JPH06284899A - フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ロドコッカス (Rhodococcus)属、アルカリゲネ
ス (Alcaligenes)属、ブレビバクテリウム(Brevibacter
ium)属またはシュードモナス (Pseudomonas)属の微生物
を、中性付近ないし塩基性の水性媒体中で、特定のフェ
ニル基を有するラセミ体のα−ヒドロキシニトリルに作
用させて、これら基質から直接優位量の特定のフェニル
基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を製造す
る方法。 【効果】本発明によれば、高い光学純度で特定のフェニ
ル基を有するα−ヒドロキシカルボン酸を対応するラセ
ミ体ニトリルから定量的に製造可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はフェニル基を有する光学
活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法、更に詳しく
は、後記一般式[I] で示されるラセミ体のα−ヒドロキ
シニトリルのニトリル基に対して不斉加水分解する能力
を有する微生物を用いて、後記一般式[II]で示されるフ
ェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を
製造する方法に関する。該α−ヒドロキシカルボン酸
は、抗生物質、交感神経作用薬、糖尿病薬など多種の医
農薬品の合成原料、さらには光学分割剤として工業的に
重要である。

【０００２】

【従来の技術とその課題】フェニル基を有する光学活性
α−ヒドロキシカルボン酸の製造法としては、ラセミ体
を分別結晶やクロマトグラフィーにより光学分割する方
法、および有機化学的に不斉合成する方法などが知られ
ているが、これらの方法は、操作が煩雑、低収率、生成
物の光学純度が低いなどの問題点を有している。

【０００３】これら問題点を解決する手段として、微生
物を用いる方法が提案されており、例えば、(1) アルカ
リゲネス属、シュードモナス属、ロドシュードモナス
属、コリネバクテリウム属、アシネトバクター属、バチ
ルス属、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属または
キャンディダ属の微生物によりマンデロニトリルまたは
マンデルアミドおよびそれらの置換体を不斉加水分解す
る方法〔特開平2-84198号公報参照〕、(2) シュードモ
ナス属、アルカリゲネス属、アシネトバクター属、カセ
オバクター属、ノカルディア属、バチルス属、ブレビバ
クテリウム属またはオーレオバクテリウム属などの微生
物によりラセミ体のマンデロニトリルまたはその誘導体
から直接優位量のR(-)−マンデル酸またはその誘導体を
製造する方法（特開平4-218385号、特開平4-99495 号お
よび特開平4-99496 号各公報参照）などが知られてい
る。しかしながら、上記(1) には、後記一般式[II]で示
されるフェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカル
ボン酸の製造について、記載の微生物がいかなる活性を
有しているか全く不明である。また、上記(2) は、光学
活性なマンデル酸またはその誘導体の製法であり、後記
一般式[II]で示されるフェニル基を有する光学活性α−
ヒドロキシカルボン酸の製造については全く触れられて
いない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、後記一般
式[II]で示されるフェニル基を有する光学活性α−ヒド
ロキシカルボン酸を工業的に有利に製造することのでき
る微生物の探索を行った結果、ロドコッカス (Rhodococ
cus)属、アルカリゲネス (Alcaligenes)属、ブレビバク
テリウム(Brevibacterium)属またはシュードモナス(Pse
udomonas) 属の微生物の使用が有効であることを見出し
本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、ロドコッカス (Rhod
ococcus)属、アルカリゲネス (Alcaligenes)属、ブレビ
バクテリウム(Brevibacterium)属またはシュードモナス
(Pseudomonas) 属に属し下記一般式[I] で示されるラセ
ミ体のα−ヒドロキシニトリルのニトリル基を不斉加水
分解する能力を有する微生物または該処理物を、中性付
近ないし塩基性の水性媒体中で、基質である下記一般式
[I] で示されるラセミ体のα−ヒドロキシニトリルのニ
トリルまたはこのニトリルに対応するアルデヒドと青酸
の混合物に作用させることにより、これら基質から直接
優位量の下記一般式[II]で示されるフェニル基を有する
光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を生成せしめること
を特徴とするフェニル基を有する光学活性α−ヒドロキ
シカルボン酸の製造法、である。

