DE69718360T2

DE69718360T2 - Aldehyd Dehydrogenase

Info

Publication number: DE69718360T2
Application number: DE69718360T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Hoshino; Teruhide Sugisawa
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1996-02-19
Filing date: 1997-02-10
Publication date: 2003-10-16
Anticipated expiration: 2017-02-11
Also published as: JPH09224660A; CN1171441A; EP0790301B1; EP0790301A2; ATE231183T1; CN1099461C; DK0790301T3; EP0790301A3; ES2188808T3; ID15955A; US5776742A; DE69718360D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Enzym, nämlich Aldehyddehydrogenase (im Folgenden als ADH bezeichnet), ein Verfahren zur Herstellung desselben und ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure (im Folgenden als 2-KGA bezeichnet) aus L-Sorboson unter Verwendung dieses Enzyms. 2- KGA ist ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von Vitamin C.
Die Reaktion, L-Sorboson in 2-KGA unter Verwendung von Mikroorganismen umzuwandeln, ist bekannt. In US-PS Nr. 3 907 639 wird angegeben, dass Mikroorganismen, die zu der Gattung Acetobacter, Pseudomonas, Escherichia, Serratia, Bacillus, Staphylococcus, Aerobacter, Alcaligenes, Penicillium, Candida und Gluconobacter gehören, diese Reaktion fördern können. Weiterhin berichten Kitamura et al. (Eur. J. Appl. Micro- biol., 2, 1, 1975), dass das Enzym, das L-Sorboson oxidiert, das in Gluconobacter melanogenus IFO 3293 gefunden, wird, weder ein Coenzym noch einen Elektronenakzeptor zur Entwicklung der Enzymaktivität erfordert. Makover et al. (Biotechnol. Bioeng. 17, 1485, 1975) berichten über die Gegenwart von L- Sorboson-Dehydrogenaseaktivität in der teilchenförmigen Fraktion von Pseudomonas putida ATCC 21812 (siehe auch EP-A 0 322 666) und von Gluconobacter melanogenus IFO 3293. Sie deuten auch an, dass Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) oder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP) nicht als Coenzym für das Enzym wirkt. Hoshino et al. [Agric. Biol. Chem., 55, 665 (1991)] reinigten und charakterisierten das Enzym, das die Oxidation von L-Sorboson zu 2-KGA in Gegenwart von NAD oder NADP katalysiert. EP-A 0 606 621 betrifft eine Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase aus G. oxydans DSM Nr.. 4025, die 2-KGA ausgehend von L-Sorboson erzeugen kann.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Mikroorganismen, die zur Gattung Gluconobacter gehören, genauer untersucht und als Ergebnis wurde gefunden, dass die weitere neue ADH, die die Oxidation von L-Sorboson zu 2-KGA katalysiert, aus diesen Mikroorganismen erhalten werden kann. Weiterhin wurde gefunden, dass die ADH, die erfindungsgemäß bereitgestellt wird, L-Sorboson zu 2-KGA in Gegenwart von Elektronenakzeptoren, wie 2,6-Dichlorphenolindophenol (im Folgenden als DCIP bezeichnet), Phenazinmethosulfat (im Folgenden als PMS bezeichnet), Eisen-III-cyanid oder Cytochrom c, oxidiert, dass aber NAD, NADP und Sauerstoff als Elektronenakzeptoren nicht geeignet sind. Somit unterscheidet sich ADH deutlich von der bekannten L-Sorbosondehydrogenase.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die neue ADH bereitzustellen, die auf L-Sorboson wirkt, um 2-KGA zu erzeugen, und die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:
a) Molekulargewicht: 91.000 ± 5.000 Da (bestehend aus zwei homologen Untereinheiten, die jeweils ein Molekulargewicht von 44.000 ± 2.000 Da haben)
b) Substratspezifität: aktiv bei Aldehydverbindungen, L- Sorboson, D,L-Glyceraldehyd und D-Glucose
c) Hemmung: durch Cu²&spplus;, Zn²&spplus;, Ni²&spplus; und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
d) optimaler pH: 6,0-8,5
e) optimale Temperatur: 20-40ºC
f) Stimulator: Ca²&spplus; und Pyrrolochinolinchinon (im Folgenden als PQQ bezeichnet).
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung der neuen ADH bereitzustellen, wie oben definiert, durch Kultivierung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, die Zellen des Mikroorganismus zu zerstören und die ADH aus dem zellfreien Extrakt der zerstörten Zellen des Mikroorganismus zu isolieren und zu reinigen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von 2-KGA aus L-Sorboson unter Verwendung von ADH bereitzustellen, wobei das Verfahren umfasst, dass L-Sorboson mit ADH, wie oben definiert, in Gegenwart eines Elektronenakzeptors in Kontakt gebracht wird und das entstehende 2-KGA aus der Reaktionsmischung isoliert wird.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der gereinigten Probe der ADH, die gemäß den im Folgenden erwähnten Beispielen hergestellt wurde, sind wie folgt:

