JPH0838163A - ニトリルヒドラターゼ活性を有する細菌の培養法 - Google Patents
ニトリルヒドラターゼ活性を有する細菌の培養法Info
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- JPH0838163A JPH0838163A JP17814794A JP17814794A JPH0838163A JP H0838163 A JPH0838163 A JP H0838163A JP 17814794 A JP17814794 A JP 17814794A JP 17814794 A JP17814794 A JP 17814794A JP H0838163 A JPH0838163 A JP H0838163A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 培地中にコバルトイオンおよびアミド類を存
在させることを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ活性
を有するシュードモナス・クロロラフィス（Pseudomona
s chlororaphis）ＩＦＯ ３９０４株の培養法。 【効果】 本発明により、ニトリルヒドラターゼ高活性
を有するシュードモナス属細菌菌体が得られ、該菌体を
用いることによりニトリル類から効率的にアミド類を製
造することが可能である。
在させることを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ活性
を有するシュードモナス・クロロラフィス（Pseudomona
s chlororaphis）ＩＦＯ ３９０４株の培養法。 【効果】 本発明により、ニトリルヒドラターゼ高活性
を有するシュードモナス属細菌菌体が得られ、該菌体を
用いることによりニトリル類から効率的にアミド類を製
造することが可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ニトリル類からアミド
類を生成する際の触媒となるニトリルヒドラターゼ活性
の高いシュードモナス属細菌の菌体を高収率に得るため
の該細菌の培養法に関する。
類を生成する際の触媒となるニトリルヒドラターゼ活性
の高いシュードモナス属細菌の菌体を高収率に得るため
の該細菌の培養法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ニトリルヒドラターゼは、ニトリル類を
水和してアミド類を生成する酵素として見出されている
（Agric. Biol. Chem., 46, p1165-1174, 1982) 。該酵
素活性を有する細菌としては、グラム陽性菌としてコリ
ネバクテリウム属とノカルジア属（特公昭５６−１７９
１８号公報）、バルシス属、ミクロコッカス属やブレビ
バクテリウム属（特公昭６２−２１５１９号公報）、ロ
ードコッカス属（特公平３−５４５５８号公報）、グラ
ム陰性菌としてシュードモナス属（特公昭５９−３７９
５１号公報）、エルビニア属（特開平５−１４１９６号
公報）、キサントバクター属（特開平５−１６１４９５
号公報）、アグロバクテリウム属（特開平５−１０３６
８１号公報）、リゾビウム属（特開平５−２３６９７７
号公報）等が報告されている。このような細菌からニト
リルヒドラターゼ活性の高い細菌菌体を高収率に得るこ
とは、ニトリル類からアミド類を製造する上で有益であ
る。ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株については、コ
バルトイオンおよび尿素誘導体を培地に添加して該酵素
活性を増大させる培養法が報告されており（特開平２−
１００６７４、特開平２−２２７０６９）、シュードモ
ナス属については、鉄イオンおよびメタクリルアミドの
添加効果はあるが、コバルトイオンは添加効果が無いこ
とが報告されている（Agric. Biol. Chem., 50, p2859-
2865, 1986) 。
水和してアミド類を生成する酵素として見出されている
（Agric. Biol. Chem., 46, p1165-1174, 1982) 。該酵
素活性を有する細菌としては、グラム陽性菌としてコリ
ネバクテリウム属とノカルジア属（特公昭５６−１７９
１８号公報）、バルシス属、ミクロコッカス属やブレビ
バクテリウム属（特公昭６２−２１５１９号公報）、ロ
ードコッカス属（特公平３−５４５５８号公報）、グラ
ム陰性菌としてシュードモナス属（特公昭５９−３７９
５１号公報）、エルビニア属（特開平５−１４１９６号
公報）、キサントバクター属（特開平５−１６１４９５
号公報）、アグロバクテリウム属（特開平５−１０３６
８１号公報）、リゾビウム属（特開平５−２３６９７７
号公報）等が報告されている。このような細菌からニト
リルヒドラターゼ活性の高い細菌菌体を高収率に得るこ
とは、ニトリル類からアミド類を製造する上で有益であ
る。ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株については、コ
バルトイオンおよび尿素誘導体を培地に添加して該酵素
活性を増大させる培養法が報告されており（特開平２−
１００６７４、特開平２−２２７０６９）、シュードモ
ナス属については、鉄イオンおよびメタクリルアミドの
添加効果はあるが、コバルトイオンは添加効果が無いこ
とが報告されている（Agric. Biol. Chem., 50, p2859-
2865, 1986) 。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ニトリルヒドラターゼ
活性を有する細菌菌体を用いてニトリル類からアミド類