【０００６】 〔式中、Ｘはオルト位、メタ位またはパラ位置換を意味
し、置換基は水素、水酸基、炭素数１〜３の脂肪族飽和
アルキル基、炭素数１〜３の脂肪族アルコキシ基、チオ
アルキル基、ハロゲン原子、フェニル基、フェノキシ
基、アミノ基またはニトロ基，ｎは１または２を表
す。〕

【０００７】上記したところを要旨とする本発明は、前
記一般式[I] で示されるα−ヒドロキシニトリルが、中
性付近ないしは塩基性の水性媒体中で、対応するアルデ
ヒドと青酸との間で容易にラセミ化するという性質を利
用し、このラセミ化反応の系と前記微生物とを共役させ
ることにより前記一般式[I] で示されるα−ヒドロキシ
ニトリルをＤ−またはＬ−体優位に前記一般式[II]で示
されるフェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカル
ボン酸に変換し得るとの本発明者らにより見出された知
見をも含む。本発明でいう優位量とはラセミ体からＤ−
またはＬ−体が約50〜100%の収率で得られることを意味
する。

【０００８】本発明で使用する微生物は、ロドコッカス
(Rhodococcus)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属またはシュード
モナス(Pseudomonas) 属に属する生産菌であり、一般式
[I] で示されるラセミ体のα−ヒドロキシニトリルのニ
トリル基に対し不斉加水分解活性を有し、且つ、一般式
[II]で示されるフェニル基を有する光学活性α−ヒドロ
キシカルボン酸を高濃度に蓄積する能力を有する。

【０００９】該微生物として、具体的には、ロドコッカ
ス sp. HT29-7 菌株〔微工研条寄第3857号〕、アルカリ
ゲネス sp. BC35-2 菌株〔微工研条寄第3318号〕、同BC
12-2菌株〔微工研菌寄第11263 号〕、同BC20菌株〔微工
研菌寄第11264 号〕、同BC24菌株〔微工研菌寄第12063
号〕、シュードモナス sp. BC-18菌株〔FERM P-13835〕
およびブレビバクテリウム アセチリカム IAM 1790 菌
株を挙げることができる。これら微生物のうち、ロドコ
ッカス sp. HT29-7 菌株、アルカリゲネス sp.BC35-2菌
株、同BC12-2菌株、同BC20菌株、同BC24菌株およびシュ
ードモナス sp.BC-18 菌株は本発明者らにより土壌より
見出され、工業技術院 生命工学工業技術研究所に上記
番号にて寄託されており、これらの菌学的性質は後記の
とおりである。

【００１０】ブレビバクテリウム アセチリカム IAM 1
790 菌株は公知であり、東京大学応用微生物研究所(IA
M) から容易に入手することができる。

【００１１】

【菌学的性質】

HT29-7菌株 形 態 多形性桿菌 グラム染色性 ＋ 芽 胞 − 運 動 性 − 集落の色調 ピンク〜オレンジ rod-coccus cycle ＋ 集落周辺細胞の伸長 認める 気菌糸の形成 認めず オキシダーゼ − カタラーゼ ＋ 酸素要求性 好気性 細胞壁のジアミノ酸 meso-シ゛アミノヒ゜メリン酸 グリコリル試験 ＋（グリコリル型） 細胞壁の糖組成 アラビノース ＋ ガラクトース ＋ キノン系 MK-9(H₂)

【００１２】BC35-2、BC12-2、BC20およびBC24菌株 形 態 桿 菌 グラム染色性 − 芽 胞 − 運 動 性 ＋ 鞭 毛 周 毛 オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ ＯＦ アルカリ化 ３−ケトラクトースの産生 − キノン系 Ｑ−８

