KR100187512B1

KR100187512B1 - 박테리아의 배양방법

Info

Publication number: KR100187512B1
Application number: KR1019890014288A
Authority: KR
Inventors: 히데아키 야마다; 도루 나가사와
Original assignee: 이토 타이조; 니토가가쿠고교 가부시키가이샤
Priority date: 1988-10-06
Filing date: 1989-10-05
Publication date: 1999-04-01
Also published as: DE68923419T2; RU1838408C; ES2076944T3; EP0362829A2; ATE124992T1; CZ562189A3; EP0362829A3; CN1041782A; AR241936A1; US5089411A; EP0362829B1; CZ280901B6; PL161863B1; AU4257389A; DE68923419D1; AU622489B2; CN1039030C; KR900006505A

Abstract

내용 없음.

Description

박테리아의 배양방법

본 발명은 박테리아의 배양방법에 관한 것으로서, 특히 니트릴 수화효소의 활성이 우수한 미생물인 Rhodococcusrhodochrous를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근, 미생물과 효소들을 본래의 상태나 고정된 상태로 여러 가지 단일 또는 복잡한 화학반응에서 촉매로 이용하려는 시도가 늘고 있다.

니트릴 수화효소는 본 발명자중의 한사람인 야마다 히데아키에 의해 발견되었는바, 이것은 니트릴을 수화시켜 아미드를 생산하게 되는 효소이다(참고문헌:Agric.Biol.Chem.46 1165(1982)). 이효소의 이용에 관한 한가지 예로서 니트릴 수화효소를 갖는 박테리아의 존재하에서 니트릴로부터 아미드를 제조하는 방법이 있다(참고문헌:일본특허공고 제 37951/1984호, 미국특허 제4,637,982호).

이에 본 발명자는 아미드의 제조방법을 제공하되, 특히 방향족 니트릴로부터 아미드를 제조하는데 적합한 방법을 제공하고자 한다(참고문헌 :일본특허출원 제231744/1988호, 미국특허 출원 제243,986호). 이런상황에서, 활성이 우수한 니트릴 수화효소를 갖는 Rhodococcus rhodochrous박테리아를 높은 수율로 생산할 수 있는 방법은 대단히 유익할 것이다.

이에, 본 발명은 배양중인 박테리아의 배지에 우레아(urea)나 그의 특정유도체 그리고 코발트 이온 같은 특정물질을 첨가시킴으로써, 상기와 같은 문제점을 해결하고자 하는데 그 목적이 있는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 니트릴 수화효소를 생산할 수 있는 Rhodococcus rhodochrous박테리아를 배양시켜 니트릴 수화효소의 활성을 갖도록 하는 박테리아 세포 제조시에 우레아 및 다음 구조식 (I)에서 (Ⅲ)으로 나타낸 그의 유도체중 적어도 한가지와 코발트이온을 배지에다 첨가시켜서 되어지는 박테리아의 배양방법임을 특징으로 한다.

R₁R₂NCONR₃R₄(I)

윗식에서, R₁,R₂,R₃와 R₄는 각각 -H,-CH₃, 또는 -C₂H₅일 수 있지만 모든 치환기가 -H가 되지는 않고,

R₅R₆NCOOC₂H₅(Ⅱ)

윗식에서, R₅과 R₆는 각각 -H, -CH₃또는 -C₂H₅이다.

NH₂CSNH₂(Ⅲ)

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 의하면 Rhodococcus rhodochrous박테리아의 배양과정중에 우레아 및 그의 유도체중 적어도 한가지와 코발트 이온을 배지에다 첨가시키게 되면 단위 배양액당 니트릴 수화효소의 활성이 현저하게 증가하게 된다.

이와 같은 활성증가는 아마도 세포농도(즉, 수율)및/또는 세포활성(즉, 세포에서의 니트릴 수화효소의 양)이 증가함으로써 이루어지는 것이라 생각된다.

본 발명에서 우레아 및 그의 유도체와 코발트이온의 첨가는 세포의 활성을 증가시키는데 매우 효과적이라 할 수 있다.

