EA009075B1

EA009075B1 - Штаммы микроорганизма rhodococcus, способные превращать нитрил в амид, и способ получения амидов

Info

Publication number: EA009075B1
Application number: EA200500335A
Authority: EA
Inventors: Карен Трейси Робинс; Тору Нагасава
Original assignee: Лонца Аг
Priority date: 1997-07-22
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2007-10-26
Also published as: HU226274B1; US7105322B2; IL133754A0; TR200000150T2; JP2001511355A; NO996401D0; US20030148478A1; HUP0003069A3; US7595178B2; DK1002122T3; WO1999005306A1; PT1002122E; CZ299166B6; US7556956B2; CN1108372C; CA2294621C; JP4302876B2; ES2190098T3; US20080057550A1; NO996401L

Abstract

В изобретении описан новый биотехнологический способ получения амидов из нитрилов. Этот способ основан на применении микроорганизмов рода Rhodococcus.

Description

Настоящее изобретение относится к новым микроорганизмам рода КБобососсик, а также к новому способу получения амидов с использованием этих микроорганизмов, соответственно с использованием экстракта ферментов этих микроорганизмов.

Для получения амидов, таких как, например, амид никотиновой кислоты, который является важным для животных и людей витамином комплекса витаминов В, уже известны многочисленные биотехнологические способы. Широко известно, что содержащие нитрилгидратазу микроорганизмы превращают нитрилы в соответствующие амиды. Так, в ЕР-А 0188316 описан способ получения амида никотиновой кислоты из 3-цианпиридина с использованием микроорганизмов родов КБобососсик, Лг111гоЬас1сг или микобактерий.

Недостатком этого способа является то, что эти микроорганизмы обладают лишь незначительной активностью в отношении превращения 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты.

В ЕР-А 0307926 описано превращение 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты с помощью микроорганизмов вида КБобососсик тБобосБтоик 11. Для того чтобы эти микроорганизмы катализировали требуемое превращение, их необходимо индуцировать.

Еще одним недостатком этого способа является то, что КБобососсик тБобосБтоик Л имеет красную окраску и вследствие этого происходит окрашивание продукта. Кроме того, этот микроорганизм обладает лишь незначительной теплостойкостью и ингибируется, например, субстратом 3-цианпиридином.

Еще один способ получения амида никотиновой кислоты из 3-цианпиридина с помощью микроорганизмов вида КБобососсик тБобосБтоик Л описан в ЕР-А 0362829. Для повышения удельной активности содержащих нитрилгидратазу микроорганизмов в среду для культивирования в качестве индуктора добавляют мочевину или производное мочевины. При использовании этого способа, равно как и способа, описанного выше, происходит окрашивание продукта.

Далее в АО 95/17505 описан способ получения ароматических амидов из соответствующих нитрилов с помощью микроорганизмов вида КБобососсик тБобосБтоик М33. Недостатком этого способа является красная окраска КБобососсик тБобосБтоик М33, а также высокое значение К_М для субстрата 3цианпиридина.

Задачей настоящего изобретения является устранение этих недостатков и разработка такого способа получения амидов, который обеспечивал бы получение соответствующих амидов с высоким выходом и высокой степенью чистоты.

Указанная задача решается с помощью новых микроорганизмов, а также с помощью способа с их использованием.

Суть способа по изобретению заключается в том, что используемый в качестве субстрата нитрил превращают в соответствующий амид с помощью микроорганизмов рода КБобососсик, с помощью экстракта ферментов этих микроорганизмов.

Применяемые для биотрансформации нитрилы, такие как, например, 3-цианпиридин, представляют собой имеющиеся в продаже соединения.

Микроорганизмы по изобретению обладают способностью превращать используемые в качестве субстрата нитрилы в соответствующие амиды. Предпочтительно, чтобы эти микроорганизмы обладали способностью расти на средах, содержащих нитрилы или амиды в качестве единственных источников углерода и/или азота.