【００１３】BC-18 菌株 形 態 桿 菌 グラム染色性 − 芽 胞 − 運 動 性 ＋ 鞭 毛 極 毛 オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ ＯＦテスト Ｏ

【００１４】以上の菌学的性質をバージェーズ マニュ
アル オブ システマティック バクテリオロジー〔Be
rgey's Manual of Systematic Bacteriology (1986)〕
にしたがって分類すると、HT29-7菌株はロドコッカス
(Rhodococcus)属、BC35-2菌株、同BC12-2菌株、同BC20
菌株および同BC24菌株はアルカリゲネス (Alcaligenes)
属、BC-18 菌株はシュードモナス(Pseudomonas) 属に属
すると同定された。

【００１５】一般式[I] で示される化合物の代表例とし
ては、フェニルラクトニトリル、４−フェニル−α−ヒ
ドロキシブチロニトリルなどを挙げることができる。

【００１６】次に本発明の一般的実施態様について説明
する。本発明に使用される微生物の培養は、資化し得る
炭素源（グリセロール、グルコース、サッカロース、ラ
クトース、フルクトースなど）、窒素源（カザミノ酸、
肉エキス、酵母エキス、麦芽エキスなど）および各微生
物の生育に必須の無機塩（塩化マグネシウム、硫酸ナト
リウム、塩化カルシウム、硫酸マンガン、塩化鉄、硫酸
亜鉛など）などを含有した通常の培地を用いて行なわれ
る。

【００１７】培養初期または中期に生育を大きく阻害し
ない濃度のニトリル類（ケイ皮酸ニトリル、ベンジルシ
アニド、イソブチロニトリル、β−フェニルプロピオニ
トリル、ベンゾニトリル、２−シアノピリジン、３−シ
アノピリジン、４−シアノピリジン、１−シクロヘキセ
ニルアセトニトリル、ε−カプロラクタム、γ−ブチロ
ニトリル、ｏ−アミノベンゾニトリルなど）、アミド類
（イソブチルアミド、フェニルアセトアミド、４−ピリ
ジンカルボン酸アミドなど）を添加することはより高い
酵素活性が得られるので好ましい。

【００１８】培養液のpHは 4〜10の範囲で、培養は 5〜
50℃の温度範囲で、１〜７日程度好気的に行い活性が最
大となるまで継続すればよい。

【００１９】不斉加水分解反応は、上記に準じて培養し
た微生物の培養液から分離した菌体または菌体処理物
（乾燥菌体、菌体の破砕物、分離された粗・精製酵素、
固定化菌体・酵素など）を水または緩衝液などの水性媒
体中に懸濁し、これに一般式[I] で示されるラセミ体の
α−ヒドロキシニトリルのニトリルまたはこのニトリル
に対応するアルデヒドと青酸の混合物を接触させること
によって行われる。

【００２０】本発明においては、前述のように一般式
[I] で示されるα−ヒドロキシニトリルをラセミ化する
ために、反応中、系を中性付近ないしは塩基性に保つこ
とが必須であり、pHを 6〜11、好ましくは 7〜10に調整
する。

【００２１】基質の濃度は、一般式[I] で示されるラセ
ミ体のα−ヒドロキシニトリルに対応するアルデヒドや
青酸に対する酵素の感受性により一概に特定し得ない
が、通常、一般式[I] で示されるラセミ体のα−ヒドロ
キシニトリルとして 0.1〜10重量％、好ましくは 0.2〜
5.0 重量％に相当する濃度である。

【００２２】尚、アルデヒドによる酵素阻害を軽減させ
るために、亜硫酸ナトリウム、酸性亜硫酸ナトリウム、
亜ジチオン酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、酸性亜硫酸
カリウム、亜ジチオン酸カリウム、亜硫酸アンモニウ
ム、酸性亜硫酸アンモニウム、亜ジチオン酸アンモニウ
ムなどの添加が有効である。添加量は、反応液中に１〜
1000mMの範囲でよい。