1. Enzymaktivität

Die neue ADH der vorliegenden Erfindung katalysiert die Oxidation von L-Sorboson zu 2-KGA in Gegenwart eines Elektronenrezeptors gemäß der folgenden Reaktionsformel:
L-Sorboson + Elektronenakzeptor → 2-KGA + reduzierter Elektronenakzeptor
Das Enzym wirkt nicht mit Sauerstoff als Elektronenakzeptor, Dies wurde bestätigt, indem keine katalysierende Aktivität des Enzyms zur Umwandlung von L-Sorboson in 2-KGA festgestellt wurde unter Verwendung von Sauerstoff als möglichem Elektronenakzeptor. Weiterhin wurde kein Sauerstoffverbrauch in der Reaktionsmischung nachgewiesen, was mit einer Sonde für gelösten Sauerstoff nachgewiesen wurde. Jede übliche Verbindung, die die Fähigkeit hat, als Elektronenakzeptor zu wirken, kann jedoch zusammen mit dem Enzym der Erfindung verwendet werden. Als Elektronenakzeptor sind DCIP, PMS, Eisen(III)cyanid oder Cytochrom c bevorzugt.
Der Enzymassay wurde wie folgt durchgeführt:
Die Grundreaktionsmischung zum Nachweis von ADH-Aktivität bestand aus 0,1 mM DCIP, 1,0 mM PMS, 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 2,0 mM L-Sorboson, Enzymlösung und Wasser in einem Endvolumen von 0,5 ml, die direkt vor dem Assay hergestellt wurde. Die Reaktion wurde gestartet bei 25ºC mit L-Sorboson und die Enzymaktivität wurde gemessen als Anfangsreduktionsrate von DCIP bei 600 nm. Eine Einheit Enzymaktivität wurde definiert als die Menge des Enzyms, die die Reduktion von 1 umol DICP pro Minute katalysiert. Der Extinktionskoeffizient von DCIP bei pH 7,0 wurde mit 14,5 mM&supmin; aufgenommen. Eine Referenzküvette enthielt alle obigen Bestandteile außer L-Sorboson.
Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA-Proteinassayreagenz (Pierce, Rockford, IL) gemessen.

2. Substratspezifität

Die Substratspezifität des Enzyms wurde bestimmt unter Verwendung der gleichen Enzymassaymethode, wie unter I) oben beschrieben, außer dass verschiedene Substratlösungen (100 mM) anstelle von L-Sorboson verwendet wurden. Die Substratspezifitäten des gereinigten Enzyms für verschiedene Substrate wurden untersucht (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1

Substratspezifität der ADH

Substrat / Relative Aktivität (%)
L-Sorboson 100
L-Sorbose 0
D-Sorbitol 0
n-Propanol 0
iso-Propanol 0
D-Ribose 33,33
D,L-Glyceraldehyd 788,9
D-Glucoson 77,8
D-Mannose 62,2
D-Fructose 0
D-Glucose 188, 9
Die relative Aktivität der ADH aus Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) für D,L-Glyceraldehyd und D-Glucose war etwa acht- bzw. zweimal höher als die für L-Sorboson.

