BR0109480B1 - Método de cultivo de microorganismo - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE CULTIVO DE MICROORGANISMO".

CAMPO DA TÉCNICA A presente invenção refere-se a um método de produção de cé- lulas microbianas de cultura tendo alta atividade de enzima de hidratase de nitrila dentro de um curto período e em um alto rendimento.

FUNDAMENTO DA TÉCNICA

Nos últimos anos, do ponto de vista de conservação de energia, atividade renovada tem sido vista em tentativas em utilizar microorganismos ou suas enzimas como um biocatalisador para produção de matéria. A hi- dratase de nitrila é conhecida como uma enzima que hidrata nitrilas para desse modo produzir as amidas correspondentes. Em particular, ela é útil como um catalisador para produzir acrilamida a partir de acrilonitrila.

Como microorganismos tendo habilidade de produção de hidra- tase de nitrila, por exemplo, são conhecidas matérias pertencentes ao gêne- ro Nocardia [vide Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 54-129190], gênero Rhodococcus [vide Pedido de Patente Japo- nês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 2-470], gênero Rhizobium [vide Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 5-236977], gênero Klebsiera [Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 5-30982], gênero Aeromonas [Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 5-30983], gênero Agrobacterium [Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 8-154691], gênero Bacillus [Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 8- 187092], gênero Pseudonocardia [Pedido de Patente Japonês Aberto à Ins- peção Pública (kokai) N9 8-56684] e similar. Em cada uma das publicações acima, um método de cultivo de microorganismos que produzem atividade de hidratase de nitrila é descrito.

Ainda, com relação ao uso de fonte de carbono no cultivo, é descrito na seção "Effect of carbon sources" do Applied Microbiology and Biotechnology (1991) 34:783-788 que "na produção de hidratase de nitrila através do uso de R. rhodochrous J1, a fonte de carbono mais adequada é glicose a 2%".

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Nenhum dos métodos descritos nas publicações acima mencio- nadas é industrialmente prático como um método de obtenção de células microbianas de cultura tendo atividade de hidratase de nitrila dentro de um curto período e em alto rendimento.

Para o propósito de indução de enzima, íons de cobalto são adi- cionados à solução de cultura de acordo com o método descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 2-470, embora seja difícil através do emprego de tal concentração de íon de cobalto sempre realizar obtenção estável de células microbianas de cultura tendo atividade de enzima de hidratase de nitrila dentro de um curto período de tempo e em alto rendimento. Ainda, adição, de uma grande quantidade de íons de co- balto ao meio causará inibição de crescimento acentuada, e, do contrário, não é possível se obter células microbianas de cultura tendo atividade de hidratase de nitrila dentro de um curto período e em alto rendimento.

Em adição, a fim de se obter células microbianas de cultura ten- do atividade de hidratase de nitrila, dentro de um curto período e em alto rendimento, glicose ou sacarose é considerada preferida como uma fonte de carbono, e uso de cetoses tal como frutose ou álcoois de açúcar tal como manitol têm sido convencionalmente considerado cientificamente impossível. O objetivo da presente invenção é prover um método de obten- ção de células microbianas de cultura tendo atividade de hidratase de nitrila dentro de um curto período e em alto rendimento que resolva os problemas acima.

Os presentes inventores realizaram estudos intensos sobre con- dições de cultura para obter industrialmente células microbianas tendo ativi- dade de hidratase de nitrila dentro de um curto período e em alto rendimen- to. Como resultado, os inventores constataram ser possível se obter células microbianas altamente ativas bem como reduzir a inibição de crescimento mesmo na presença de uma grande quantidade de íons de cobalto em solu- ção de cultura permitindo a presença de uma cetose, por exemplo, frutose e/ou um álcool de açúcar, por exemplo, manitol, na solução de cultura. Des- se modo, a presente invenção foi realizada. A saber, a presente invenção é um método de cultivo de um mi- croorganismo tendo habilidade de produção de hidratase de nitrila em um substrato de meio contendo um álcool de açúcar e/ou uma cetose, e um íon de cobalto. Aqui, a concentração de íon de cobalto é de preferência 15 mg/L ou mais em termos de C0CI2. Adicionalmente, o álcool de açúcar é de prefe- rência representado pela fórmula geral (I) que segue: (I) onde n representa um número inteiro de 2 a 4.