Микроорганизмы по изобретению получают путем соответствующего отбора, например, из образцов почвы, ила или сточных вод с помощью обычных микробиологических методов. Целесообразно осуществлять отбор микроорганизмов путем выращивания в среде, содержащей нитрилы или амиды предпочтительно в качестве единственных источников углерода и азота, в присутствии ионов кобальта. Пригодные для осуществления отбора нитрилы и амиды представляют собой прежде всего нитрилы, которые также применяют в качестве субстрата для последующей биотрансформации, и соответствующие получаемые из них амиды. Пригодные для роста среды также известны специалисту в данной области; например, может использоваться среда, представленная в табл. 1.

Как правило, микроорганизмы до осуществления собственно биотрансформации культивируют (выращивают) в одних и тех же условиях, при этом применяют указанные выше среды.

Как известно специалистам, нитрилгидратаза образуется только тогда, когда среда для роста содержит ионы кобальта в качестве кофактора. Пригодными кобальтовыми соединениями, образующими ионы кобальта являются соли, содержащие Со²⁺ или Со³⁺. Примерами содержащих Со²⁺ или Со³⁺ солей являются хлорид кобальта, сульфат кобальта и ацетат кобальта.

В качестве кобальтового соединения целесообразно применять соль, содержащую Со²⁺, такую, как, например, СоС1₂. Выращивание можно также осуществлять в присутствии витамина В₁₂ вместе с металлическим кобальтом или другими кобальтовыми соединениями, которые ίη кБи дают ионы кобальта. Целесообразно применять кобальтовое соединение в количестве от 1 до 10 мг/л, предпочтительно от 1 до 3 мг/л.

Как правило, выращивание осуществляют при температуре от 20 до 50°С и при значении рН в диапазоне от 5 до 8, предпочтительно при температуре от 30 до 45°С и значении рН в диапазоне от 5,5 до 7,5.

- 1 009075

При создании изобретения далее было установлено, что некоторые микроорганизмы рода Кйобососсик обладают лучшими характеристиками в отношении превращения нитрилов в амиды по сравнению с Кйобососсик гйобосйтоик Л, описанным в ЕР-А 0362829. Этими микроорганизмами являются К1юбососси5 СБ674, КЕобососсик СБ578, КЕобососсик СБ473, КЕобососсик СБ270 (Ό8ΜΖ 12211) и КНобососсик СБ376 (Ό8ΜΖ 12175) или их функционально эквивалентные варианты и мутанты. В соответствии с Будапештским договором в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур 15.05.1998 г. был помещен микроорганизм, имеющий регистрационный номер Ό8ΜΖ 12175, а 08.06.1998 г. был помещен микроорганизм, имеющий регистрационный номер Ό8ΜΖ 12211.

Штаммы КНобососсик СБ270, СБ376, СБ473, СБ578 и СБ674 после идентификации отнесены к еще не описанным в научной литературе видам рода КНобососсих Таким образом, изобретение также относится к микроорганизмам КЕобососсик СБ270, Кйобососсик СБ376, Кйобососсик СБ473, КЕобососсик СБ578 и КЕобососсик СБ674.

В отличие от этого микроорганизмы рода КЕобососсик целесообразно индуцировать перед их использованием для собственно биосинтеза. В качестве индукторов пригодны индукторы, описанные в ЕРА 0307926, такие как, например, ацетамид, амид масляной кислоты, метакриламид, амид пропионовой кислоты, кротонамид и амид валериановой кислоты.

Под функционально эквивалентными вариантами и мутантами подразумеваются микроорганизмы, происходящие из вышеуказанных организмов-предшественников и обладающие в основном такими же свойствами и функциями, что и последние. Такие варианты и мутанты могут возникать случайно, например, в результате облучения ультрафиолетовым светом или под действием вызывающих мутации химических веществ.

