CZ280901B6

CZ280901B6 - Způsob kultivace bakterií

Info

Publication number: CZ280901B6
Application number: CS895621A
Authority: CZ
Inventors: Hideaki Yamada; Toru Nagasawa
Original assignee: Hideaki Yamada; Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
Priority date: 1988-10-06
Filing date: 1989-10-03
Publication date: 1996-05-15
Also published as: KR100187512B1; EP0362829B1; AR241936A1; CN1041782A; DE68923419T2; ATE124992T1; EP0362829A2; AU622489B2; CN1039030C; ES2076944T3; DE68923419D1; CZ562189A3; AU4257389A; PL161863B1; US5089411A; RU1838408C; KR900006505A; EP0362829A3

Abstract

Do živného prostředí, v němž se pěstují bakterie čeledi Rhodococus rhodochrous, schopné produkovat nitrilhydratázu, se přidá alespoň jedna látka ze skupiny močovina a její deriváty a současně kobaltové ionty, čímž je možno podstatně zvýšit produkci nitrilhydratázy uvedeným bakteriálním kmenem.ŕ

Description

Vynález se týká způsobu kultivace bakterií čeledi Rhodicoccus rhodochrous s vysokou účinností hydratázy nitrilů ve vysokém výtěžku.

Dosavadní stav techniky

V poslední době se stále více využívá mikroorganismů a jejich enzymů jako takových nebo v imobilizovaném stavu jako katalyzátorů pro různé jednoduché nebo složité chemické reakce.

Nitrilhydratáza byla objevena jako enzym, schopný hydratovat nitrily za vzniku odpovídajících amidů, jak bylo popsáno v publikaci Hideaki Yamada, Agric. Biol. Chem., 46, 1165 (1982). Jedno z množství využití tohoto enzymu je způsob pro výrobu amidů z nitrilů za přítomnosti bakterií, které produkují uvedený enzym, jak bylo uvedeno ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 37951/1984 a v US patentovém spisu č. 4 637 982.

Dále byl navržen způsob výroby amidů, který byl zvláště vhodný pro přípravu amidů z aromatických nitrilů, jak bylo popsáno v japonské patentové přihlášce 231744/1988 a v US patentové přihlášce č. 243 986. Za těchto okolností by bylo velmi žádoucí najít způsob, kterým by bylo možno zajistit ve vysokém výtěžku produkci buněk mikroorganismu Rhodococcus rhodochrous s vysokou účinností uvedeného enzymu a ve vysokém výtěžku.

Způsobem podle vynálezu je tento problém vyřešen tak, že se do živného prostředí, v němž se bakterie pěstují, přidávají specifické látky, to je močovina nebo určité deriváty močoviny a ionty kobaltu.

Předmětem vynálezu je tedy způsob kultivace bakterií čeledi Rhodococcus rhodochrous v běžném živném prostředí s obsahem asimilovatelných zdrojů uhlíku, dusíku a minerálních solí tak, že se do živného prostředí přidá alespoň jedna sloučenina ze skupiny, tvořené močovinou a jejími deriváty následujících vzorců I až III:

r₃r₂nconr₃r₄ (I), kde

R_x, R₂, R₃ a R₄ znamenají atom vodíku, methyl nebo ethyl za předpokladu, že alespoň jeden z těchto substituentů má odlišný význam od atomu vodíku, r₅r₆ncooc₂h₅ (II), kde

R₅ a Rg znamenají atom vodíku, methyl nebo ethyl a nh₂csnh₂ (III),

-1CZ 280901 B6 a kobaltové ionty, načež se v živném prostředí pěstují buňky Rhodococcus rhodochrous, schopné produkce nitrilhydratázy s vysokou účinností.

Přidání alespoň jedné sloučeniny ze skupiny močoviny a jejích derivátů obecných vzorců I až III a kobaltových iontů do živného prostředí v průběhu kultivace bakterií Rhodococcus rhodochrous podstatně zvýší účinnost nitrilhydratázy na jednotku živného prostředí.

