in vitro- Verpackung verwendet unter Verwendung eines Verpackungskits (Amersham International plc). Die entstehenden Phagenteilchen wurden mit E. coli ED8767 inkubiert (N.E. Murray et al., Mol. Gen. Genet. 150, 53, 1977). Die Zellsuspension wurde auf LB-Agarplatten, die 50 mg/l Kanamycin enthielten, ausplattiert.

(1)-d) Konstruktion der Genbibliothek in E. coli S17-1

1.000 Kolonien mit dem Marker KmrTcs auf den LB (Luriabrühe)-Agarplatten, die 50 mg/l Kanamycin enthielten, wurden abgekratzt und verwendet, um eine Mischung aus rekombinanten Plasmiden herzustellen. Die Plasmid-DNA's wurden verwendet, um E. coli S17-1 (Smr Tra&spplus;) zu transformieren (konstruiert von R.Simon et al., Biotechnology 1, 784-791, 1982).
1.400 Transformanten wurden auf Mikrotiterplatten, die LB-Medium mit 100 ug/ml Streptomycin und 50 ug/ml Kanamycin enthielten, aufgetragen, über Nacht inkubiert und mit 15 % Glycerin bei -80ºC als Genbibliothek von G. oxydans IFO12258 in E. coli S17-1 aufbewahrt. Die durchschnittliche Größe der Inserts war 25 kb bis 30 kb.

(2) Konjugativer Transfer der Cosmid-Genbibliothek von E. coli S17-1 in G. oxydans OX-4

Die Cosmid-Genbibliothek von G. oxydans IFO12258 in E. coli S17-1 wurde in G. oxydans OX-4 überführt, eine L- Sorboson ansammelnde Mutante (erhalten aus G. oxydans IFO3293 durch Mutagenese, wie in der Europäischen Patentschrift Nr. 213 591 beschrieben) unter Verwendung einer biparentalen Konjugation zwischen beiden Stämmen.
200 ul der Kultur des Rezipienten G. oxydans OX-4 in der log-Phase, die in Mannitbrühe gezüchtet worden waren, wurden mit 100 ul der Kultur jedes E. coli S17- 1, der pVK102 mit der jeweiligen Insert-DNA trug, in der log-Phase vermischt und auf Nitrocellulosefilter auf der Oberfläche von FB- (50 g/l Fructose, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Polypepton)-Agarplatten aufgetupft. Die Platten wurden bei 30ºC über Nacht inkubiert. Die vermischten Kolonien wurden auf MB-(Mannitbrühe), die 10 ug/ml Polymyxin B und 50 ug/ml Kanamycin enthielt (dieses Medium wird als MPK bezeichnet)-Agarplatten ausgestrichen und 4 Tage bei 30ºC inkubiert. Die entstehenden Konjuganten wurden durch erneutes Ausstreichen auf MPK-Agarplatten gereinigt.

(3) Screenen der Gen-Bibliothek in G. oxydans OX-4

Das Screenen wurde durchgeführt unter Verwendung eines Mini-Ruhe-Systems. Etwa 1.400 Stämme von G. oxydans OX- 4/pKV102 mit der Insert-DNA wurden in der Reaktionsmischung, die 50 ul 3 g/l NaCl 10 g/l CaCO&sub3; und 30 g/l L- Sorbose oder L-Sorboson einzeln enthielt, suspendiert und 1 bis 5 Tage lang bei 30ºC inkubiert. Es wurden Tests auf 2-KGA-Herstellung durchgeführt mit Dünnschichtchromatographie auf Silicagel. Ein positiver Klon, p7A6, wurde erhalten.