Сокращения и пояснения, использовавшиеся при идентификации (+) 1-5% + 5-15% + + 15-30% + + + >30%

ДАП диаминопимелиновая кислота

АРА арабиноза

ГАЛ галактоза

МАД мадуроза

КСИ ксилоза

ГЛЮ глюкоза

РИБ рибоза

Типы сахаров даны согласно БссНсуаКсг и др., 1971

Типы жирных кислот даны согласно Кторреи81еб1, 1985 и 1992

9/4 МК-9 (Н₄)

9/6 МК-9 (Н₆)

9/8 МК-9 (Н8)

МК миколовые кислоты

ФЭ фосфатидилэтаноламин

ОН-ФЭ гидрокси-ФЭ мет-ФЭ фосфатидилметилэтаноламин

ФХ фосфатидилхолин

ФГА фосфатидилглюкозамин

ФИ фосфатидилинозитол

ФИМ фосфатидилинозитолманнозид

ФГ фосфатидилглицерин

ДФГ дифосфатидилглицерин

ГЛ гликолипид

Жирные кислоты изо-16 изогексадекановые кислоты или 14-метилпентадекановые кислоты

10-Ме-18 туберкулостеариновая кислота

2-ОН-16 2-гидроксипальмитиновая кислота

Идентификация штаммов СБ270, СБ376, СБ473, СБ578 и СБ674

Идентификацию этих штаммов проводили на основе 5 независимых друг от друга характеристик.

1. Морфология и цвет колоний: Короткие разветвленные гифы, которые распадаются на элементы, напоминающие палочки и споры. Колонии штаммов СБ270 и СБ376 имеют розовато-красный цвет (КАЕ 3022), а колонии штаммов СБ578 и СБ674 имеют ярко-красный цвет (КАЬ 3012).

2. Диаминокислоты пептидогликанов: Мезодиаминопимелиновая кислота.

3. Миколовые кислоты: миколовые кислоты Кйобососсик: Определение миколовой кислоты с длинной цепью осуществляли с помощью высокотемпературной газовой хроматографии. Профили элюирования миколовых кислот штаммов СБ270 и СБ376, а также штаммов СБ473, СБ578 и СБ674 были иден

- 2 009075 тичными. Цепи миколовых кислот штаммов СЕ270 и СЕ376 включали 38-46 атомов углерода, а цепи миколовых кислот штаммов СЕ473, СЕ578 и СЕ674 включали 40-48 атомов углерода. Характеристики миколовых кислот сравнивали с характеристиками миколовых кислот штаммов Кйодососсиз. Штамм СЕ270 был идентифицирован с очень низким коэффициентом корреляции (0,086) как принадлежащий к виду Кйодососсиз гйодосйгоиз; СЕ376 не мог быть идентифицирован этим методом. Остальные три изолята СЕ473, СЕ578 и СЕ674 были идентифицированы с очень низким коэффициентом корреляции как принадлежащие к виду КЕодососсиз гиЬег.

4. Спектр жирных кислот: Неразветвленные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, включая туберкулостеариновую кислоту. Спектр жирных кислот является диагностическим признаком для представителей всех родов Кйодососсиз и близкородственных родов МусоЬас1епиш, Ыосагд1а, Э1е171а, ТзикашигеИа и некоторых видов коринебактерий. Идентификацию на видовом уровне осуществляли на основе количественных и качественных различий характеристик жирных кислот штаммов СЕ270, СЕ376, СЕ473, СЕ578 и СЕ674 и жирных кислот видов КЕодососсиз.

5. Частичные последовательности 168-рДНК штаммов СЕ270 и СЕ376 были идентичными (100%), хотя их сравнение с последовательностями штаммов Кйодососсиз выявило сходство только на 99,1% с наиболее близкородственным видом КЕодососсиз гйодосйгоиз. Штаммы СЕ473 и СЕ578 имели идентичные последовательности 168-рДНК (100%). Штамм СЕ674 имел отличие от штамма СЕ578 только в одной паре оснований из 500 (99,8%). Все три изолята имели лишь отдаленное родственное сходство с Кйодососсиз соргорййиз (98,4%).

На основе хемотаксических и молекулярно-биологических данных можно сделать заключение о том, что СЕ270 и СЕ376, с одной стороны, и СЕ473, СЕ578 и СЕ674, с другой стороны, представляют собой штаммы двух новых видов Кйодососсиз. По своим последовательностям 168-рДНК штаммы СЕ270 и СЕ376 являются близкородственными с Кйодососсиз гйодосйгоиз (99,1%), а штаммы СЕ473, СЕ578 и СЕ674 имеют лишь отдаленное родственное сходство с Кйодососсиз соргорййиз (98,4%).