を製造する場合、その生成量はニトリルヒドラターゼ比
活性値にほぼ比例することが知られている。従って、ニ
トリルヒドラターゼ活性を高めることによりニトリル類
からアミド類の高効率の製造が期待される。即ち、本発
明の目的は、ニトリルヒドラターゼ活性を有するシュー
ドモナス属細菌を培養して、該酵素活性が増大した菌体
を高収率に得ることである。
活性を有する細菌菌体を用いてニトリル類からアミド類
を製造する場合、その生成量はニトリルヒドラターゼ比
活性値にほぼ比例することが知られている。従って、ニ
トリルヒドラターゼ活性を高めることによりニトリル類
からアミド類の高効率の製造が期待される。即ち、本発
明の目的は、ニトリルヒドラターゼ活性を有するシュー
ドモナス属細菌を培養して、該酵素活性が増大した菌体
を高収率に得ることである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成すべく鋭意研究を行った結果、コバルトイオンおよ
びメタクリルアミドを添加した培地でニトリルヒドラタ
ーゼ活性を有するシュードモナス属細菌を培養すること
により、該活性が増大することを見いだし、本発明を完
成するに至った。
達成すべく鋭意研究を行った結果、コバルトイオンおよ
びメタクリルアミドを添加した培地でニトリルヒドラタ
ーゼ活性を有するシュードモナス属細菌を培養すること
により、該活性が増大することを見いだし、本発明を完
成するに至った。
【０００５】即ち、本発明は、ニトリルヒドラターゼ活
性を有するシュードモナス属細菌を、コバルトイオンお
よびアミド類（メタクリルアミド等）を添加した培地で
培養し該活性を高レベルで含有する菌体を調製する、ニ
トリルヒドラターゼ活性を有するシュードモナス属細菌
の培養法を提供するものである。本発明の上記培養法に
より調製した菌体を用いることにより、効率的にニトリ
ル類からアミド類を製造することが可能である。以下
に、本発明についてさらに詳細に説明する。
性を有するシュードモナス属細菌を、コバルトイオンお
よびアミド類（メタクリルアミド等）を添加した培地で
培養し該活性を高レベルで含有する菌体を調製する、ニ
トリルヒドラターゼ活性を有するシュードモナス属細菌
の培養法を提供するものである。本発明の上記培養法に
より調製した菌体を用いることにより、効率的にニトリ
ル類からアミド類を製造することが可能である。以下
に、本発明についてさらに詳細に説明する。
【０００６】本発明において使用する細菌は、ニトリル
類からアミド類を生成させることが出来る、すなわちニ
トリルヒドラターゼ活性を有する、シュードモナス・ク
ロロラフィスＩＦＯ ３９０４株で、同株は、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type
Culture Collection)に保管されているシュードモナス
・クロロラフィスＡＴＣＣ ９４４６と同一の菌株であ
る。
類からアミド類を生成させることが出来る、すなわちニ
トリルヒドラターゼ活性を有する、シュードモナス・ク
ロロラフィスＩＦＯ ３９０４株で、同株は、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type
Culture Collection)に保管されているシュードモナス
・クロロラフィスＡＴＣＣ ９４４６と同一の菌株であ
る。
【０００７】本発明において用いるアミド類としては、
イソブチルアミド、ホルムアミド、アクリルアミド、ク
ロトンアミド、メタクリルアミド、ブチルアミド、プロ
ピオアミド、スクシアミド、ラクトアミドが挙げられ、
特に好適に用いられるのはメタクリルアミドである。さ
らにその濃度は、培地１Ｌ当たり０．１ｇから５０ｇ
で、好ましくは１ｇから１０ｇであり、さらに好ましく
は５ｇである。
イソブチルアミド、ホルムアミド、アクリルアミド、ク
ロトンアミド、メタクリルアミド、ブチルアミド、プロ
ピオアミド、スクシアミド、ラクトアミドが挙げられ、
特に好適に用いられるのはメタクリルアミドである。さ
らにその濃度は、培地１Ｌ当たり０．１ｇから５０ｇ
で、好ましくは１ｇから１０ｇであり、さらに好ましく
は５ｇである。
【０００８】本発明において用いるコバルトイオンは、
通常、培地が水系であることから、水溶性コバルト化合
物を培地に添加することにより生成させる。水溶性コバ
ルト化合物は、例えばＣｏ2+またはＣｏ3+を与えるも
の、特に二価のコバルトイオンを与えるものであって、
具体的には塩化コバルト、硫酸コバルト、酢酸コバル
ト、臭化コバルトが挙げられ、特に好適に用いられるの
は塩化コバルトである。さらにその濃度はＣｏＣｌ2 換
算で培地１Ｌ当たり１mgから５００mgで、好ましくは２
０mgから３００mgであり、さらに好ましくは５０mgであ
る。
通常、培地が水系であることから、水溶性コバルト化合
物を培地に添加することにより生成させる。水溶性コバ
ルト化合物は、例えばＣｏ2+またはＣｏ3+を与えるも
の、特に二価のコバルトイオンを与えるものであって、
具体的には塩化コバルト、硫酸コバルト、酢酸コバル
ト、臭化コバルトが挙げられ、特に好適に用いられるの
は塩化コバルトである。さらにその濃度はＣｏＣｌ2 換
算で培地１Ｌ当たり１mgから５００mgで、好ましくは２
０mgから３００mgであり、さらに好ましくは５０mgであ
る。
【０００９】以上に述べたメタクリルアミドおよびコバ
ルトイオンは、培養開始時に添加しても良く、あるいは
培養中期に添加しても良い。本発明のシュードモナス属
細菌の培養法は、培地にメタクリルアミドおよびコバル
トイオンを添加することを除けは、他の条件については
それが合目的的なものである限り制限はない。