3. Optimaler pH

Der Zusammenhang zwischen der Reaktionsrate der ADH und den pH-Werten der Reaktionsmischung wurde bestimmt unter Verwendung der gleichen Enzymassaymethode, wie unter 1) oben beschrieben, außer dass verschiedene phs und Puffer verwendet wurden (siehe Tabelle 2). Tabelle 2 Optimaler pH für die ADH-Aktivität
a) Die Daten sind ausgedrückt als Prozentanteil der Aktivität bei pH 8,0 mit Tris-HCl-Puffer

4) pH-Stabilität

Das Enzym wurde in Puffern mit verschiedenen pH-Werten 6 Tage bei 0ºC stehen gelassen und dann wurde die Restaktivität gemessen unter Verwendung der gleichen Enzymassaymethode, wie unter 1) oben beschrieben. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 3 gezeigt. Das gereinigte Enzym war bei einem pH von ungefähr 7,5 relativ stabil. Tabelle 3 pH-Stabilität der ADH-Aktivität
a) Die Daten sind ausgedrückt als Prozentanteil der Aktivität bei pH 7,5 mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer

5) Thermostabilität

Die Thermostabilität oder Wärmestabilität des Enzyms wurde getestet, indem es 5 Minuten bei verschiedenen Temperaturen in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) inkubiert wurde und dann das behandelte Enzym sofort in Eiswasser herabgekühlt wurde. Die Restaktivität wurde gemessen unter Verwendung der gleichen Enzymassaymethode, wie unter 1) oben beschrieben. Das Enzym war bei bis zu 35ºC stabil und verlor etwa 50 bis 60% seiner Aktivität, nachdem es bei 40 bzw. 45ºC inkubiert worden war (siehe Tabelle 4, Spalte A). Tabelle 4 Wirkung der Temperatur auf die Stabilität und die Aktivität von ADH
* nicht getestet
(A) Enzymstabilitätstest
(B) Test zur Auswertung der optimalen Temperatur Die Daten sind ausgedrückt als Prozentanteil der Aktivität bei 25ºC.

6) Optimale Temperatur

Die Enzymaktivitäten wurden gemessen bei Temperaturen von 20 bis 45ºC. Die optimale Temperatur des Enzyms war 25ºC (siehe Tabelle 4, Spalte B).

7) Wirkung von Metallionen, Enzyminhibitoren und PQQ auf die Aktivität von ADH

Die Wirkungen von Metallionen, Enzyminhibitoren und PQQ auf die ADH-Aktivität wurden untersucht, indem die Aktivität gemessen wurde unter Verwendung der gleichen Testmethode, wie unter 1) oben beschrieben. Jede Verbindungslösung wurde in die Grundreaktionsmischung gerührt und die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet (siehe Tabellen 5 und 6). Tabelle 5 Wirkungen verschiedener Metalle auf die Aktivität von ADH
Wie in Tabelle 5 gezeigt, wurde die Enzymreaktion in Gegenwart von 0,04 bis 0,2 mN Ca²&spplus; stark um etwa das 3- bis 4,5-fache stimuliert, wohingegen Cu²&spplus;, Fe³&spplus;, Mg²&spplus; Mo&sup6;&spplus;, Ti&sup4;&spplus;, Zn²&spplus; und Ni²&spplus; die Enzymaktivität hemmten. Tabelle 6 Wirkungen von Enzyminhibitoren und PQQ auf die Aktivität von ADH
Wie in Tabelle 6 gezeigt, hemmte EDTA die Enzymaktivität stark und jeweils 1,87 mM N-Ethylmaleimid und Monoiodacetat hemmten die Aktivität teilweise um 24 bzw. 13%. Die Enzymreaktion wurde leicht stimuliert um 5 bis 27% in Gegenwart von Natriumfluorid (1,87 mM), Chinin (0,95 bis 1,87 mM), Natriumfluoracetat (0,95 bis 1,87 mM) und Na&sub2;HAsO&sub4;·7 H&sub2;O (1,87 mM). Die Zugabe von 0,01 mM PQQ stimulierte die Aktivität um etwa 50%.

8) Wirkungen der Substratkonzentration auf die Reaktionsrate

Die Schnelligkeit der Oxidationsreaktion bei verschiedenen Konzentrationen von L-Sorboson von 0,15 bis 7,54 mM wurde gemessen, um den Km-Wert für L-Sorboson zu bestimmen. Die scheinbare Michaelis-Konstante wurde berechnet mit 0,85 mM aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm auf Basis der Reaktionsgeschwindigkeit, wenn DCIP als Elektronenakzeptor für die Reaktion verwendet wurde.

9) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des Enzyms wurde mit einer Gelfiltrationssäule (Sephacryl S-400 HR) gemessen. Das scheinbare Molekulargewicht des Enzyms wurde berechnet mit 91.000 ± 5.000 Da im Vergleich zu Molekulargewichtsmarkerproteinen. Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ergab eine einzige Bande mit einem Molekulargewicht von 44.000 ± 2,000 Da. Dies zeigt, dass das Enzym aus zwei homologen Untereinheiten aufgebaut ist.

10) Reinigungsverfahren

Die Reinigung der ADH kann im Prinzip mit jeder Kombination bekannter Reinigungsmethoden bewirkt werden, wie Fraktionierung mit Fällungsmitteln, z. B. Ammoniumsulfat, Polyethylenglycol und dgl., Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Gelelektrophorese und Aussalzen und Dialyse.
Wie oben erwähnt, kann die erfindungsgemäß bereitgestellte ADH hergestellt werden, indem ein geeigneter Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, die Zellen des Mikroorganismus aufgerissen werden und die ADH aus dem zellfreien Extrakt der aufgerissenen Zellen des Mikroorganismus isoliert und gereinigt wird.
Die Mikroorganismen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, sind Mikroorganismen, die zur Gattung Gluconobacter gehören, die ADH produzieren können, wie vorher definiert. Funktionelle Äquivalente, Subkulturen, Mutanten und Varianten dieses Mikroorganismus können auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Ein bevorzugter Stamm ist Gluconobacter oxydans. Der Stamm, der am meisten bevorzugt für die vorliegende Erfindung verwendet wird, ist Gluconobacter oxydans DSM 4025, der bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen in Göttingen, Deutschland, unter der DSM-Nr. 4025 am 17. März 1987 hinterlegt wurde. Hinterleger war The Oriental Scientific Instruments Import and Export Corporation für Institute of Microbiology, Acedemia Sinica, 52 San-Li-He Rd., Peking, Volksrepublik China. Der wirksame Hinterleger war dieses Institut, dessen volle Adresse wie folgt ist: The Institute of Microbiology, Academy of Sciences of China, Haidian, Zhongguancun, Peking 100080, Volksrepublik China.
Außerdem wurde eine Subkultur des Stamms auch bei dem Fermentation Research Institute (jetzt National Institute of Bioscience and Human-Technology), Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter den Bedingungen des Budapester Vertrags unter der Hinterlegungsnummer Gluconobacter oxydans, DMS Nr. 4025 FERM BP-3812 am 30. März 1992 hinterlegt. Der Hinterleger war Nippon Roche Research Center, 200 Kajiwara Aza Sotokochi, Kamakura-shi, Kanagawaken 427, Japan.
Weiterhin offenbart die Europäische Patentschrift Nr. 0 278 447 die Eigenschaften dieses Stamms.
Der Mikroorganismus kann in einem wässrigen Medium, das mit geeigneten Nährstoffen ergänzt ist, unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden. Die Züchtung kann bei einem pH von 4,0 bis 9,0, bevorzugt 6,0 bis 8,0 durchgeführt werden. Der Kultivierungszeitraum variiert abhängig von pH, Temperatur und Nährmedium, das verwendet wird, und ist bevorzugt etwa 1 bis 5 Tage. Ein bevorzugter Temperaturbereich zur Durchführung der Züchtung ist etwa 13 bis etwa 36ºC, bevorzugt 18 bis 33ºC.