Экстракт ферментов может быть получен путем хорошо известного специалистам разрушения микроорганизмов, например, с помощью ультразвука, с помощью пресса типа Френч или с использованием лизозима. Очевидно, что для осуществления способа этот экстракт ферментов, равно как и целые клетки микроорганизмов, могут быть иммобилизованы на пригодном носителе, представляющем собой полимер, или абсорбирован на пригодном носителе.

Ферменты по изобретению, обладающие нитрилгидратазной активностью, могут быть получены из микроорганизмов рода Ашусо1а1ор818, прежде всего из штамма Ашусо1а1ор818 ΝΑ40 (Ώ8ΜΖ 11617), и они обладают способностью превращать нитрил в амид.

Основными свойствами этих ферментов являются следующие:

а) рН-оптимум составляет 6,5±1,0;

б) температурный оптимум при рН 7,0 находится между 35 и 40°С;

в) значение К_М для субстрата 3-цианпиридина составляет 41,7±7,7мМ (20°С, 45мМ фосфатный буфер, рН 7,0), прежде всего ферменты имеют

г) молекулярную массу 105 кДа, что может быть определено, например, с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

В качестве субстрата для биотрансформации могут применяться в принципе любые нитрилы. Целесообразно применять либо алифатические нитрилы, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, при необходимости замещенные, например, гидрокси-, аминогруппой, галогеном или карбоксигруппой, либо замещенные или незамещенные ароматические нитрилы, содержащие от 4 до 10 атомов углерода в ароматической кольцевой системе. В качестве алифатических нитрилов, содержащих от 1 до 10 атомов углерода, могут применяться динитрилы, гидроксинитрилы, аминонитрилы, такие как, например, ноктаннитрил, циануксусная кислота, изокапронитрил, н-валеронитрил, адипонитрил, глутаронитрил, сукцинонитрил, себаконитрил, пропионитрил, кротонитрил, акрилнитрил, метакрилнитрил, нитрил нмасляной кислоты или азеланитрил. В качестве ароматических нитрилов, содержащих от 4 до 10 атомов углерода, могут применяться нитрилы общих формул или

II где К¹ и К² обозначают атом водорода, атом галогена или С₁-С₄алкил. Атом галогена может представлять собой Е, С1, Вг или I.

- 3 009075

С^С₄алкил может представлять собой метил, этил, пропил, изопропил, трет-пропил, бутил, изобутил или трет-бутил. Пригодными представителями ароматических нитрилов общей формулы I или II являются 2-, 3- или 4-цианпиридин, бензонитрил, фтор-, хлор-, бромбензонитрил, например, орто-, мета-, пара-хлорбензонитрил или 2-хлор-3-цианпиридин. Предпочтительно в качестве ароматического нитрила, содержащего от 4 до 10 атомов углерода, применять 3-цианпиридин.

Биотрансформацию с применением однократной или непрерывной загрузки субстрата целесообразно проводить таким образом, чтобы концентрация субстрата не превышала 40 мас.%, предпочтительно 30 мас.%.

Способ целесообразно осуществлять с использованием покоящихся (не растущих) клеток.

В качестве сред для биотрансформации пригодны обычные в данной области техники среды, такие как, например, низкомолярный фосфатный буфер, буфер НЕРЕ8 (\-2-гидроксиэгилпиперазин-\'-2этансульфоновая кислота), цитратный буфер, боратный буфер, среды, состав которых представлен в табл. 1-3, или их модифицированные формы, такие как, например, среда, описанная в примере 8(1), или буфер трис-НС1.

Биотрансформацию целесообразно проводить при температуре от 0 до 50°С и при значении рН в диапазоне от 4,5 до 10, предпочтительно при температуре от 20 до 40°С и при значении рН в диапазоне от 4,5 до 10,0.