ルトイオンは、培養開始時に添加しても良く、あるいは
培養中期に添加しても良い。本発明のシュードモナス属
細菌の培養法は、培地にメタクリルアミドおよびコバル
トイオンを添加することを除けは、他の条件については
それが合目的的なものである限り制限はない。
【００１０】通常、基本培地〔トリプトン、１０ｇ；酵
母エキス、５ｇ；ＮａＣｌ、５ｇを水１Ｌに溶解し、Ｎ
ａＯＨにてpH７．０に調整〕にメタクリルアミドおよび
コバルトイオンを所定量添加し、１０〜３０℃程度、好
ましくは１５〜２５℃、特に好ましくは２０℃の温度
で、約１５時間以上、好ましくは２０時間以上培養を行
えば良い。
母エキス、５ｇ；ＮａＣｌ、５ｇを水１Ｌに溶解し、Ｎ
ａＯＨにてpH７．０に調整〕にメタクリルアミドおよび
コバルトイオンを所定量添加し、１０〜３０℃程度、好
ましくは１５〜２５℃、特に好ましくは２０℃の温度
で、約１５時間以上、好ましくは２０時間以上培養を行
えば良い。
【００１１】上記の如く培養して得られる菌体内のニト
リルヒドラターゼ活性は、次のとおり測定することがで
きる。先ず、培養物から遠心分離により菌体を集め、こ
れを水、生理食塩水、リン酸若しくはトリス塩酸等の緩
衝液に懸濁し、この菌体懸濁液に基質となるニトリル類
を加え（以下この溶液を「水性反応液」ということがあ
る）、一定時間反応させた後、該水性反応液中に生成す
るアミド類を検出・定量すればよい。
リルヒドラターゼ活性は、次のとおり測定することがで
きる。先ず、培養物から遠心分離により菌体を集め、こ
れを水、生理食塩水、リン酸若しくはトリス塩酸等の緩
衝液に懸濁し、この菌体懸濁液に基質となるニトリル類
を加え（以下この溶液を「水性反応液」ということがあ
る）、一定時間反応させた後、該水性反応液中に生成す
るアミド類を検出・定量すればよい。
【００１２】水性反応液中の菌体濃度は通常１〜１０％
（wt/vol）、ニトリル類の濃度は通常０．５〜１０％
（wt/vol）とすることができ、反応温度は２５〜３５℃
程度、水性反応液のpHは７〜９程度、反応時間は０．５
〜１５時間程度が適当である。
（wt/vol）、ニトリル類の濃度は通常０．５〜１０％
（wt/vol）とすることができ、反応温度は２５〜３５℃
程度、水性反応液のpHは７〜９程度、反応時間は０．５
〜１５時間程度が適当である。
【００１３】水性反応液中の基質となるニトリル類とし
ては、例えば、炭素数２〜４のニトリルが挙げられる。
具体的には、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリ
ル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ブチロニ
トリル、イソブチロニトリルであり、特にアクリロニト
リルが代表的である。
ては、例えば、炭素数２〜４のニトリルが挙げられる。
具体的には、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリ
ル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ブチロニ
トリル、イソブチロニトリルであり、特にアクリロニト
リルが代表的である。
【００１４】上記ニトリル類は、生物毒性の強い有機溶
媒であるため、ニトリルヒドラターゼに対する阻害作用
がある。従って、水性反応液中のニトリル類の濃度は２
％以下になるように制御しつつ逐次添加するのが好まし
い。水性反応液中に生成するアミド類および未反応ニト
リル類は、反応液から菌体を遠心分離により除去後、高
速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、吸光度を測
定することにより検出・定量することができる。
媒であるため、ニトリルヒドラターゼに対する阻害作用
がある。従って、水性反応液中のニトリル類の濃度は２
％以下になるように制御しつつ逐次添加するのが好まし
い。水性反応液中に生成するアミド類および未反応ニト
リル類は、反応液から菌体を遠心分離により除去後、高
速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、吸光度を測
定することにより検出・定量することができる。
【００１５】以下に、実施例により本発明を詳細に説明
する。但し、本発明はこれらの実施例により限定される
ものではない。
する。但し、本発明はこれらの実施例により限定される
ものではない。
【００１６】
【実施例】基本培地〔トリプトン、１０ｇ；酵母エキ
ス、５ｇ；ＮａＣｌ、５ｇを水１Ｌに溶解し、ＮａＯＨ
にてpH７．０に調整〕１００mlにメタクリルアミド０．
５ｇおよびＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ５mgを添加した培地
に、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas Ch
lororaphis）ＩＦＯ ３９０４株を一白金耳植菌し、２
０℃で２４時間、振とう培養した。培養液１０mlを遠心
して菌体を分離後、リン酸緩衝液（pH７．０；１０mM）
１mlに懸濁し、１０％アクリロニトリル水溶液０．０５
mlを添加し、３０℃で１２時間反応させた。なお対照試
験として、アクリルアミドおよびＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ
の無添加培養、メタクリルアミド単独添加培養、ＣｏＣ
ｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ単独添加培養についても同様に行った。
反応終了後、反応液中の生成アクリルアミドと未反応ア
クリロニトリルを高速液体クロマトグラフィーを用いて