I. Rhodococcus rhodochrous 박테리아

본 발명에 사용된 박테리아는 니트릴 수화효소의 활성과 니트릴 수화능력을 갖는 Rhodococcus rhodochrous 박테리아로서, 특히 방향족 니트릴까지도 수화시켜 이에 상당하는 아미드를 제조하게 된다. 이러한 박테리아의 특정한 예로, 균주J-1인 Rhodococcus rhodochrous(FERM BP-1478)가 있는데, 이것은 일본 특허출원 제 231744/1988호와 미국특허 출원 제243,986호에 기재되어 있다. 균주 J-1에 대한 상세한 사항이 이들 특허 출원에 다음과 같이 기재되어 있다.

[유래와 기탁]

균주 J-1은 일본 교토 사쿄구의 토양에서 채취하여 단리시킨 것이며, 1987년 9월 18일에 일본 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업연구소에 부다페스트 조약에 의거 기탁번호 FERM BP-1478로 국제 기탁하였다.

[세균학적 성질 ]

(가)형태학적 성질

(1)세포의 형태와 크기 : 0.9내지 1.0μ X3 내지 10μ

(2)다형성 :

배양초기단계에서는 긴 막대 형태이고 곧은 막대모양으로 성장하면서 끊어져 짧은 바실러스 형태로 나누어지게 된다.

(3)운동성 : 없음

(4)포자의 형성 : 형성되지 않음

(5)그림 염색성 : 양성

(6)항산성 : 음성

(7)이호성 과립구 : 검출됨

(나) 다양한 배양 배지에서의 배양특성(30℃)

(1)부얀 한천 평면 배양 :

직경1mm의 원형(48시간), 불규칙하고, 매끄럽고, 표면이 다소 건조함. 편평하고, 불투명하며, 엷은 오렌지계 분홍색임.

(2)부얀 한천 사면 배양:

약간 요철형이고, 매끄러운 표면의 섬유형.

단면이 다소 건조하고, 엷은 오렌지계 분홍색임.

(3)부얀 액상 배양:

세포막을 형성하면서 왕성하게 배양됨.

세포배양중에 배양액이 뿌옇게 흐려지고 침전이 생김.

(4)부얀 겔화 천자 배양:

천자부위를 따라 원추형으로 표면에서 잘 배양되지만 하층에서는 배양되지 않음.

젤라틴은 액화되지 않음.

(5)리트머스 유 : 불변

(다)생리학적 성질

(1)질산염의 환원성 : 양성

(2)탈질산 반응 : 음성

(3)MR테스트 : 음성

(4)VP테스트 : 음성

(5)인돌의 형성 : 양성

(6)황화수소의 형성 : 양성

(7)녹말의 가수분해 : 음성

(8)스트르산의 이용

코커(Kocur)배양배지 : 음성

크리스챤센(Christiansen)배양 배지 : 양성

(9)무기질소 원료의 이용

질산염 : 양성

암모늄염 : 양성

(10)색소의 형성 : 음성

(11)우레아제 : 양성

(12)옥시다제 : 음성

(13)카탈라제 : 양성

(14)섬유질의가수분해 : 음성

(15)배양범위:pH5내지 10, 온도 10 내지 41℃　

(16)산소에 대한 성질 : 호기성

(17)티로신의 분해 : 양성

(18)아데닌의 분해 : 양성

(19)포스파타제 : 양성

(20)트윈 80(Tween 80)의 가수분해 : 양성

(21)O-F 테스트 : 0(약함)

(22)내열성(72℃의 10%탈지유에서 15분동안) : 없음

(23)당으로부터의 산 및 기체의 생성 :

당 산 기체

L-아라비노스 - -

D-크실로스 - -

D-글루코스 + -

D-만노스 - -

D-프럭토스 + -

말토스 + -

슈가 + -

락토스 - -

트레할로스 - -

D-소르비톨 + -

D-만니톨 + -

글리세롤 + -

(24)단일 탄소 원에서의 배양

이노시톨 -

말토스 +

D-만니톨 +

람노스 -

D-소르비톨 +

m-하이드록시 벤조산 +

소디움 아디페이트 +

소디움 벤조에이트 +

소디움 시트레이트 +

소디움 락테이트 +

테스토테트론 +

L-티로신 +

글리세롤(1%)(w/v) (+)

트레할로스 (+)

P-하이드록시 벤조산(1%)(w/v) +

(+ : 양성, - : 음성, (+) : 약한양성)

(25)지방산과 세포벽의 분석:

불포화 및 직쇄모양의 포화 지방산과 투베르쿨로스테아르산을 포함. 미콜산의 TLC에서 단일 반점을 나타냄.