Ainda, a cetose é representada pela fórmula geral (II) que segue: (Π) onde n representa 3.

De acordo com a presente invenção, um álcool de açúcar e/ou uma cetose são usados como uma fonte de carbono. No entanto, não é con- vencionalmente conhecido que a presença desses compostos de açúcar em uma solução de cultura permita a redução de inibição de crescimento atri- buível a íon de cobalto. A presente invenção será descrita daqui em diante em detalhes.

Os microorganismos de interesse de acordo com a presente in- venção não são particularmente limitados, contanto que eles tenham habili- dade de produção de hidratase de nitrila. Especificamente, exemplos prefe- ridos de microorganismos incluem Nocardia sp. N-775 descrito na Publica- ção de Patente Japonesa Examinada (kokoku) N9 56-17918, Rhodococcus rhodocohrccus J-1 descrito na Publicação de Patente Japonesa Examinada (kokoku) N9 06-55148, Klebsiella sp. MCI2609 descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 05-30982, Aeromonas sp. MCI2614 descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 05-30983, Citrobacter freundii MCI2615 descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 05-30984, Agrobacte- rium rhizogenes IAM 13570 e Agrobacterium tumefaciens descritos no Pedi- do de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 05-103681, Xanthobacter fiavas JCM1204 descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 05-161495, Erwinia nigrifluens MAFF03-01435, Enterobacter sp. MCI2707 descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 05-236975, Streptomyces sp. MCI2691 descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 05-236976, Rhizobium sp. MCI2610, Rhizobium sp. MCI2643, Rhizobium loti IAM 13588, Rhizobium legminosarum IAM 12609 e Rhizobium merioti IAM12611 descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 05-236977, Candida guilliermondii NH-2, Pantoea agglo- merans NH-3 e Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae NH-26T2 descri- tos no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 05- 15384, Agrobacterium radiobacter SC-C15-1 descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 06-14786, Bacillus smithii SC- J05-1 descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 07-25494, Pseudonocardia thermophila ATCC19285 descrito no Pedido de Patente Japonês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 08-56684 e Pseudonocardia thermophila JCM3095 descrito no Pedido de Patente Japo- nês Aberto à Inspeção Pública (kokai) N9 09-275978.

Adicionalmente, os microorganismos de interesse de acordo com a presente invenção também incluem transformantes que podem ser qualquer hospedeiro onde um gene de hidratase de nitrila clonado dos mi- croorganismos acima seja expresso.

Os seus exemplos preferidos incluem a cepa da bactéria MT- 10822 (FERM BP-5785) descrita na USP 5.807.730, onde Escherichia coli é usada como um hospedeiro típico.

Como um substrato de meio, exemplos de uma fonte de carbono incluem um álcool de açúcar representado pela fórmula geral (I) e/ou uma cetose representada pela fórmula geral (II). Especificamente, frutose, manitol e sorbitoi são preferidos. Essas fontes de carbono podem ser também usa- das em uma combinação adequada delas. (I) (onde n representa um número inteiro de 2 a 4) (II) (onde n representa 3) Qualquer fonte de fornecimento de íon de cobalto pode ser em- pregada contanto que ela seja um sal de cobalto divalente ou trivalente.

Seus exemplos incluem cloreto de cobalto, sulfato de cobalto, acetato de cobalto, brometo de cobalto e borato de cobalto. Em adição, vitamina B12 ou similar pode ser a fonte de cobalto. Ainda, a concentração de íon de cobalto é de 15 mg/L ou mais em termos de C0CI2, de preferência 15a 300 mg/L.

Fonte de nitrogênio tal como amônia, sulfato de amônio, cloreto de amônio e nitrato de amônio; fonte nutritiva orgânica tal como extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, peptonas e hidrolisato de soja; e sais inorgânicos tal como fosfatos, sais de magnésio, sais de potássio, sais de sódio, sais de ferro, sais de cobalto e outros sais minerais em traço, são selecionados para a preparação do meio. Conforme necessário, um indutor de enzima tal como uréia ou seus derivados pode ser adicionado.