Tento vzestup účinnosti nitrilhydratázy na jednotku živného prostředí je pravděpodobné možno připsat vzestupu buněčné koncentrace, tj. výtěžku a/nebo aktivity buněk, tj. množství nitrilhydratázy v buňkách.

Při provádění způsobu podle vynálezu je přidávání močoviny nebo jejích derivátů a kobaltových iontů zvláště účinné při zvyšování aktivity bakteriálních buněk.

I. Bakterie Rhodococcus rhodochrous

Při provádění způsobu podle vynálezu se užívají bakterie Rhodococcus rhodochrous, produkující účinnou nitrilhydratázu, schopnou hydratovat nitrily, a to i aromatické nitrily, za vzniku odpovídajících amidů. Specifickým příkladem těchto bakterií může být Rhodococcus rhodochrous, kmen J-l (FERM BP-1478), který byl popsán v japonské patentové přihlášce č. 231744/1988 a v US patentové přihlášce č. 243 986, které již byly svrchu uvedeny. Podrobnosti, týkající se kmene J-l, jsou rovněž uvedeny ve svrchu zmíněných patentových přihláškách.

1. Původ a uložení

Kmen J-l byl izolován z půdy v Sakyo-ku, Kyoto, Japonsko a byl uložen 18. září 1987 do veřejné sbírky kultur Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan, a bylo mu uděleno číslo FERM BP-1478 podle Budapešťské úmluvy.

2. Bakteriologické vlastnosti

a) morfologické vlastnosti

1) tvar a rozměr buněk: 0,9 - 1,0 μιη x 3 - 10 μπι,

2) polymorfismus: prodloužená tyčinkovítá buňka v počátečním stupni kultivace vyrůstá do formy dlouhého vlákna, opatřeného zářezy a pak se dělí do krátké bacilární formy.

3) pohyblivost: bakterie je nepohyblivá.

4) tvorba spor: spory se netvoří

5) barvení granul:pozitivní

6) vazba kyseliny:negativní

7) heterofilni granulocity: byly pozorovány

-2CZ 280901 B6

b) vlastnosti v kultuře na různých prostředích při 30 °C,

1) agarová plotna s bujónem: po 48 hodinách kruhové kolonie s průměrem 1 mm, nepravidelné, hladké, spíše suchého povrchu, ploché, poloprůhledné, bledě oranžovorůžové.

2) Šikmý agar s bujónem: vláknité kolonie s hladkým povrchem a s mírné vypouklým, poměrně suchým příčným řezem, bledě oranžovorůžové.

3) Kapalné prostředí s bujónem: bohatý růst, vytváří se mem- brána. Živné prostředí se zakaluje a při delším růstu buněk se vytváří sraženina.

4) Prostředí s želatinou a bujónem, opatřené vyhloubeními:

Dobrý růst na povrchu ve tvaru nálevky okolo vyhloubení, pod povrchem pouze chudý růst. Nedochází ke zkapalnění želatiny.

5) Lakmusové mléko: nedochází k žádné zrněné.

c) Fyziologické vlastnosti:

pozitivní negativní negativní negativní negativní pozitivní negativní

9)

10)

11)

12)

13)

14)

15) redukce dusičnanů: denitrif ikace: MR test: VP test: tvorba indolu: tvorba sirovodíku: hydrolýza škrobu:

využití kyseliny citrónové: Kocurovo prostředí: negativní Christensenovo prostředí: pozitivní využití anorganického zdroje dusíku: dusičnany: amonné soli: tvorba pigmentů: ureáza: oxidáza: kataláza: hydrolýza celulózy:negativní rozmezí pozitivní pozitivní negativní pozitivní negativní pozitivní růstu:

16) )

18)

19)

20)

21)

22) pH 5 - 10 teplota: 10-41 ’C vůči kyslíku: aerobní tyrosinu: adeninu:

23) chování rozklad rozklad fosfatáza: hydrolýza Tween 80: pozitivní O-F test: odolnost proti minut při 72 °C: tvorba kyseliny a plynu ze sacharidů:

pozitivní pozitivní pozitivní (slabý) vyšší teplotě (v 10% odstředěném mléce 15 žádná

-3CZ 280901 B6 kyselina_____________plyn

L-arabinóza	-	—
D-xylóza	-	-
D-glukóza	+	-
D-mannóza	-	-
D-fruktóza	+	-
maltóza	+	-
sacharóza	+	-
laktóza	-	-
trehalóza	-	-
D-sorbitol	+	-
D-mannitol	+	-
glycerol	+	-

24) růst na jediném zdroji uhlíku:

inositol	-
maltóza	+
D-mannitol	+
thamnóza	-
D-sorbitol	+
kyselina m-hydroxybenzoová	+
adipát sodný	+
benzoát sodný	+
citronan sodný	+
laktát sodný	+
testotetron	+
L-tyrosin	+
glycerol (1 g/ml)	( + )
trehalóza	( + )
kyselina p-hydroxybenzoová (1 g/ml) (+): znamená slabě pozitivní	+

25) Analýza mastných kyselin ve stěně buněčné: stěna obsahuje nenasycené a nasycené alifatické kyseliny s přímým řetězcem a kyselinu tuberkulostearovou. Při chromátografii mykolové kyseliny na tenké vrstvě je možno pozorovat jedinou skvrnu.

Vzhledem k vlastnostem mikroorganismu tak, jak byly svrchu uvedeny, je možno s ohledem na Bergy’s Manual of Systématic Bacteriology (1986), kmen J-l klasifikovat jako aerobní, gram-pozitivní, kyselinu slabě vážící, na katalázu pozitivní a endospory nevytvářející tyčinku bez bičíku. Tento kmen má tvar prodloužené tyčinky a mycelium se v počáteční fázi růstu nejprve větví a pak se dělí na krátké bacilární formy. Vzhledem k těmto vlastnostem je možno považovat kmen J-l za bakterii typu Nocardia.

Analýza složení alifatických kyselin prokázala, že bakterie obsahuje nenasycené a nasycené alifatické kyseliny s přímým řetězcem včetně kyseliny tuberkulostearové. Vzhledem k tomu, že kyselina mycelová při chromatografii na tenké vrstvě vytváří jedinou skvrnu s tímtéž R_f, jako standardní bakterie Rhodococcus rhodochrous (IFO 3338), odlišuje se bakterie od rodu Mycobakterium a současně se odlišuje také od bakterií Nacardia vzhledem ke složení (počet uhlíkových atomů) v mykolové kyselině.

-4CZ 280901 B6

Podle výsledků těchto výzkumů a dalších biochemických vlastností byl tedy uvedený kmen identifikován jako Rhodococcus rhodochrous.

II. Močovina a její deriváty

Při provádění způsobu podle vynálezu působí močovina a její deriváty vzorců I až III, uvedených svrchu, jako látky, indukující tvorbu enzymů, avšak, jak je známo, typickými látkami, které indukují tvorbu enzymů, jsou nitrily nebo amidy, například amid kyseliny krotonové, takže je zcela neočekávané, že močovina a její deriváty mohou účinně indukovat produkci nitrilhydratázy. Je překvapující, že močovina a její deriváty v případě, že jsou užity jako takové a nikoliv v kombinaci s jinou látkou, schopnou indukovat produkci enzymu, mají daleko větší účinnost než běžné látky s tímto účinkem. Mimoto je močovina daleko levnější než ostatní látky, schopné indukovat produkci enzymů, takže způsob podle vynálezu je možno s výhodou použít v průmyslovém měřítku z ekonomického hlediska.

Příkladem sloučenin obecného vzorce I mohou být methylmočovina, ethylmočovina, 1,1-dimethylmočovina a 1,3-dimethylmočovina.