(4) Subklonieren von p7A6 und Kennzeichnung der Subklone

Das rekombinante Plasmid p7A6 wurde mit dem alkalischen Verfahren von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research 7, 1513-1523 (1979)) hergestellt und mit den folgenden Restriktionsenzymen fragmentiert:
EcoRI, EcoRV, HaeIII, HincII, NruI, SalI, Sau 3A und XHoII (Boehringer Mannheim Gmbh), BamHI, BGlII, Dra I, Hind III und Sma I (Takara Shuzo Co., Ltd.). EcoRI, HincII, NruI und SalI verdauten die eingesetzte DNA von p7A6 (25 kb) zu 8 bis 11 Fragmenten. HaeIII, Sau 3A und XhoII erzeugten zahlreiche Fragmente. SalIwurde für die erste Stufe der Subklonierung ausgewählt.
p7A6 wurde teilweise verdaut mit SalI, mit dephosphoryliertem und mit SalI verdautem pVK102 ligiert. Die DNA- Mischung wurde in E. coli S17-1 durch Transformation überführt und dann in G. oxydans OX-4 durch biparentale Konjugation überführt, wie in Beispiel 4-(2) beschrieben. Der kleinste Subklon, p7A6 2 wurde beim Screenen des Mini-Ruhesystems von 200 Konjuganten isoliert und die Größe des Inserts war 9,2 kb (Figur 2-(a)). Ein zweites Subklonieren wurde durchgeführt durch Deletion des Fragments E&sub1;-E&sub2; aus p7A6 2. p7A6 3 (Figur 2-(b)), der so erhalten wurde, wurde weiter verkürzt durch eine Deletion des Fragments E&sub1;/&sub2;-Sm&sub3;. Der entstehende Subklon, p7A6 4 (Figur 2-(c)) enthielt ein 3,1 kb Insert in pVK102 mit einer kleinen Deletion von Sm&sub2;- Sm&sub3; in der Vektor-DNA. Die detaillierte Restriktionskarte des 3,1 kb S&sub1;-S&sub2;-E&sub1;/&sub2; (SSE) Fragmentes ist in Figur 3 dargestellt.

(5) Erzeugung von rekombinanter L-Sorboson-Dehydrogenase und Charakterisierung

p7A6 wurde in G. oxydans N44-1 eingeführt (ein solcher Stamm ist erhältlich, wie für G. oxydans OX-4 ausgeführt) aus E. coli S17-1/p7A6 durch biparentale Konjugation, wie in Beispiel 4-(2) beschrieben. Der Konjugant G. oxydans N44-1/p7A6 wurde in 500 ml Medium Nr. 5 (100 g/l L-Sorbose, 15 g/l Hefeextrakt, 2,5 g/l MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,5 g/l Glycerin und 20 g/l CaCO&sub3;), das 50 mg/l Kanamycin enthielt, bei 30 ºC 2 Tage lang gezüchtet. Die so erhaltenen Zellen wurden mit einem French Press Zellhomogenisator in Kaliumphosphatpuffer, ph 7,0, aufgeschlossen, mit DNase in Gegenwart von MgCl&sub2; behandelt und zentrifugiert (6.000 Upm, 15 Minuten). Der Überstand wurde mit 45.000 Upm (80.000 x g) eine Stunde lang zentrifugiert, um eine rohe Membranfraktion zu erhalten. Die L-Sorboson- Dehydrogenase wurde aus der Membranfraktion mit 2 % Triton X-100 solubilisiert und teilweise gereinigt durch Chromatofokussierung, (Jd. h. isoelektrische Chromatographie: chromatographisches Abtrennungsverfahren von Proteinen auf Basis der Unterschiede der isoelektrischen Punkte der Proteine) und mit einer Säulenchromatographie auf Hydroxylapatit. SDS-PAGE-Analyse des aktiven Proteins, das durch aktives Färben nachgewiesen wurde und von dem PAGE-Gel eluiert wurde, zeigte eine klare Bande bei 47.500. Somit wurde das Molekulargewicht der Untereinheit von L-Sorboson-Dehydrogenase aus N44-1/p7A6 mit 47.500 bestimmt, was identisch ist mit der L-Sorboson-Dehydrogenase, die aus G. oxydans IFO12258 isoliert wurde, wie in Beispiel 3-(1) beschrieben. Etwa 300 ug des Enzymproteins, die von dem SDS-PAGE-Gel eluiert worden waren und mit Aceton ausgefällt worden waren, wurden verwendet, um die Teilaminosäuresequenz zu bestimmen. Eine Aminosäuresequenz mit 15 Aminosäuren vom N-Ende wurde wie folgt bestimmt:
Met-Thr-Arg-Ser-Gln-Ile-Arg-Leu-Leu-Val-Ala-Thr-Thr-Ala-Val-
Weiterhin wurde der proteolytische Verdau des Enzymproteins auf HPLC chromatographiert.
Mehrere Peaks wurden getrennt gesammelt und verwendet, um die inneren Aminosäuresequenzen des Proteins zu bestimmen.
Danach wurden 6 Teilaminosäuresequenzen wie folgt bestimmt:
Die Anordnung dieser Sequenzen bei der L-Sorboson-Dehydrogenase wird durch die unterstrichenen Teile in Figur 4 gezeigt.
Es wurde auch gefunden, daß das gereinigte Enzymprotein aus dem rekombinanten Organismus G. oxydans N44-1/p7A6 immunologisch identisch war mit dem von G. oxydans IFO12258.

