JPS633599B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物の作用によりβ―置換プロピオ
ニトリルからβ―置換プロピオン酸またはそのア
ミドを製造する方法に関するものである。さらに
詳しくは、コリネバクテリウム属（Genus
Corynebacterium）またはノカルデイア属
（Genus Nocardia）に属し、β―置換プロピオ
ニトリルを加水分解する能力を有する微生物の作
用により、β―置換プロピオニトリルからβ―置
換プロピオン酸アミドまたはβ−置換プロピオン
酸を製造する方法に関するものである。 β―置換プロピオン酸アミドおよびβ―置換プ
ロピオン酸は医薬、農薬および高分子安定剤の原
料などフアインケミカル中間原料として有用な化
合物である。 有機ニトリル類から対応する有機カルボン酸ア
ミドおよび有機カルボン酸への水和および加水分
解反応は、通常、酸または塩基触媒下で行なわれ
るが、一般に酸生成工程の反応速度が酸アミド生
成工程の反応速度より大きいため、酸アミドの段
階で反応を止めることは非常に難しい。 さらに、β―置換プロピオン酸およびその誘導
体は酸あるいは塩基触媒下において加熱すること
により逆マイケル付加反応が併発して、その収率
が著しく低下する。 〔但し、Ｘはハロゲン、RO―、RR′N―およ
びRS―（Ｒ，R′はＨ―またはCH₃―）などの置
換基、またＡは―CO₂H，―CONH₂または―CN
基を表わす。〕 これらの問題を解決するために、本発明者ら
は、おだやかな条件下でかつ高い選択率を上げ得
るβ―置換プロピオニトリルからのβ―置換プロ
ピオン酸アミドおよびβ―置換プロピオン酸の新
しい製造法として微生物を利用する方法に着目し
た。 ニトリル化合物の加水分解に微生物を利用する
試みはこれまで多数報告されている。（例えば、
Nature 169 803 （1952）、発酵工学雑誌49
1011 （1971）、発酵工学雑試51 393（1973）、
Agr・Biol.Chem.41 2183（1977）、特開昭51―
86186号公報および特公昭56―17918号公報参照）。 しかしながら、これら従来知られている方法は
対称となるニトリル化合物がα―置換ニトリルあ
るいは無置換ニトリル、生成物がα―置換カルボ
ン酸、α―アミノ酸、α―オキシ酸、酢酸、アク
リル酸、およびそれらのアミド類であり、β―置
換プロピオニトリルに微生物加水分解をほどこ
し、β―置換プロピオン酸およびそのアミドを得
る試みはほとんどなされていない。 このような状況の中で、本発明者らは広範な微
生物を対象に種々研究した結果、コリネバクテリ
ウム層またはノカルデイア属に属す微生物が、β
―置換プロピオニトリルからβ−置換プロピオン
酸アミドおよびβ―置換プロピオン酸を収率よく
生産することを見い出して本発明に到達した。 すなわち、本発明は、コリネバクテリウム属
（Genus Corynebacterium）またはノカルデイア
属（Genus Nocardia）に属し、式（）で示さ
れるβ―置換プロピオニトリルを加水分解する能
力を有する微生物の作用により、式（）で示さ
れるβ―置換プロピオニトリルから、式（）で
示されるβ―置換プロピオン酸アミドまたは式
（）で示されるβ―置換プロピオン酸を生成さ
せることを特徴とする微生物によるβ―置換プロ
ピオン酸またはそのアミドの製造法である。 式（） XCH₂CH₂CN 式（） XCH₂CH₂CONH₂ 式（） XCH₂CH₂CO₂H 〔式中、Ｘはハロゲン、RO―、RR′N―およ
びRS―（Ｒ，R′はＨ―またはCH₃―）などの置
換基を表わす。〕 本発明で使用されるβ―置換プロピオニトリル
としては、β―クロルプロピオニトリル、β―ブ
ロムプロピオニトリル、β―ヨードプロピオニト
リル、β―ヒドロキシプロピオニトリル、β―メ
トキシプロピオニトリル、β―アミノプロピオニ
トリルおよびその塩、Ｎ―メチル―β―アミノプ
ロピオニトリルおよびその塩、Ｎ，N′―ジメチ
ル―β―アミノプロピオニトリルおよびその塩、
β―メルカプトプロピオニトリルおよびβ―メチ
ルメルカプトプロピオニトリルなどであり、これ
らはいずれもアクリロニトリルによるシアノエチ
ル化反応により製造することが可能である。 また、本発明で使用される微生物はコリネバク
テリウム属またはノカルデイア属に属す細菌また
は放線菌で、β―置換プロピオニトリルからβ―
置換プロピオン酸アミドまたはβ―置換プロピオ
ン酸を生産する能力を有するものであり、例え
ば、本出願人の出願に係る特公昭56―17918号公
報記載のコリネバクテリウム属Ｎ―771菌株
（Corynebacterium sp.N―771）、コリネバクテ
リウム属Ｎ―774菌株（Corynebacterium sp.N