検出した。その結果、メタクリルアミドおよびＣｏＣｌ
2 を添加して培養した場合では、アクリルアミドが検出
されたが、基質アクリロニトリルは検出されなかった。
また、対照試験として行ったものはいずれもアクリルア
ミドは検出されなかった。
ス、５ｇ；ＮａＣｌ、５ｇを水１Ｌに溶解し、ＮａＯＨ
にてpH７．０に調整〕１００mlにメタクリルアミド０．
５ｇおよびＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ５mgを添加した培地
に、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas Ch
lororaphis）ＩＦＯ ３９０４株を一白金耳植菌し、２
０℃で２４時間、振とう培養した。培養液１０mlを遠心
して菌体を分離後、リン酸緩衝液（pH７．０；１０mM）
１mlに懸濁し、１０％アクリロニトリル水溶液０．０５
mlを添加し、３０℃で１２時間反応させた。なお対照試
験として、アクリルアミドおよびＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ
の無添加培養、メタクリルアミド単独添加培養、ＣｏＣ
ｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ単独添加培養についても同様に行った。
反応終了後、反応液中の生成アクリルアミドと未反応ア
クリロニトリルを高速液体クロマトグラフィーを用いて
検出した。その結果、メタクリルアミドおよびＣｏＣｌ
2 を添加して培養した場合では、アクリルアミドが検出
されたが、基質アクリロニトリルは検出されなかった。
また、対照試験として行ったものはいずれもアクリルア
ミドは検出されなかった。
【００１７】
【発明の効果】本発明により、ニトリルヒドラターゼ高
活性を有するシュードモナス属細菌菌体が得られ、該菌
体を用いることによりニトリル類、例えばアクリロニト
リルから効率的にアミド類、例えばアクリルアミドを製
造することが可能である。
活性を有するシュードモナス属細菌菌体が得られ、該菌
体を用いることによりニトリル類、例えばアクリロニト
リルから効率的にアミド類、例えばアクリルアミドを製
造することが可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 培地中にコバルトイオンおよびアミド類
を存在させることを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ
活性を有するシュードモナス・クロロラフィス（Pseudo
monas chlororaphis）ＩＦＯ ３９０４株の培養法。 - 【請求項２】 培地中のコバルトイオン濃度が、ＣｏＣ
ｌ2 換算で２０〜３００mg/Lである、請求項１記載の培
養法。 - 【請求項３】 培地中のアミド類がメタクリルアミドで
あり、その濃度が１〜１０g/L である、請求項１または
２記載の培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17814794A JPH0838163A (ja) | 1994-07-29 | 1994-07-29 | ニトリルヒドラターゼ活性を有する細菌の培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17814794A JPH0838163A (ja) | 1994-07-29 | 1994-07-29 | ニトリルヒドラターゼ活性を有する細菌の培養法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0838163A true JPH0838163A (ja) | 1996-02-13 |
Family
ID=16043465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17814794A Pending JPH0838163A (ja) | 1994-07-29 | 1994-07-29 | ニトリルヒドラターゼ活性を有する細菌の培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0838163A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001070936A1 (fr) * | 2000-03-21 | 2001-09-27 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Procede de culture de micro-organismes |
-
1994
- 1994-07-29 JP JP17814794A patent/JPH0838163A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001070936A1 (fr) * | 2000-03-21 | 2001-09-27 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Procede de culture de micro-organismes |
| US6955911B2 (en) | 2000-03-21 | 2005-10-18 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Method of culturing microorganism |
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