Es ist gewöhnlich erforderlich, dass das Kulturmedium Nährstoffe enthält, wie assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glycerin, D-Mannit, D-Sorbit, Erythrit, Ribit, Xylit, Arabit, Inosit, Dulcit, D-Ribose, D-Fructose, D-Glucose und Saccharose, bevorzugt D-Sorbit, D-Mannit und Glycerin; und verdaubare Stickstoffquellen, wie organische Substanzen, z. B. Pepton, Hefeextrakt, Bäckerhefe, Fleischextrakt, Casein, Harnstoff, Aminosäuren, Maiseinweichwasser und dgl. Verschiedene anorganische Substanzen können auch als Stickstoffquellen verwendet werden, wie Nitrate, Ammoniumsalze und dgl. Weiterhin enthält das Kulturmedium gewöhnlich anorganische Salze, wie Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Eisen-II- und Eisen-III-chloride, Calciumcarbonat und dgl.
Im Folgenden wird eine Ausführungsform zur Isolierung und Reinigung der ADH aus dem Mikroorganismus nach der Züchtung kurz beschrieben.
(1) Zellen werden aus der flüssigen Kulturbrühe geerntet durch Zentrifugation oder Filtration.
(2) Die geernteten Zellen werden mit Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einer Pufferlösung mit einem geeigneten pH gewaschen.
(3) Die gewaschenen Zellen werden in der Pufferlösung suspendiert und mit Hilfe eines Homogenisators, Sonicators, einer French-Presse oder der Behandlung mit Lysozym und dgl. zerstört oder aufgerissen, was eine Lösung aufgerissener Zellen ergibt.
(4) Die ADH wird aus dem zellfreien Extrakt der aufgerissenen Zellen isoliert und gereinigt, bevorzugt aus der Cytosolfraktion des Mikroorganismus.
Die erfindungsgemäß bereitgestellte ADH ist geeignet als Katalysator zur Herstellung von Carbonsäuren aus Aldehyden, insbesondere zur Herstellung von 2-KGA aus L-Sorbose über L- Sorboson.
Die Reaktion sollte bei pH-Werten von etwa 6,0 bis etwa 9,0 in Gegenwart von Elektronenakzeptoren, z. B. DCIP, PMS, Wurster's Blau, Eisen(III)cyanid, Coenzym Q, Cytochrom c und dgl. in einem Lösungsmittel, wie Tris-HCl-Puffer, Phosphatpuffer und dgl. durchgeführt werden.
Ein bevorzugter Temperaturbereich zur Durchführung der Reaktion ist etwa 10 bis etwa 50ºC. Wenn der pH und die Temperatur auf etwa 7,0 bis 8,0 bzw. 20 bis 40ºC eingestellt werden, liefert die Reaktion gewöhnlich die besten Ergebnisse.
Die Konzentration von L-Sorboson in einem Lösungsmittel kann variieren abhängig von anderen Reaktionsbedingungen, ist aber im Allgemeinen etwa 0,5 bis 50 g/l, am meisten bevorzugt etwa 1 bis etwa 30 g/l.
Bei der Reaktion kann die ADH auch in immobilisiertem Zustand mit einem geeigneten Träger verwendet werden. Jedes Mittel, um Enzyme zu immobilisieren, das im Stand der Technik allgemein bekannt ist, kann verwendet werden. Z. B. kann das Enzym direkt an eine Membran, Körnchen oder dgl. aus einem Harz mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen gebunden werden oder es kann an das Harz über verbrückende Verbindungen mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, wie Glutaraldehyd, gebunden werden.
Zusätzlich zu obigen sind die gezüchteten Zellen auch nützlich zur Herstellung von Carbonsäuren aus Aldehyden, insbesondere zur Herstellung von 2-KGA aus L-Sorboson.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Herstellung von ADH