(6) Sequenzierung des SSE-(SalI-Salll-EcoRI)-DNA-Fragmentes, das das L-Sorboson-Dehydrogenase-Gen enthält

Verschiedene Fragmente, die von dem SSE-Fragment (3,1 kb), das in Figur 3 dargestellt ist, erhalten wurden, wurden weiter subkloniert in den Vektor M13mp8 und M13mp9 (J. Messing und J. Viera, Gene, 19, 269-276, 1982) und sequenziert unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Sequenzierungskits (Amersham international plc) an beiden Strängen. Die stufenweise Deletion (Abschneiden) mit Exonuclease III (Takara Shuzo Co., Ltd., Kilo-Sequenzierungskit) wurde angewendet.
7-Deaza-dGTP (2'-Deoxyguanosin-5'-triphosphat) (Boehringer Mannheim Gmbh) wurde anstelle von dGTP verwendet. Die Aminosäuresequenz am N-Ende des Enzymproteins wurde bestätigt an der DNA-Sequenz des SSE-Fragmentes wie folgt
5' ATG ACC CGT TCC CAG ATC AGG CTT CTC GTC GCG ACC ACC GCC GTC 3
Met Thr Arg Ser Gln Ile Arg Leu Leu Val Ala Thr Tor Ala Val
Der offene Leserahmen von 1347 bp wurde gefunden und die DNA-Sequenz des Strukturgens und die von der DNA- Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Figur 4 gezeigt.

Beispiel 5

Herstellung von 2-KGA aus L-Sorboson durch Kontakt mit gereinigter membrangebundener L-Sorboson-Dehydrogenase aus Gluconobacter oxydans IFO12258

Die Reaktionsmischung, die 100 ml gereinigte membrangebundene L-Sorboson-Dehydrogenase (Gesamtaktivität 130 Einheiten), 50 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 50 ml 10 % L- Sorboson-Lösung, 10 ml 0,2 M Phenazin-Methosulfat-Lösung und 290 ml Wasser enthielt, wurde unter vorsichtigem Schütteln bei 30ºC inkubiert. Als Ergebnis wurde 2-KGA in einer Rate von 650 mg pro Stunde gebildet.