Příkladem sloučenin obecného vzorce II mohou být urethan a methylurethan.

Sloučenina obecného vzorce III je thiomočovina.

Močovina a její deriváty se k živnému prostředí mohou přidávat najednou nebo postupně. Pod pojmem postupně se rozumí jak přidávání kontinuální, tak přidávání po jednotlivých podílech.

III. Kobaltové ionty

Nitrilhydratázu není možno získat pouhým přidáním močoviny nebo jejích derivátů do živného prostředí, další podstatnou složkou živného prostředí při provádění způsobu podle vynálezu jsou ionty kobaltu. Přítomnost kobaltových iontů je podstatná pro výrobu nitrilhydratázy bakterií, které se pěstuji při provádění způsobu podle vynálezu, jak již bylo uvedeno ve svrchu zmíněné japonské patentové přihlášce č. 231744/1988 a v US patentové přihlášce č. 243 986.

Kobaltový ion se obvykle vytváří přidáním ve vodě rozpustné sloučeniny kobaltu k vodnému živnému prostředí. Ve vodě rozpustné sloučeniny kobaltu jsou známy z chemických encyklopedií a každý odborník snadno zvolí některou z těchto sloučenin.

Typickými příklady sloučenin kobaltu jsou ty, které poskytují ionty kobaltnaté nebo kobaltité, zvláště však ionty kobaltnaté, například chlorid kobaltnatý, síran kobaltnatý, octan kobaltnatý, bromid kobaltnatý a boritan kobaltnatý.

Mimoto je možno jako zdroje kobaltu použít také vitamin B₁₂a kovový kobalt. Vitamin B₁₂ obsahuje kobalt ve formě komplexu, který je ionizován při sterilizaci v autoklávu, kdežto kovový ko

-5CZ 280901 B6 balt je oxidován oxidační funkcí mikroorganismu v průběhu jeho kultivace.

IV. Kultivace mikroorganismu a produkce enzymu

Bakterii Rhodococcus rhodochrous je možno při provádění způsobu podle vynálezu pěstovat za jakýchkoliv podmínek, které splňují požadovaný účel až na to, že je zapotřebí přidat do živného prostředí močovinu nebo její deriváty a ionty kobaltu.

Je například možno přidat předem určené množství močoviny nebo jejích derivátů a kobaltových iontů do dále uvedeného základního prostředí a pak provádět kultivaci při teplotě 15 až 50 “C, s výhodou 20 až 45 °C, ještě výhodněji při teplotě 30 °C a při pH 7 až 9 přibližně 30 hodin nebo déle, s výhodou 40 hodin nebo ještě déle až například do 120 hodin.

Celková koncentrace močoviny nebo jejích derivátů v živném prostředí se může pohybovat v rozmezí 1 až 30 g/litr, s výhodou 2 až 20 g/litr a ještě výhodněji 5 až 15 g/litr, koncentrace kobaltových iontů se má pohybovat v rozmezí 5 až 15 mg/litr a přepočítává se na chlorid kobaltnatý.

Základní prostředí:

Živné prostředí A složka množství na 1 litr prostředí hydrogenfosforečnan draselný dihydrogenfosforečnan draselný chlorid sodný síran hořečnatý . 7H₂O vitaminová směs^{* x}destilovaná voda ^x složení vitaminové směsi na 1 litr roztoku: biotin panthothenát vápenatý inositol kyselina nikotinová thiaminhydrochlorid pyridoxinhydrochlorid kyselina p-aminobenzoová riboflavin kyselina listová destilovaná voda

Živné prostředí B hydrogenfosforečnan draselný dihydrogenfosforečnan draselný síran hořečnatý . 7H₂O extrakt z kvasnic destilovaná voda

13,4 g

6,5 g

1,0 g

0,2 g

0,1 ml zbytek (pH 7,0)