Ainda, se necessário, a fonte de carbono, íons de cobalto ou si- milar podem ser adicionados em porções enquanto cultivando.

Enquanto cultivando, o pH deve ser mantido normalmente em 5 a 10, de preferência 7 a 9. A temperatura de cultivo é normalmente 25 a 50e C, de preferência 30 a 40Q C, e o cultivo é aerobicamente realizado por 1 a 3 dias.

MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO

Daqui em diante, a presente invenção será descrita mais especi- ficamente com referência aos Exemplos que seguem. No entanto, a pre- sente invenção não é limitada a esses Exemplos. [Exemplo 1] (1) Cultivo de micróbios (1) Condições de pré-cultura: (Composição do meio) frutose 2% (p/v), polipeptona 5% (p/v) (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), ex- trato de levedura 0,3% (p/v) (Oriental Yeast Co., Ltd.), KH2P04 0,1% (p/v), K2HP04 0,1% (p/v), MgS04 7H20 0,1% (p/v), pH 7 (método de cultura) 100 ml do meio foram postos em um frasco Erlenmeyer de 500 ml e o frasco foi vedado com um chumaço de algodão. O meio foi esteriliza- do através de uma autoclave por 20 minutos a 1219 C. Então, a cepa Rho- dohro rhodococcus J-1 (FERM BP-1478) foi inoculada nele e a mistura foi submetida a cultivo com agitação por 48 horas a 309 C. (2) Condições de cultura principal (Composição do meio) Meio inicial: extrato de levedura 0,2% (p/v), KH2P04 0,1% (p/v), K2HP04 0,1% (p/v), MgS047H20 0,1% (p/v), CoCI26H20 0,002% (p/v), sul- fato de amônio 0,025% (p/v), frutose 2% (p/v), uréia 2% (p/v), etanol 0,4% (v/v), Pluronic L61 0,1% (p/v) (Asahi Denka Kogyo K.K.), pH 7 Meio pós-adição: frutose 20% (p/v), etanol 5% (v/v), sulfato de amônio 6% (p/v), pH 6,5 (Método de cultura) Dois litros do meio inicial foram postos em um fermentador de mini jarra de 3 litros (Takasugi Seisakusho) e esterilizados através de uma autoclave por 20 minutos a 1219 C. No entanto, à parte do acima, frutose, etanol e uréia foram assepticamente filtrados (usando papel filtro de 0,45 mícron fabricado pela Advantec Toyo Kaisha, Ltd.) e então adicionados ao meio. Após o término da pré-cultura acima, 20 ml da solução pré-cultivada foram inoculados nela e o meio resultando foi cultivado por 44 horas a 30Q C sob condições de uma pressão de entrada de tanque de 0,098 MPa, uma taxa de agitação de 600 rpm, uma quantidade de fluxo de ar de 1 wm, e pH 7.

Em adição, de 20 horas para frente do início do cultivo, o meio pós-adição foi adicionado em uma taxa de fluxo de 20 ml/h até o final do cul- tivo. (2) Determinação da atividade de hidratase de nitrila 0,1 ml da solução de cultura e 4,90 ml de solução de tampão de fosfato 1/20M (pH 7,7) foram misturados, e mais 5 ml de solução de tampão de fosfato 1/20M (pH 7,7) contendo 5,0% (p/v) de acrilonitrila foram adicio- nados, e a mistura foi então reagida por 10 minutos a 109 C. Após o término da reação, células microbianas foram filtradas e separadas através de cen- trifugação. Acrilamida no sobrenadante foi quantificada através de cromato- grafia gasosa (GC-14B fabricada pela Shimadzu Corporation). Análise foi realizada sob as condições que seguem: uso de uma coluna de vidro de 1m embalada com Porapack PS (material de embalagem de coluna fabricado pela Waters Corporation); temperatura da coluna de 2309 C; uso de FID a 2509 C.