【００２３】基質に対する微生物の使用量は、乾燥菌体
として0.01〜5.0 重量％、反応温度は０〜50℃、好まし
くは10〜30℃で 0.1〜100 時間反応させればよい。

【００２４】得られた一般式[II]で示されるフェニル基
を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸は、公知の
方法、例えば遠心分離により微生物を除き、さらに必要
に応じ限外ろ過などにより顆粒成分と蛋白、多糖成分の
除去を行い、また必要であれば活性炭処理を施した後、
減圧濃縮、または酸性下での有機溶媒による抽出を行
い、ベンゼンなどを用いて再結晶を繰り返すことにより
高純度結晶を得ることができる。

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、光学純度が高く一般式
[II]で示されるフェニル基を有する光学活性α−ヒドロ
キシカルボン酸への選択性がほぼ定量的であり、工業的
要望を満足し得る該α−ヒドロキシカルボン酸の製法が
提供される。

【００２６】

【実施例】次に、本発明を実施例により更に詳細に説明
する。

【００２７】実施例１ Ｌ−３−フェニル乳酸の製造 (1) 培養 ロドコッカス属 sp. HT29-7 、アルカリゲネス sp. BC3
5-2 およびIAM 1790菌株を、誘導剤として0.05％ベンジ
ルシアニドを添加した下記の培地中で、30℃、72時間好
気的に培養した。

【００２８】 グリセロール 20g 酵母エキス 3g リン酸一カリウム 6.8g リン酸二ナトリウム 7.1g 硫酸ナトリウム 2.8g 塩化マグネシウム 0.4g 塩化カルシウム 0.04g 硫酸マンガン 0.03g 塩化鉄 0.006g 硫酸亜鉛 0.003g 蒸留水 1000ml ｐＨ 7.5

【００２９】(2) 不斉加水分解反応 培地から菌体を採取し、遠心分離により各々の菌体を50
mMリン酸緩衝液(pH 8.2)で洗浄した。得られた沈殿菌体
を各々10mMフェニルラクトニトリルを含む上記緩衝液に
懸濁し、30℃で96時間振盪しながら反応を行った。使用
した菌体はＯＤ₆₃₀ ＝20であった。

【００３０】反応終了後、反応液を遠心し菌体を除去し
た後、上清中のフェニル乳酸含量を液体クロマトグラフ
ィー（カラム；Wakosil ODS 5C18、キャリア液；0.1Mリ
ン酸：アセトニトリル＝３：１、モニター；254nm)で分
析した。また、生成したフェニル乳酸の分離は 6N NaOH
で pH 12とし、等量の酢酸エチルエステルで未反応のフ
ェニルラクトニトリルを２回抽出除去後、水層を硫酸で
pH 1.2 とし、等量の酢酸エチルエステルを加え２回抽
出した。酢酸エチルエステル層を分取し、エバポレータ
ーで蒸発乾固後、水に溶解させ、光学分割カラム(MCI g
el CRS-10W、キャリアー液；2mM CuSO₄ ・5H₂O：アセト
ニトリル＝85：15）を用いて分析した結果を表１に示
す。

【００３１】

【００３２】実施例２ Ｌ−３−フェニル乳酸の製造 実施例１と同様にして得た沈殿菌体を各々10mMフェニル
アルデヒドと10mMシアン化カリウムを含むリン酸緩衝液
(pH 8.2)に懸濁し、30℃で96時間振盪しながら反応を行
った。使用した菌体はＯＤ₆₃₀ ＝20であった。反応終了
後、反応液を遠心し菌体を除去した後、上清中のフェニ
ル乳酸含量と光学純度を実施例１に示した方法で分析し
た。結果を表２に示す。