Beispiel 6

Herstellung von 2-KGA aus L-Sorboson mit rekombinanten Organismen in einem ruhenden System

G. oxydans IFO3292, G. oxydans IFO3294, G. oxydans IFO3293, G. oxydans U-13 (FERM-BP Nr. 1269) und deren Konjuganten, die p7A6 4 trugen, die auf gleiche Weise hergestellt wurden, wie in Beispiel 4-(5) beschrieben, wurden von MB-Agarplatten in 5 ml Medium Nr. 5 geimpft und 48 Stunden bei 30ºC inkubiert. 1 ml jeder Kultur wurde in 50 ml des gleichen Mediums überführt und bei 30ºC auf einem Rundschüttler (180 Upm) 48 Stunden lang gezüchtet. Das restliche Calciumcarbonat wurde durch Zentrifugation mit 500 Upm 5 Minuten lang entfernt. Die Zellen wurden gesammelt, zweimal mit 25 ml steriler 3 g/l NaCl-Lösung gewaschen und in 6 ml 3 g/l NaCl-Lösung suspendiert.
Die Reaktionsmischung, die 3 g/l NaCl, 36 g/l L-Sorboson, 10 g/l CaCO&sub3; und 2 ml Zellsuspension enthielt, wurde in einem Teströhrchen 4 Tage lang bei 30ºC unter Schütteln inkubiert. Die Menge an 2-KGA, die sich bei eintägiger Inkubation oder viertägiger Inkubation ansammelte, ist in Tabelle 10 gezeigt.

Beispiel 7

Erzeugung von 2-KGA aus L-Sorbose mit rekombinanten Mikroorganismen in einem ruhenden System

G. oxydans U-13 (FERM-BP Nr. 1269 und G. oxydans U-13, der p7A6 4 enthält, wurden für die ruhende Kultur verwendet, wie in Beispiel 6 beschrieben, außer daß das Substrat 40 g/l L-Sorbose war.
Die Ausbeute an 2-KGA nach 4 Tagen Inkubation ist in Tabelle 11 gezeigt.

Beispiel 8

Erzeugung von 2-KGA aus L-Sorbose mit rekombinanten Organismen in einem wachsenden System

Konjuganten: G. oxydans N44-1, der pVK102 trägt und G. oxydans N44-1, der p7A6 4 trägt, wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 4-(2) beschrieben, hergestellt. Die Zellen von jedem Konjuganten wurden von einer kanamycinhaltigen MB- Agarplatte in 5 ml Medium Nr. 5 mit oder ohne Kanamycin in einem Teströhrchen geimpft und 48 Stunden lang bei 30ºC geschüttelt. 1/10 ml jeder Kultur wurde in 5 ml frisches Medium Nr. 5 mit oder ohne Kanamycin in einem Teströhrchen überführt und 120 Stunden bei 30ºC geschüttelt.
G. oxydans N44-1, als Kontrolle, wurde in gleicher Weise gezüchtet, außer daß die Züchtung ohne Kanamycin durchgeführt wurde.
Die Ausbeute von 2-KGA ist in Tabelle 12 gezeigt.