Alle Arbeitsschritte wurden bei 8ºC durchgeführt und der Puffer war 0,05 M Kaliumphosphat (pH 7,0), wenn nicht anders angegeben.

(1) Züchtung von Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP- 3812)

Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) wurde auf einem Schrägagar, der 5,0% D-Mannit, 0,25% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 1,75% Maiseinweichwasser, 5,0% Bäckerhefe, 0,5% Harnstoff, 0,5% CaCO&sub3; und 2,0% Agar enthielt, bei 27ºC 4 Tage lang gezüchtet. Eine Schlinge voll Zellen wurde in 50 ml Saatkulturmedium geimpft, das 8% L-Sorbose, 0,05% Glycerin, 0,5% Harnstoff, 0,25% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 1,75% Maiseinweichwasser, 5,0% Bäckerhefe und 1,5% CaCO&sub3; in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben enthielt und bei 30ºC 1 Tag auf einem Drehschüttler (180 Upm) gezüchtet. Jeweils 10 ml dieser Kultur wurden in 2 500-ml-Erlenmeyer- Kolben überführt, die 100 ml des gleichen Saatkulturmediums enthielten und auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, gezüchtet. Die so hergestellte Saatkultur wurde verwendet, um 2 l Medium in einem 3-1-Fermenter zu impfen, das 10% L- Sorbose, 0,05% Glycerin, 0,25% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 3,0% Maiseinweichwasser, 6,25% Bäckerhefe und 0,15% Antischaummittel enthielt. Die Fermentationsparameter waren 800 Upm für die Rührgeschwindigkeit und 0,5 WM (Luftvolumen/Volumen Medium/Minute) für die Belüftung bei einer Temperatur von 30ºC. Der pH wurde mit Natriumhydroxid während der Züchtung auf 7,0 gehalten. Nach 40 Stunden Züchtung wurden 8 l Kulturbrühe, die die Zellen von Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) enthielten, unter Verwendung von 4 Sätzen von Fermentern geerntet. Die leicht rötlichen Zellen wurden oben auf der Bäckerhefe, die bereits in dem Medium vorhanden war, pelletisiert durch Zentrifugation mit 8.000 Upm (10.000 · g), dann wurde die obere Schicht sorgfältig mit einem Spatel entfernt und die Zellen wurden einmal mit 0,85% NaCl-Lösung gewaschen. Als Ergebnis wurden 46 g des Nassgewichts der Zellen von Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP-3812) aus 8 l Brühe erhalten.

(2) Herstellung der Cytosolfraktion

Die Zellpaste (46 g) wurde in 138 ml Puffer suspendiert und durch eine French-zellpresse gedrückt. Nach Zentrifugation zur Entfernung intakter Zellen wurde der Überstand als zellfreier Extrakt bezeichnet und dann der zellfreie Extrakt mit 100.000 · g 60 Minuten lang zentrifugiert. Der entstehende Überstand (150 ml) wurde als lösliche Fraktion von Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) bezeichnet. Nachdem diese Fraktion gegen den Puffer dialysiert worden war, wurden 100 ml der Fraktion mit der spezifischen Aktivität von 1,42 Einheiten pro mg Protein für die nächste Reinigungsstufe verwendet.

(3) Diethylaminoethyl-(im Folgenden als DEAE bezeichnet)- cellulose-Säulenchromatographie

Das Dialysat (100 ml) wurde auf eine Säule mit DEAE-Cellulose (Whatman DE-52, 3 · 50 cm), die mit dem Puffer equilibriert worden war, gegeben und mit dem Puffer gewaschen, um kleinere Proteine zu eluieren. Dann wurde ein linearer Gradient von NaCl von 0,0 bis 0,8 M zu dem Puffer zugegeben. Die Hauptenzymaktivität wurde bei NaCl-Konzentrationen im Bereich von 0,45 bis 0,55 M eluiert. Dann wurden die gesammelten aktiven Fraktionen gegen den Puffer dialysiert.

(4) DEAE-Sepharosesäulenchromatographie

Die dialysierte aktive Fraktion (58 ml) aus der vorherigen Stufe wurde auf eine Säule mit DEAE-Sepharose (Pharmacia, 1,5 · 50 cm), die mit dem Puffer equilibriert worden war, aufgegeben. Nachdem die Säule mit dem Puffer gewaschen worden war, der 0,2 M NaCl enthielt, wurde ein linearer Gradient von NaCl von 0,2 bis 0,8 M zu dem Puffer zugegeben. Die Enzymaktivitäten wurden bei NaCl-Konzentrationen im Bereich von 0,38 bis 0,42 M eluiert. Die Fraktionen, die der ADH- Aktivität entsprachen, wurden gesammelt.