2,0 μg 0,4 mg

2,0 mg

0,4 mg

0,2 ng

0,2 mg 0,01 ng zbytek

0,5 g

3,0 g zbytek (pH 7,2)

-6CZ 280901 B6

Živné prostředí C glukóza hydrogenfosforečnan draselný dihydrogenfosforečnan draselný síran hořečnatý . 7H₂O extrakt z kvasnic pepton destilovaná voda g

0,5 g

1,0 g

7,5 g zbytek (pH 7,2)

V. Pokusná část

Měření a definice enzymatické účinnosti

1) Způsob měření účinnosti nitrilhydratázy

Účinnost nitrilhydratázy byla stanovena následujícím způsobem:

ml reakčního roztoku s obsahem 1,0 ml benzonitrilu (20 mM), 1,0 ml 3-kyanpyridinu (1 M) nebo 1,0 akrylonitrilu (1 M) jako substrátu, 0,5 ml pufru s fosforečnanem draselným o koncentraci 0,1 M a při pH 7,0 a předem stanovené množství bakteriálních buněk, izolovaných ze živného prostředí, se nechá reagovat při teplotě 20 C po předem stanovenou dobu a pak se reakce ukončí přidáním 0,2 ml IN kyseliny chlorovodíkové.

2) Definice účinnosti nitrilhydratázy

Účinnost byla stanovena k určení specifické účinnosti (S.A.) a celkové účinnosti (T.A.), tak jak jsou dále definovány.

S. A.: μιηοΐ produkovaného amidu/mg buněk/min.

T. A. : μιηοΐ produkovaného amidu/ml prostředí/min.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

Předem stanovená množství močoviny se přidají ke svrchu uvedenému základnímu prostředí C s obsahem 10 mg/1 chloridu kobaltnatého. Do 60 ml každého vzorku výsledného živného prostředí se přidají 4 ml předběžné kultury Rhodococcus rhodochrous, kmen J-l (FERM BP-1478), získané při použití základního prostředí C a kultura se pěstuje za stálého třepání při teplotě 28 °C celkem 96 hodin.

Pro srovnání se mikroorganismus pěstuje obdobným způsobem v prostředí, které obsahuje buď pouze močovinu, nebo pouze chlorid kobaltnatý.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1. Z této tabulky je zřejmé, že je podstatné přidat jak močovinu, tak chlorid kobaltnatý pro zvýšení produkce enzymu nitrilhydratázy.

-7CZ 280901 B6

Tabulka 1

CoCl₂ (mg/1)	močovina g/1	koncentrace buněk mg/ml	benzonitril	3-kyanopvridin	akrvlonitril
T.A.	S.A.	T.A.	S.A.	T.A.	S.A.
0	0	4,61	0,11	0,02	0,75	0,16	3,59	0,70
0	7,5	5,53	0,11	0,02	1,00	0,18	4,31	0,78
10	0	5,28	1,09	0,21	3,70	0,70	17,7	3,35
10	2,0	5,17	25,2	4,87	39,6	7,66	189	36,5
10	5,0	5,03	65,6	13,0	162	32,2	774	154
10	7,5 10	4,99	210	42,1	519	104	2480	497
10	4,72	186	39,4	471	99,7	2250	477
10	15	4,26	191	44,9	515	121	2460	578
10	20	3,96	162	40,9	363	91,7	1740	438

Přiklad 2

J-l byl pěstován obdobným ’C způsobem jako v příkladu 1 celkem 48 až 120 hodin ve svrchu uvedeném zápřítomnosti 10 mg/litr chloridu kobaltnasoučasně bylo nebo nebylo přidáno předem stanovené množství indukujících produkci enzymu, a to močoviny nebo tabulce 2.

Kmen při teplotě 28 kladním prostředí C za tého, jiných látek, amidu kyseliny krotonové, jak je uvedeno v následující

V tabulce 2 jsou uvedeny hodnoty T.A. a S.A., které byly získány, přičemž maximální hodnoty T.A. byly značeny v průběhu měření účinnosti enzymu.