상술한 바와 같은 세균학적 성질을 Bergy's Manual of Systematic Bacteriology(1986)에 의거하여 분리하면 균주J-1은 호기성이고, 그림-양성이고, 약한 항산성을 갖고 있으며, 카탈라제-양성이고 편모가 없고, 내생포자 비생성 박테리아이다.

이 균주는 배양 초기단계에서 균사체와 같은 긴 바실러스 형태로 존재하며 가지모양으로 성장해나가면서 짧은 바실러스 형태로 분절되게 된다. 이러한 형태들로 보아 균주 J-1은 Nocardia형 박테리아라고 볼 수 있다.

지방산 조성분석을 통해서 이 박테리아는 투베르쿨로스 테아르산을 함유하는 불포화 및 포화 직쇄지방산을 포함하고 있음이 밝혀졌다. 미콜산의 TLC에서 표준 박테리아Rhodococcus rhodochrous(IFO 3338)와 동일한 Rf값을 갖는 단일 반점을 나타냈으므로 이 박테리아는 Mycobacterium속과는 구별되며, 미콜산의 조성(탄소 원자의 수)으로 보아 Nocardia 박테리아와도 구별된다.

다른 생화학적 성질을 조사한 결과, 이 박테리아는 Rhodococcus rhodochrous로 판명되었다.

Ⅱ. 우레아와 그의 유도체

본 발명에서 우레아와 상기 구조식(I) 내지 (Ⅲ)으로 나타낸 그 유도체는 여기서 효소의 유도물질로 작용하게 되나, 지금까지 알려진 전형적인 효소유도물질로서는 니트릴 또는 아미드가 있고, 그중에서도 크로톤아미드라고 알려진 바에 의하면, 우레아와 그 유도체가 니트릴 수화효소를 효과적으로 유도해 낼수 있다는 사실은 전혀 예측되지 않은 것이다. 놀랍게도, 우레아와 그 유도체를 다른 효소 유도물질과 혼합시키지 않고 단독으로 사용할 때는 종래의 효소물질보다 높은 효율성을 나타내게 된다.

더욱이 우레아는 다른 효소유도물질보다 비싸지 않기 때문에 본 발명의 방법은 경제적 측면에서 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 우레아 유도체중 상기 구조식(I)의 화합물의 예로는 메틸우레아, 에틸우레아, 1,1-디메틸우레아와 1,3-디메틸우레아가 있다.

그리고, 상기 구조식(Ⅱ)의 화합물로는 우레탄과 메틸우레탄이 있다.

상기 구조식(Ⅲ)의 화합물로는 티오우레아가 있다.

우레아나 그 유도체는 한 뱃치에 한번 또는 연속적으로 배양배지에 첨가되게 된다. 여기에서 인용한 연속적이라는 용어는 계속적으로와 점점 많은 양으로를 의미한다.

Ⅲ. 코발트 이온

니트릴 수화효소는 배양배지에 우레아나 그 유도체를 단순히 첨가시킴으로써 얻어지는 것이 아니므로 본 발명에서는 배지에 코발트 이온을 첨가해주게 된다(코발트 이온의 존재는 일본특허 출원 제 231744/1988호와 미국특허출원 제 243,986호에서 밝혀진 바와 같이 박테리아에 의한 니트릴수화 효소의 생산에 필수적이다).

보통, 코발트이온은 수용액 상태인 배양배지에 수용성 코발트 화합물을 첨가시켜줌으로써 형성되게 된다. 수용성 코발트 화합물들은 화학백과사전에 규명되어 있으므로 이 기술분야에 있는 자가 쉽게 선택할 수 있고, 이들 화합물들 중의 하나를 사용할 수 있을 것이다.