(5) Q-Sepharosesäulenchromatographie

Die gesammelten aktiven Fraktionen (15,8 ml) aus der vorherigen Stufe wurden gegen den Puffer dialysiert und auf eine Säule mit Q-Sepharose (Pharmacia, 1,0 · 20 cm), die mit dem Puffer equilibriert worden war, gegeben. Die Säule wurde mit dem Puffer gewaschen und ein linearer Gradient von NaCl von 0,0 bis 0,6 M zu dem Puffer zugegeben. Die ADH entsprechenden Aktivitäten wurden bei NaCl-Konzentrationen im Bereich von 0,34 bis 0,37 M eluiert.
Eine Zusammenfassung der Reinigungsstufen des Enzyms ist in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Reinigung von an Farbstoff gebundener ADH aus Gluconobacter oxydans DSM 4025

(6) Reinheit des isolierten Enzyms

Das gereinigte Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 98,2 Einheiten pro mg Protein (0,2 mg/ml) wurde für die folgende Analyse verwendet:
Das Molekulargewicht der nativen ADH wurde mit Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer Größenausschlussgelsäule (TSK Gel G3000 SWXL-Säule, 7,8 · 300 mm), die mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), der 0,3 M NaCl enthielt, equilibriert worden war, bei 254 nm und einer Durchflussrate von 1,0 ml/min bestimmt. Cyanocobalamin (1,35 kDa), Myoglobin (17 kDa), Ovalbumin (44 kDa), g-Globulin (158 kDa) und Thyroglobulin (670 kDa) wurden als Molekulargewichtsstandards verwendet. Das gereinigte Enzym zeigte einen einzigen Peak und das Molekulargewicht wurde bestimmt als etwa 91.000 ± 5.000 Da.
In Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) zeigte das Enzym eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 44.000 ± 2.000. Aus diesen Ergebnissen wurde abgeleitet, dass die gereinigte ADH aus zwei homologen Untereinheiten bestand.

(7) Identifikation des Reaktionsproduktes

Die Reaktionsmischung, die das gereinigte Enzym (0,02 mg), L- Sorboson (2 mg) und PMS (0,1 mg) in 0,5 ml des Puffers enthielt, wurden 1,5 Stunden lang bei 30ºC inkubiert. Als Ergebnis wurde das Produkt identifiziert als 2-KGA im Vergleich zu der authentischen Probe.

Beispiel 2

2-KGA-Produktion mit gereinigtem ADH

Eine Reaktionsmischung, die das gereinigte ADH (0,04 mg Protein, hergestellt gemäß Beispiel 1), L-Sorboson (4 mg) und PMS (0,2 mg) in 1,0 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) enthielt, wurde 1,0 Stunden bei 25ºC unter sanftem Schütteln inkubiert. Als Ergebnis wurde 2-KGA in einer Rate von etwa 2,3 mg/h gebildet.

Claims

1. Gereinigte Aldehyddehydrogenase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

a) Molekulargewicht: 91.000 ± 5.000 Da (bestehend aus zwei homologen Untereinheiten, die jeweils ein Molekulargewicht von 44.000 ± 2.000 Da haben)

b) Substratspezifität: aktiv bei Aldehydverbindungen, L-Sorboson, D,L-Glyceraldehyd und D-Glucose

c) Hemmung: durch Cu²&spplus;, Zn²&spplus;, Ni²&spplus; und EDT'A

d) pH-Optimum: 6,0-8,5

e) optimale Temperatur: 20-40ºC

f) Stimulator: Ca²&spplus; und PQQ

2. Aldehyddehydrogenase nach Anspruch 1, die von einem Mikroorganismus stammt, der zur Gattung Gluconobacter gehört.

3. Aldehyddehydrogenase nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus Gluconobacter oxidans DSM Nr. 4025 (FERM BP- 3812) ist.

4. Verfahren zur Herstellung von gereinigter Aldehyddehydrogenase nach Anspruch 1, das umfasst, dass ein Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, die Zellen des Mikroorganismus zerstört werden und die Aldehyddehydrogenase aus dem zellfreien Extrakt der zerstörten Zellen des Mikroorganismus isoliert und gereinigt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP-3812) ist.

6. Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L- Sorboson, das umfasst, dass L-Sorboson mit gereinigter Aldehyddehydrogenase gemäß Anspruch 1 in Gegenwart eines Elektronenakzeptors in Kontakt gebracht wird und die entstehende 2-Keto-L-gulonsäure aus der Reaktionsmischung isoliert wird.