Beispiel 9

Stabilität des rekombinanten Plasmids während der 2-KGA-Fermentation

Zellen der Transkonjuganten G. oxydans N44-1, der pVK102 trägt oder von G. oxydans N44-1, der p7A6W4 trägt, wurden von einer kanamycinhaltigen MB-Agarplatte in 5 ml Medium Nr. 5 ohne Kanamycin in einem Teströhrchen geimpft und 48 Stunden bei 30ºC geschüttelt (erste Züchtung). Ein Aliquot von 0,1 ml von jeder Brühe wurde in 5 ml frisches Medium Nr. 5 ohne Kanamycin in einem Teströhrchen überführt und 48 Stunden bei 30ºC geschüttelt (zweite Züchtung). Die dritte Züchtung wurde auf gleiche Weise wie die zweite Züchtung durchgeführt, außer daß die Fermentation 120 Stunden lang fortgesetzt wurde. 6 Proben wurden in geeigneter Weise nach der Fermentation verdünnt, auf MB-Agarplatten ausgestrichen und 5 Tage bei 30ºC inkubiert. Die entstehenden Kolonien wurden abgenommen (50 Kolonien pro Probe), auf MB-Agarplatten mit und ohne Kanamycin ausgestrichen und 3 Tage bei 30ºC inkubiert.
Die Stabilität der Plasmide wurde wie folgt berechnet:
Stabilität (%) = Anzahl von Kolonien mit Kanamycin-Resistenz/Anzahl der abgenommenen Kolonien (50 Kolonien) = x 100
Das Ergebnis ist in Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 1 2-KGA-Produktion aus L-Sorboson durch G. oxydans-Stämme Stämme G. oxydans
Die Anfangskonzentration von L-Sorboson war 30 g/l. Tabelle 2 Reinigung von L-Sorboson-Dehydrogenase aus Gluconobacteroxydans IFOL2258 Fraktion Gesamtprotein (mg) Gesamtaktivität (Einheiten) spezifische Aktivität (Einheiten/mg Protein) Ausbeute (%) solubilisierte Fraktion DEAE-Toyopearl 650S DEAE-Sepharose CL-6B CM-Sepharose CL-6B Hydroxyapatit HCA 100S TSK-GEL Toyopearl HW60S Tabelle 3 Substratspezifität von membrangebundener L-Sorboson-Dehydrogenase aus G. oxydans IFO12258 Substrat Relative Aktivität (%) L-Sorboson Methylglyoxal Glyoxal Glutaraldehyd Glyoxylsäure Glyceraldehyd Glycolaldehyd Propionaldehyd Acetaldehyd L-Sorbose D-Glucose Tabelle 4 Optimale Temperatur für membrangebundene L-Sorboson-Dehydrogenase aus G. oxydans IFO12258 Temperatur (ºC) Relative Aktivität (%)
Als Substrat wurde Methylglyoxal verwendet. Tabelle 5 pH-Optimum von membrangebundener L-Sorboson-Dehydrogenase aus G. oxydans IFO12258 Puffer (0,1 M) Relative Aktivität (%) Kaliumphosphat
L-Sorboson wurde als Substrat verwendet. Tabelle 6 Wirkung von Metallionen auf membrangebundene L-Sorboson- Dehydrogenase von G. oxydans IFO12258 Metallion Konzentration (mM) relative Aktivität (%) keines
L-Sorboson wurde als Substrat verwendet. Tabelle 7 Wirkung von Inhibitoren auf membrangebundene L-Sorboson- Dehydrogenase aus G. oxydans IFO12258 Inhibitoren Konzentration (mM) Relative Aktivität (%) keiner
L-Sorboson wurde als Substrat verwendet. Tabelle 8 pH-Stabilität von membrangebundener L-Sorboson-Dehydrogenase aus G. oxydans IFO12258 Puffer relative Aktivität (%) Acetat Kaliumphosphat
Das gereinigte Enzym wurde 48 Stunden bei 4ºC auf dem angegebenen pH gehalten und die restliche Enzymaktivität wurde bei pH 7,0 gemessen. L-Sorboson wurde als Substrat verwendet. Tabelle 9 Thermostabilität von membrangebundener L-Sorboson-Dehydrogenase aus G. oxydans IFO12258 Temperatur (ºC) relative Aktivität (%)
Das gereinigte Enzym wurde bei der angegebenen Temperatur 10 Minuten lang behandelt und die restliche Enzymaktivität wurde bei pH 7,0 gemessen. L-Sorboson wurde als Substrat verwendet. Tabelle 10 2-KGA-Produktion aus L-Sorboson durch rekombinante Organismen in einem ruhenden System Stämme Plasmid 2-KGA* 1 Tag (g/l) 4 Tage G. oxydans keines
Die Anfangskonzentration von L-Sorboson war 36 g/l
* Der Verlust durch Verdampfen während der Inkubation wurde korrigiert. Tabelle 11 2-KGA-Produktion aus L-Sorbose durch rekombinante Organismen in einem ruhenden System Stämme Plasmid G. oxydans U-13 (FERM-BP Nr. 1269) keines
Die Anfangskonzentration von L-Sorbose war 40 g/l.
* Der Verlust durch Verdampfen während der Inkubation wurde korrigiert. Tabelle 12 2-KGA-Produktion aus L-Sorbose durch rekombinante Organismen in einem wachsenden System Plasmid Km* *: Kanamycin Wirt: G. oxydans N44-1. Tabelle 13
Stabilität* von Vektor und rekombinantem Plasmid während der 2-KGA-Fermentation (%)Plasmid erste Züchtung 48 Stunden zweite Züchtung 48 Stunden dritte Züchtung 120 Stunden * Stabilität (%) = Anzahl von Kolonien mit Kanamycinresistenz/Gesamtzahl der getesteten Kolonien x 100