코발트 화합물의 전형적인 예로는 코발트 이가 이온(CO²⁺)또는 코발트 삼가이온(CO³⁺)들 수 있고, 특히 염화 코발트, 황산코발트, 아세트산 코발트, 브롬화 코발트와 붕산 코발트 같은 코발트 이가 이온(CO²⁺)이 있다.

덧붙여서, 비타민B₁₂와 금속성 코발트도 코발트의 원료로 사용될 수 있다. 비타민 B₁₂는 내압증기 멸균기로 이온화되는 착화물의 형태로 코발트를 포함하고 있는 반면, 금속성 코발트는 배양과정중에 있는 미생물의 산화작용에 의해 이온화된다.

Ⅳ. 배양과 니트릴 수화효소의 생산

본 발명의 Rhodococcus rhodochrous박테리아는 우레아나 그 유도체와 코발트 이온을 배지에 첨가해야 할 때를 제외한 목적에 적합한 어떠한 조건하에서도 배양될 수 있다.

예를 들면, 미리 양이 정해진 우레아나 그 유도체 그리고 코발트 이온을 다음에 나타낸 바와 같은 기본배지에 첨가하고 15 내지 50℃온도에서, 바람직하기로는 20내지 45℃, 더욱 바람직하게는 pH 7 내지 9, 30℃에서 30시간 또는 그 이상의 시간, 바람직하기로는 40시간 또는 그 이상의 시간동안 (상한선은 120시간)배양시킬 수 있다.

배양배지에 있는 우레아나 그 유도체의 총농도는 약 1내지 30g/ℓ, 바람직하게는 2내지 20g/ℓ, 더욱 바람직하게는 5 내지 15g/ℓ이면 적당하다. 한편, 코발트 이온의 농도는 CoCl₂를 기초로 계산하여 5 내지 15mg/ℓ이다.

배양 배지 조성은 다음과 같다.

ⅰ)배양배지 A

성분 함량(배지 1ℓ)

K₂HPO₄13.4g

KH₂PO₄6.5g

NaCl 1.0g

MgSO₄·7H₂O 0.2g

비타민 혼합물 0.1㎖

증류수 나머지( pH7.0)

* 조성(용액 1ℓ)

바이오틴 2.0μg

칼슘 팬토테네이트 0.4mg

이노시톨 2.0mg

니코틴산 0.4mg

티아민 하이드로클로라이드 0.4mg

피리독신 하이드로클로라이드 0.4mg

P-아미노벤조산 0.2 ng

리보플라빈 0.2mg

폴산 0.01ng

증류수 나머지

ii)배양배지 B

K₂HPO₄0.5g

KH₂PO₄0.5g

MgSO₄·7H₂O 0.5g

효모추출액 3.0g

증류수 나머지(pH7.2)

iii)배양배지 C

클루코스 10g

K₂HPO₄0.5g

KH₂PO₄0.5g

MgSO₄·7H₂O 0.5g

효모추출액 1.0g

펩톤 7.5g

증류수 나머지(pH 7.2)

V.실험예

효소활성도의 정의와 측정

(1)니트릴 수화효소 활성도의 측정방법

니트릴수화효소 활성도는 다음과 같이 측정된다.

기질로서 벤조니트릴(20mM)1.0ml와 3-사이아노피리딘(1M) 1.0mℓ 또는 아크릴로 니트릴(1M)1.0mℓ; 인산칼륨완충제(0.1M, pH7.0) 0.5mℓ; 그리고 미리 정해진 양의 박테리아 세포(배양액에서 분리해 냄)로 이루어진 반응용액 2mℓ을 20℃에서 미리 정해진 시간동안 반응시켰고, 1N HCl 0.2mℓ을 첨가시키는 것으로 반응을 끝냈다.

(2)니트릴 수화효소 활성도의 정의

활성도는 다음에 정의된 바와 같이 특정 활성도(S.A.)와 총 활성도(T.A.)로 결정한다.