Em seguida, uma unidade de atividade de enzima na determina- ção da atividade acima é definida como a conversão de 1 pmol de acriloni- trila em acrilamida em 1 minuto. Com relação à atividade, a investigação foi realizada por solução de cultura e por célula microbiana. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Na Tabela, tomando 100 como o valor para a ativi- dade sob o cultivo na presença de 0,002% (p/v) de CoCI2 6H20, os valores de atividade sob as outras condições de cultura são indicados como valores de atividade relativos (%). [Exemplos 2 a 5] Os Exemplos 2 a 5 foram realizados da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto pelo uso do meio de cultura principal para o qual as con- centrações que seguem de CoCI26H20 foram adicionadas ao invés de 0,002% (p/v) de CoCI2.6H20: 0,005% (p/v) para 0 Exemplo 2, 0,01% (p/v) para o Exemplo 3, 0,02% (p/v) para o Exemplo 4 e 0,03% (p/v) para o Exemplo 5. Os resultados são mostrados na Tabela 1. [Exemplos 6 e 7] Os Exemplos 6 e 7 foram realizados da mesma maneira que no Exemplo 3, exceto pelo uso de ambos meios de cultura de pré-cultura e principal aos quais manitol (Exemplo 6) ou sorbitol (Exemplo 7) foi adiciona- do ao invés de frutose. Os resultados são mostrados na Tabela 1. [Exemplo Comparativo 1 ] O Exemplo Comparativo 1 foi realizado da mesma maneira que no Exemplo 1, exceto pelo uso de meios de pré-cultura e cultura principal aos quais glicose foi adicionada ao invés de frutose. Os resultados são mos- trados na Tabela 1. [Exemplos Comparativos 2 a 5] Os Exemplos Comparativos 2 a 5 foram realizados da mesma maneira que o Exemplo Comparativo 1, exceto pelo uso do meio de cultura principal ao qual as concentrações de CoCI2 6H20 que seguem foram adici- onadas ao invés de 0,002% (p/v) de CoCI2'6H20: 0,005% (p/v) para o Exem- plo Comparativo 2, 0,01% (p/v) para o Exemplo Comparativo 3, 0,02% (p/v) para o Exemplo Comparativo 4, e 0,03% (p/v) para o Exemplo Comparativo 5. Os resultados são mostrados na Tabela 1. [Exemplo 8] O Exemplo 8 foi realizado da mesma maneira que o Exemplo 1, exceto pelo uso da cepa Nocardia sp. N-775 (depositada sob o número de acesso N-755 N- FERM BP-961) ao invés da cepa Rhodococcus rhodo- coccus J-1. Os resultados são mostrados na Tabela 2. [Exemplo 9] O Exemplo 9 foi realizado da mesma maneira que no Exemplo 8, exceto pelo uso do meio de cultura principal ao qual 0,01% (p/v) de CoCI2'6H20 foi adicionado ao invés de 0,002% (p/v) de CoCI2 6H20. Os re- sultados são mostrados na Tabela 2. [Exemplos 10 e 11] Os Exemplos 10 e 11 foram realizados da mesma maneira que no Exemplo 9, exceto pelo uso de meios de pré-cultura e cultura principal aos quais manitol (Exemplo 10) ou sorbitol (Exemplo 11) foi adicionado ao invés de frutose. Os resultados são mostrados na Tabela 2. [Exemplo Comparativo 6] O Exemplo Comparativo 6 foi realizada da mesma maneira que o Exemplo 8, exceto pelo uso de meios de pré-cultura e cultura principal aos quais glicose foi adicionada ao invés de frutose. Os resultados são mostra- dos na Tabela 2. [Exemplo Comparativo 7] O Exemplo Comparativo 7 foi realizada da mesma maneira que o Exemplo Comparativo 6, exceto pelo uso do meio de cultura principal ao qual 0,01% (p/v) de C0CI2 6H2O foi adicionado ao invés de 0,002% (p/v) de CoCI2 6H20. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