Claims

1. Die coenzymunabhängige L-Sorbosondehydrogenase, die auf L- Sorboson einwirkt, um 2-Keto-L-Gulonsäure herzustellen in homogener Form mit der Aminosäuresequenz:

oder ein funktionelles Äquivalent dieser Aminosäuresequenz.

2. Eine wie in Anspruch 1 beanspruchte Verbindung, die aus einer Art Untereinheit mit einem durch Natriumdodecylsulfatgelelektrophorese bestimmten Molekulargewicht von etwa 47,500±5000 besteht und durch Cu²&spplus;- Ionen inhibiert wird.

3. Eine wie in Anspruch 1 oder 2 beanspruchte Verbindung, die ein membrangebundenes Enzym ist.

4. Eine wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beanspruchte Verbindung von dem Genus Gluconobacter.

5. Eine rekombinante DNS, die eine DNS umfasst, die für die in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beanspruchte coenzymunabhängige L- Sorbosondehydrogenase kodiert.

6. Eine wie in Anspruch 5 beanspruchte rekombinante DNS, wobei die DNS die folgende Nukleotidsequenz hat:

7. Ein Vektor, der die wie im Anspruch 5 oder 6 beanspruchte DNS umfasst.

8. Der Vektor von Anspruch 7 der ein Kosmidvektor ist.

9. Der Vektor von Anspruch 8 der pVK102 ist, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein Tetrazyklin- und Kanamycingen, eine cos- Stelle des λPhagen und SalI-, EcoRI-, BamHI-, BglII-, HindIII- und SmaI- Restriktionsstellen trggt.

10. Ein Mikroorganismus, der durch einen wie in einem der Ansprüche 7 bis 9 beanspruchten Vektor transformiert worden ist.

11. Der Mikroorganismus von Anspruch 10 der zu dem Genus Gluconobacter gehört.

12. Ein Verfahren zur Herstellung einer wie in den Ansprüchen 1 bis 4 definierten coenzymunabhängigen L-Sorbosondehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, dass ein wie in Anspruch 11 beanspruchter Mikroorganismus oder ein Mikroorganismus des Genus Gluconobacter oder eine Mutante davon kultiviert wird und das Enzym vom zellfreien Extrakt durch die folgenden Schritte isoliert wird:

a) Herstellen einer Meinbranfraktion,

b) solubilisieren der coenzymunabhängigen L-Sorbosondehydrogenase,

c) DEAE-Toyopearlchromatographie,

d) DEAE-Sepharosechromatographie,

e) CM-Sepharosechromatographie,

f) Hydroxyapatitchromatographie und

g) TSK-Gelfiltrationschromatographie.

13. Die Verwendung der wie in jedem der Ansprüche 14 beanspruchten coenzymunabhängigen L-Sorbosondehydrogenase = Herstellung von 2-Keto-L-Gulonsäure aus IrSorboson.

14. Die Verwendung des wie in Anspruch 10 oder 11 beanspruchten Mikroorganismus zur Herstellung von 2-Keto-L-Gulonsäure aus L- Sorboson.