S.A.:μmole 생성된 아미드/mg-세포/min

T.A.:μmole 생성된 아미드/ml-배양배지/min

[실시예 1]

미리 정해진 양의 우레아를 CoCl₂10mg/ℓ가 들어 있는 기본배지 C에 첨가시킨다. 이렇게 준비된 배지 60ml에 미리 준비된 균주 J-1인 Rhodococcus rhodochrous(FERM BP-1478, 기본배지 C를 사용하여 얻은 것) 배양액 4ml을 28℃에서 96시간동안 흔들어 주면서 배양시켰다.

비교를 해보기 위해 우레아나 CoCl₂중 하나만을 포함한 배지에서도 배양을 하였다.

그 결과를 표 1에 나타내었다.

표에 따르면, 우레아와 CoCl를 둘다 첨가하는 것이 니트릴수화효소의 생성을 증가시키는데 필수적이라는 사실을 알 수 있다.

[실시예2]

균주 J-1은 10mg/ℓ CoCl의 존재하에 상술한 기본배지 C에서 28℃의 온도에서 48내지 120시간동안 상기 실시예 1에서와 같이 배양을 실시하였다. 이때 미리 정해진 양의 효소 유도물질(우레아와 크로톤아미드)의 첨가가 있는냐 없느냐에 따른 결과를 다음 표2에 나타내었다.

표2에 나타난 값들은 T.A.와 S.A.값으로서 활성도 측정과정에서 최대T.A.값을 나타낼 때 얻어진 것이다.

표에서 뚜렷하게 보여지듯이, 유도물질로서 우레아를 단독으로 사용하는 것이 니트릴 수화효소의 생성을 증가시키는데 효과적이다

[실시예 3]

미리 정해진 양의 우레아 유도체를 10mg/ℓ CoCl를 포함한 상기 배지C에 첨가하였다. 이 배양 배지 60mℓ에 미리 준비된 균주J-1인 Rhodococcus rhodochrous 배양액 4mℓ을 넣고 28℃에서 96시간동안 흔들어주면서 배양시켰다.

비교를 위해 메틸우레아나 CoCl하나만을 포함한 배지에서도 배양을 하였다.

그 결과는 다음 표3에 나타나 있으며, 여기에 표시된 T.A.와 S.A.값은 활성도 측정과정에서 최대 T.A.값을 나타낼 때 얻어진 것이다. 이 표에서 참고자료로서 우레아 7.5g/ℓ를 사용했을 경우도 삽입시켰다.

표에 명백히 나타나 있듯이, 우레아 유도체와 CoCl를 모두 사용하는 것이 니트릴 수화효소의 생성을 증가시키는데 필수적임을 알 수 있다.

Claims

니트릴 수화효소를 생산할 수 있는 Rcoccus rhodochrous박테리아로서 Rcoccus rhodochrous균주(J-1)(FERM BP-1478)를 배양시켜 니트릴 수화효소의 활성을 갖게 되는 박테리아 세포 제조시에 실질적으로 크로톤아미드가 함유되어 있지 않는 배양배지에다 우레아 및 다음 구조식(I) 내지 (Ⅲ)으로 나타낸 그 유도체 중 적어도 하나와 코발트 이온을 첨가시켜서 되어지는 Rhodococcus rhodochrous종 박테리아의 배양방법.

R₁R₂NCONR₃R₄(I)

윗 식에서, R₁,R₂,R₃와 R4는 각각 -H,CH₃또는 -C₂H₅일 수 있지만, 모든 치환기가 -H가 되지는 않고,

R₅R₆NCOOC₂H₅(Ⅱ)

윗 식에서, R5와 R6는 각각 -H,-CH₃또는 -C₂H₅이다.

NH₂CSNH₂(Ⅲ)
제1항에 있어서, 우레아가 배양배지에 첨가되어짐을 특징으로 하는 박테리아의 배양방법.
제1항에 있어서, 배지에서의 우레아나 그유도체의 전체 농도는 1내지 30g/ℓ인 것을 특징으로 하는 박테리아의 배양방법.
제1항에 있어서, 코발트 이온의 농도는 CoCl₂를 기초로 계산하여 5 내지 15mg/ℓ인 것을 특징으로 하는 박테리아의 배양방법.