Tabela 1 Tabela 2 [Exemplo 12] (1) Cultivo de micróbios (1) Condições de pré-cultura (Composição do meio) Polipeptona 1% (p/v), extrato de levedura 0,5% (p/v), NaCI 0,5% (p/v), ampicilina Na 100 pg/ml, pH 7 (meio LB) (Método de cultura) 100 ml_ de meio foram postos em um frasco Erlenmeyer de 500 mLeo frasco foi vedado com um chumaço de algodão. O meio foi esteriliza- do através de uma autoclave por 20 minutos a 121QC. Então a cepa MT- 10822 (FERM BP-5785) foi inoculada nele e a mistura foi submetida a cultivo com agitação por 6 horas a 37-C. (2) Condições de cultura principal (Composição do meio) Extrato de levedura 0,5% (p/v), polipeptona 2% (p/v), NaCI 0,06% (p/v), KCI 0,02% (p/v), MgCI26H20 0,2% (p/v), CoCI26H20 0,002% (p/v), MgSC>4'7H20 0,243% (p/v), frutose 4% (p/v), Pluronic L61 0,02% (p/v), pH 7 (Método de cultura) Dois litros do meio inicial foram postos em um fermentador de mini jarra de 3 litros e esterilizados através de uma autoclave por 20 minutos a 121SC. No entanto, à parte do acima, frutose e MgS04-7H20 foram esDeci- almente filtrados (usando filtro de papel de 0,45 mícron fabricado pela Ad- vantec Toyo Kaisha, Ltd.) e então adicionados ao meio. Após o término da pré-cultura acima, 20 ml da solução cultivada foram inoculados nela e o meio resultante foi cultivado por 12 horas a 379 C sob condições de pressão de entrada de tanque de 0,025 Mpa, uma taxa de agitação de 800 rpm, uma quantidade de fluxo de ar de 1 wm e pH 7. (2) Determinação da atividade de hidratase de nítrila A determinação da atividade de hidratase de nitrila foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 1 (2). Com relação à atividade, investi- gação foi realizada por solução de cultura e por célula microbiana. Os resul- tados são mostrados na Tabela 3. Na Tabela, tomando 100 como o valor para atividade sob o cultivo na presença de 0,002% (p/v) de CoCI2 6H20, os valores de atividade sob as outras condições de cultura são indicados como valores de atividade relativos (%). [Exemplo 13] O Exemplo 13 foi realizado da mesma maneira que no Exemplo 12, exceto pelo uso de meio de cultura principal ao qual 0,01% (p/v) de CoCI2.6H20 foi adicionado ao invés de 0,002% (p/v) de CoCI2.6H20. Os re- sultados são mostrados na Tabela 3. [Exemplos 14 e 15] Os Exemplos 14 e 15 foram realizados da mesma maneira que o Exemplo 13, exceto pelo uso de meio de cultura principal ao qual manitol (Exemplo 14) ou sorbitol (Exemplo 15) foi adicionado ao invés de frutose. Os resultados são mostrados na Tabela 3. [Exemplo Comparativo 8] O Exemplo Comparativo 8 foi realizado da mesma maneira que o Exemplo 12, exceto pelo uso do meio de cultura principal ao qual glicose foi adicionada ao invés de frutose. Os resultados são mostrados na Tabela 3. [Exemplo Comparativo 9] O Exemplo Comparativo 9 foi realizada da mesma maneira aue o Exemplo Comparativo 8, exceto pelo uso do meio de cultura principal ao qual 0,01% (p/v) de CoCI2.6H20 foi adicionado ao invés de 0,002% (p/v) de CoCI2.6H20. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3 APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Cetose, tal como frutose, álcoois de açúcar, tal como manitol, podem reduzir a inibição de crescimento causada por íons de cobalto no cul- tivo de um microorganismo tendo atividade de hidratase de nitrila. Como re- sultado, é possível se obter células microbianas tendo atividade de enzima de hidratase de nitrila dentro de um curto período e em alto rendimento.

Claims (2)

1. Método de cultivo de um microorganismo tendo habilidade de produção de hidratase de nitrila, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo do referido microorganismo em um meio substrato contendo um álcool de açúcar e/ou cetose, e um íon de cobalto em que a concentração do íon cobalto é de 15 mg/L ou mais, estando o cobalto sob a forma de cloreto de cobalto, em que o álcool de açúcar é representado pela fórmula geral (I): (I) em que n representa um número inteiro de 2 a 4, e em que a cetose é representada pela fórmula geral (II): (II) em que n representa 3.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de íon de cobalto é 20 mg/L ou mais, estando o cobalto sob a forma de cloreto de cobalto.