Jak je z tabulky 2 zřejmé, přispívá použití samotné močoviny jako látky, indukující produkci enzymu, velmi účinně ke zvýšení produkce nitrilhydratázy bakteriálními buňkami.

Tabulka 2

živné prostředí	CoCl 2 mg/1	močovina g/i	kroton amid g/1	benzonitril
T.A.	S.A
C	10	—	2,0	23,2	6,0
C	10	-	4,0	24,6	6,1
C	10	-	7,5	16,6	5,8
C	10	5,0	2,0	32,6	6,5
C	10	7,5	-	213	42,2

Příklad 3

Předem stanovená množství derivátu močoviny byla přidána ke svrchu zmíněnému základnímu prostředí C s obsahem 10 mg/1 chloridu kobaltnatého. K 60 ml každého z výsledných živných prostředí byly přidány 4 ml předběžné kultury Rhodococcus rhodochrous, kmen J-l (FERM BP-1478), získané při použití základního prostředí C a mikroorganismus byl pak kultivován 96 hodin při teplotě 28 °C.

Pro srovnání byla ještě prováděna kultivace v prostředí, které obsahovalo pouze methylmočovinu, nebo pouze chlorid kobaltnatý.

-8CZ 280901 B6

Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 3, jsou vyjádřeny jako hodnoty T.A. a S.A., přičemž maximální hodnoty T.A. byly zaznamenávány v průběhu měření účinnosti. Pro kontrolu jsou uvedeny také výsledky, získané při použití 7,5 g/litr močoviny.

Jak je z tabulky zřejmé, je společné použití derivátu močoviny a chloridu kobaltnatého podstatné pro dosažení zvýšené produkce nitrilhydratázy.

Tabulka 3

C0CI2 látka, indukující množství induktoru koncentrace 3-kyanopyridin

mg/1	produkci enzymu	g/1	buněk mg/ml	T.A.	S.A.
0	methylmočovina	7,5	4,78	0	0
10	--	0	4,94	3,20	0,65
10	methylmočovina	7,5	5,72	230	40,2
10	ethylmočovina	7,5	5,76	245	42,5
10	1,1-dimethylmcčovina	7,5	6,44	150	23,3
10	1,3-dimethylmočovina	7,5	4,16	104	25,0
10	methylurethan	7,5	6,19	166	26,8
10	thiomočovina	7,5	1,99	40,2	20,2
10	močovina	7,5	4,99	519	104

Claims

1. Způsob kultivace bakterií čeledi Rhodococcus rhodochrous v běžném živném prostředí s obsahem asimilovatelných zdrojů uhlíku, dusíku a minerálních solí, vyznačuj ící se tím, že se do živného prostředí přidá alespoň jedna sloučenina ze skupiny, tvořené močovinou a jejími deriváty následujících vzorců I až III r₁r₂nconr₃r₄ (I) kde

Rj, R₂, R₃ a R₄ znamenají atom vodíku, methyl nebo ethyl za předpokladu, že alespoň jeden z těchto symbolů má odlišný význam od atomu vodíku, r₅r₆ncooc₂h₅ (II) kde

Rg a Rg znamenají atom vodíku, methyl nebo ethyl a nh₂csnh₂ (III) a kobaltové ionty, načež se v živném prostředí pěstují buňky Rhodococcus rhodochrous, schopné produkce nitrilhydratázy s vysokou účinností.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako bakterie Rhodococcus rhodochrous, schopné produkovat nitrilhydratázu, pěstuje Rhodococcus rhodochrous, kmen J-l, FERM BP-1478.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se do živného prostředí přidává močovina.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se celková koncentrace močoviny nebo jejích derivátů pohybuje v rozmezí 1 až 30 g/1.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že koncentrace kobaltových iontů je 5 až 15 mg/1, přepočítáno na chlorid kobaltnatý.