【００３３】

【００３４】実施例３ Ｌ−４−フェニル−α−ヒドロキシ酪酸の製造 実施例１と同様にして得たHT29-7沈殿菌体を10mM４−フ
ェニル−α−ヒドロキシブチロニトリルを含むリン酸緩
衝液(pH 8.2)に懸濁し、30℃で96時間振盪しながら反応
を行った。さらに、アルデヒドによる酵素阻害を軽減す
るために 100mM亜硫酸ナトリウムを加えた反応も同様に
行った。使用した菌体はＯＤ₆₃₀ ＝20であった。反応終
了後、反応液を遠心し菌体を除去した後、上清中の４−
フェニル−α−ヒドロキシ酪酸含量と光学純度を実施例
１に示した方法で分析した。結果を表３に示す。

【００３５】

【００３６】実施例４ Ｌ−３−フェニル乳酸の製造 (1) 培養 シュードモナス属 sp. BC-18菌株を、誘導剤として0.03
％１−シクロヘキセニルアセトニトリルを添加した下記
の培地中で、30℃、３日間好気的に培養した。

【００３７】 グリセロール 20g 酵母エキス 6g 金属塩混合液^* 5ml １Ｍ−硫酸ナトリウム 2ml 50ｍＭ−燐酸緩衝液(pH 7.5) 993ml * 金属混合液：56g 硫酸ナトリウム、 8g 塩化マグネシ
ウム、 0.8g 塩化カルシウム、 0.6g 硫酸マンガン、0.
12g 塩化鉄、0.06g 硫酸亜鉛／100ml 蒸留水

【００３８】(2) 不斉加水分解反応 培地から菌体を採取し、遠心分離により菌体を50mM燐酸
緩衝液(pH 7.5)で洗浄した。得られた沈殿菌体を各々20
mMフェニルラクトニトリルを含む緩衝液に懸濁し（菌濃
度 OD₆₃₀ =29.0)、所定のpHで、30℃で24時間振盪しな
がら反応を行った。

【００３９】反応終了後、反応液を遠心し菌体を除去し
た後、上清中のフェニル乳酸含量を液体クロマトグラフ
ィー（カラム；Wakosil ODS 5C18、キャリア液；0.1M燐
酸：アセトニトリル＝７：３、モニター；254nm)で分析
した。また、生成したフェニル乳酸の光学純度は 6N Na
OHで pH 9.0 とし、等量の酢酸エチルエステルで２回抽
出除去後、水層を硫酸で pH 2.0 とし、等量の酢酸エチ
ルエステルを加え２回抽出した。酢酸エチルエステル層
を分取し、エバポレーターで蒸発乾固後、水に溶解さ
せ、光学分割カラム(MCI gel CRS-10W、キャリアー液；
2mM CuSO₄・5H₂O：アセトニトリル＝85：15）を用いて
分析した。結果を表４に示す。

【００４０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 平田 祐司 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 日 東化学工業株式会社中央研究所内 (72)発明者 小林 悦子 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 日 東化学工業株式会社中央研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ロドコッカス (Rhodococcus)属、アルカリ
   ゲネス (Alcaligenes)属、ブレビバクテリウム(Breviba
   cterium)属またはシュードモナス(Pseudomonas) 属に属
   し下記一般式[I] で示されるラセミ体のα−ヒドロキシ
   ニトリルのニトリル基を不斉加水分解する能力を有する
   微生物または該処理物を、中性付近ないし塩基性の水性
   媒体中で、基質である下記一般式[I] で示されるラセミ
   体のα−ヒドロキシニトリルのニトリルまたはこのニト
   リルに対応するアルデヒドと青酸の混合物に作用させる
   ことにより、これら基質から直接優位量の下記一般式[I
   I]で示されるフェニル基を有する光学活性α−ヒドロキ
   シカルボン酸を生成せしめることを特徴とするフェニル
   基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造
   法。 〔式中、Ｘはオルト位、メタ位またはパラ位置換を意味
   し、置換基は水素、水酸基、炭素数１〜３の脂肪族飽和
   アルキル基、炭素数１〜３の脂肪族アルコキシ基、チオ
   アルキル基、ハロゲン原子、フェニル基、フェノキシ
   基、アミノ基またはニトロ基、ｎは１または２を表
   す。〕