―774）およびノカルデイア属Ｎ―775菌株
（Nocardia sp.N―775）などを好適なものとし
て挙げることができる。 これらコリネバクテリウム属Ｎ―771菌株、コ
リネバクテリウム属Ｎ―774菌株およびノカルデ
イア属Ｎ―775菌株は、それぞれ微工研菌寄第
4445号、第4446号および第4447号として微生物工
業技術研究所に寄託されており、これらの菌学的
性質は上記公報に開示されている。通常これらの
菌株は１種を用いるが、２種以上の混合菌体を用
いてもよく、さらには上記菌株以外の同様な作用
を有する菌株と併用してもよい。 次に、本発明の一般的実施態様について説明す
る。 １ 反応方法 本発明におけるβ―置換プロピオン酸アミドお
よびβ―置換プロピオン酸の製造は、具体的には
例えば前記微生物をβ―置換プロピオニトリル、
炭素源、窒素源、無機塩および適当な栄養源を含
む培地に好気的に培養すること（培養法）、ある
いは前記の微生物を予め適当な培地に大量培養、
分離して得た菌体、さらにはこれらの菌体または
これより分離抽出した酵素などを担体結合法、架
橋法、包括法など種々の方法で固定化して得られ
る固定化菌体または固定化酵素等を、水、生理食
塩水その他の水性媒体中でβ―置換プロピオニト
リルと接触させること（酵素法）により、β―置
換プロピオン酸アミドまたはβ―置換プロピオン
酸を生成、蓄積させ、これを単離回収することに
より行なうことができる。 ２ 培地 本発明に使用する培地は、培養法においては主
成分としてβ―置換プロピオニトリルを用い、こ
れに炭素源、窒素源、無機塩類、その他生長促進
物質をほどよく含有するものであれば合成、天然
いずれの培地でも使用できる。β―置換プロピオ
ニトリルの培地中の濃度は通常0.5〜10wt％の範
囲であり、炭素源としてはグルコース、マルトー
スなど、窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウムなど、有機栄養源として酵母エキ
ス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトンなどおよび
無機栄養源としてリン酸塩、マグネシウム、カリ
ウム、亜鉛、鉄、マンガンなどが使用される。 また、酵素法に用いる菌体の培養には、上記培
地でβ―置換プロピオニトリルを含まないか、あ
るいは微量含む培地を用いる。 ３ 培養法 培養は培地を加熱などにより殺菌後、菌を接種
し０〜40℃、好ましくは５〜30℃の温度で１〜10
日間通気撹拌培養、振盪培養などの好気的条件で
行なう。培養系のPHは、６〜10、好ましくは７〜
９の範囲を保つように調節すると副反応が少な
く、高収率を上げることができる。 また、反応に際して、基質であるβ―置換プロ
ピオニトリルは一般に生物毒性の強い化合物であ
るので、培養開始時から培地中に存在させるより
も、ある程度菌体が増加した段階で加えるのが好
ましく、また同じ理由で系内の基質濃度は5wt％
以下になるようにコントロールしつつ遂次添加す
ることが好ましい。 なお、酵素法に用いる菌体の培養は、前記培地
中で通常PH６〜９、温度20〜35℃、好ましくは25
〜30℃で１〜５日間好気的に行なう。 ４ 酵素法 予め培養し集菌した菌体あるいは固定化菌体等
を用いる酵素法は、反応系を単純にし培養物中か
ら生成物の分離回収を容易ならしめる。 すなわち、予め調製した（固定化）菌体を菌体
として0.05〜10wt％およびβ―置換プロピオニト
リル0.5〜10wt％を含む水性懸濁液を温度０〜40
℃、好ましくは５〜30℃、PH６〜10、好ましくは
７〜９で、30分〜５日間反応させればよい。反応
媒体としては水、生理食塩水、緩衝液等の水性媒
体が用いられる。 また、上記同様、基質の毒性のため基質濃度を
コントロールすることが好ましい。 ５ 生成物の選択 本発明による方法の場合、通常の化学反応とは
逆にアミド生成工程の反応速度が酸生成工程の反
応速度に比して著しく大きいため、主として反応
時間の調節だけで生成物の選択が可能である。 すなわち、β―置換プロピオン酸アミドを得た
い時はニトリル添加後、30分〜20時間、β―置換
プロピオン酸を得たい時は同じくニトリル添加後
１〜５日反応を続けた後、生成物を回収すれば、
ほとんど選択的に目的物が取得可能である。 ６ 回収 培養物または（固定化）菌体懸濁液よりβ―置
換プロピオン酸アミドまたはβ―置換プロピオン
酸を分離回収するには、通常のカルボン酸アミド
またはカルボン酸の分離回収に用いられる任意の
手段を用いることができる。 例えば、遠心分離または過により菌体、不溶
性無機塩などを分離除去し、母液またはその減圧
乾燥残査を有機溶媒で抽出し、抽出液から溶剤を
留去し、次いで必要に応じて再結晶または減圧蒸
留により精製する。 以下、本発明の方法について代表的な例を示し
さらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実
施例に何ら制限されるものではない。 実施例 １ （） 菌体の製造 グルコース10ｇ／、ペプトン５ｇ／、酵母
エキス３ｇ／、および麦芽エキス３ｇ／を含
み、PH7.2に調整した培地100mlを500ml三角フラ
スコに分注し、120℃で15分間加圧殺菌した。 この培地にコリネバクテリウム属Ｎ―774菌株
を１白金耳接種して30℃で３日間振盪培養を行な
い菌体を生産した。この菌体を培養液から遠心分
離により分離し、PH7.2のリン酸バツフアーで２
回洗浄した。このようにして得られた洗浄菌体の
含水率は約80％であつた。 （） 反応 上記洗浄菌体0.5ｇを2.0％のβ―ヒドロキシプ
ロピオニトリルを含む0.05Mのリン酸緩衝液（PH
8.5）100ｇに添加し、撹拌下30℃で１時間反応さ
せた。反応終了後、反応液をガラスクロマトグラ
フ法で分析したところ、2.5％のβ―ヒドロキシ
プロピオン酸アミドを含み、未反応のβ―ヒドロ
キシプロピオニトリルおよび副反応生成物のβ―
ヒドロキシプロピオン酸は検出されなかつた。 このようにして得た反応液１から遠心分離に
より菌体を除去した後、減圧下で水を除去し、次
いで残査をアセトニトリルで抽出したところ19.0
ｇ（融点60〜65℃、収率75.8％）のβ―ヒドロキ
シプロピオン酸アミドが得られた。 実施例 ２ 実施例１（）と同様に調整した洗浄菌体0.5ｇ
を2.0％のβ―ヒドロキシプロピオニトリルを含
む0.05Mのリン酸緩衝液（PH7.2）100ｇに添加
し、撹拌下30℃で24時間反応させた。反応終了
後、反応液をガスクロマトグラフ法で分析したと
ころ2.5％のβ―ヒドロキシプロピオン酸を含み、
β―ヒドロキシプロピオニトリルおよびβ―ヒド
ロキシプロピオン酸アミドは検出されなかつた。 このようにして得た反応液１から遠心分離に
より菌体を除去した後、陰イオン交換樹脂に接触
させて、β―ヒドロキシプロピオン酸を吸着さ
せ、次いで塩酸でこれを溶出し、減圧濃縮したと
ころ17.5ｇ（収率69.2％）のオイル状のβ―ヒド
ロキシプロピオン酸が得られた。 実施例 ３ グルコース10ｇ／、ペプトン５ｇ／、酵母
エキス３ｇ／、および麦芽エキス３ｇ／を含
みPH7.2に調製した培地100mlを500ml三角フラス
コに分注し、120℃で15分間加圧殺菌した。 この培地にコリネバクテリウム属Ｎ―771菌株
を１白金耳接種して30℃で２日間振盪培養を行な
い、次いで別に殺菌したβ―クロロプロピオニト
リル２ｇを無菌的に加えて、さらに30℃で２日間
振盪培養を行なつた。反応終了後、反応液をガス
クロマトグラフ法で分析したところ、2.3％のβ
―クロロプロピオン酸を含み、末反応のβ―クロ
ルプロピオニトリルは検出されなかつた。 このようにして得た反応液１から遠心分離に
より菌体を除去した後、減圧下で濃縮し、次いで
酸を加え系のPHを４以下にした後、１，２―ジク
ロルエタンで抽出し、抽出液から溶媒を留去し、
次いで減圧蒸留することにより、18.2ｇ（沸点
106〜108℃／12mmＨｇ，収率75.2％）のβ―クロ
ロプロピオン酸が得られた。 実施例 ４ 接種菌株をノカルデイア属Ｎ―775菌株に、ま
た基質のβ―置換プロピオニトリルをβ―メルカ
プロピオニトリルに変えたほかは、実施例３と同
様に実験を行なつた。 その結果、反応液は2.1％のβ―メルカプトプ
ロピオン酸を含んでおり、回収操作の結果、16.8
ｇ（沸点114〜118℃／13mmＨｇ、収率69.0％）の
β―メルカプトプロピオン酸が得られた。 実施例 ５〜６ 基質を変えた以外は実施例１と同様の操作を繰
り返したところ、次の結果を得た。

【表】 実施例 ７ 基質、洗浄菌体使用量および反応時間を変えた
以外は、実施例１と同様の操作を繰り返したとこ
ろ次の結果を得た。

【表】

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コリネバクテリウム属（Genus
   Corynebacterium）またはノカルデイア属
   （Genus Nocardia）に属し、式（）で示され
   るβ―置換プロピオニトリルを加水分解する能力
   を有する微生物の作用により、式（）で示され
   るβ―置換プロピオニトリルから、式（）で示
   されるβ―置換プロピオン酸アミドまたは式
   （）で示されるβ―置換プロピオン酸を生成さ
   せることを特徴とする微生物によるβ―置換プロ
   ピオン酸またはそのアミドの製造法。 式（） XCH₂CH₂CN 式（） XCH₂CH₂CONH₂ 式（） XCH₂CH₂CO₂H 〔式中、Ｘはハロゲン、RO―，RR′N―およ
   びRS―（Ｒ，R′はＨ―またはCH₃―）などの置
   換基を表わす。〕