В особенно предпочтительном варианте осуществления биотрансформацию можно проводить в присутствии С₁-С₄спиртов. В качестве С₁-С₄спиртов могут применяться метанол, этанол, пропанол или бутанол. Предпочтительно применяют метанол.

По завершении превращения соответствующие амиды могут быть выделены с помощью обычных методов переработки, например с помощью кристаллизации.

Примеры

Пример 1. Культивирование микроорганизмов родов Асйпошабига и Лшусо1а1ор818

а) В различные образцы почвы, помещенные в обогатительную среду, состав которой приведен в табл. 1, вносили различные нитрилы или амиды в качестве источников углерода и азота и инкубировали в течение 7-10 дней при 37 или 45°С. После этого культуры пересевали в такую же среду и еще раз культивировали в течение 7-10 дней при 37°С. Весь процесс повторяли трижды. После этого культуры разжижали и высевали на планшеты для получения отдельных колоний. Планшеты инкубировали в течение 5 дней при 37°С. После этого различные колонии тестировали на требуемую активность.

Таким путем выделяли штаммы Лшусо1а1ор818 \А40 (Ό8ΜΖ 11617) и Лшусо1а1ор818 \Е31 (Ό8ΜΖ 11616) и затем выращивали их в оптимизированной среде (табл. 3) при встряхивании в течение 90-100 ч при 37°С.

Для Лшусо1а1ор818 \Е31 (Ό8ΜΖ 11616), Асйпошабига зраШх Е3733 и Асйпошабига зраШх Е3736 в качестве источника углерода и азота использовали адипонитрил, для Ашусо1а1ор818 \А40 (Ό8ΜΖ 11617) и Асйпошабига зраШх 45А32 в качестве источника углерода и азота использовали азеланитрил, для Асйпошабига зраШх 4501 в качестве источника углерода и азота использовали н-октанитрил, а для Асйпошабига 8раб1х С15 в качестве источника углерода и азота использовали циануксусную кислоту.

б) Штамм Ашусо1а1ор818 \А40 культивировали в среде, состав которой представлен в табл. 3. Культивирование осуществляли в субкультурах (в пробирках объемом 4 мл) и в основной культуре (в колбах объемом 500 мл) в аэробных условиях при температуре 37°С в течение 2, соответственно 3-4 дней. Рост клеток измеряли турбидиметрическим методом при длине волны 610 нм и сухую массу клеток подсчитывали следующим образом: масса сухих клеток (в мг/мл) = ОП_610нм ^х0,277.

Таблица 1

Обогатительная среда

нитрил	2,0 г
КН₂РО₄	7,0 г
Μ§8Ο₄·7Η₂Ο	0,1 г
смесь витаминов	1,0 мл
СоС1₂»6Н₂О	2,0 мг
Ре8О₄«7Н₂О	2,0 мг

добавить воду до 1 л (рН 6,7-7,3)

- 4 009075

Таблица 2

Основная среда
мальтоза	2,0 г
ΝαΝΟ₃	1,0 г
К₂НРО₄	0,1 г
Μβ8Ο₄·7Η₂Ο	0,05 г

добавить воду до 100 мл (рН 7,0)

Таблица 3

Оптимизированная среда
ϋ- глюкоза	4,5 г
мясной экстракт	0,5 г
К₂НРО₄	0,1 г
Μ§8Ο₄·7Η₂Ο	0,05 г
СоС1₂»6Н₂О	1,0 мг

добавить воду до 100 мл (рН 7,0)

Пример 2. Биотрансформация с использованием микроорганизмов родов АсНпотабига и Атусо1а1орь1ь (1) Для определения нитрилгидратазной активности реакционную смесь (2 мл), содержащую 3цианпиридин (Ι,ΟΜ, 1,0 мл), калий-фосфатный буфер (рН 7,0, 0,1М, 0,5 мл) и 0,5 мл суспензии клеток, инкубировали при перемешивании при 20°С в течение 30 мин. Реакцию прекращали путем добавления 0,2 мл Зн. НС1. После кратковременного центрифугирования определяли содержание образовавшегося никотинамида с помощью ЖХВР (система типа БЫшасНи 8Ρϋ 6А с С 18-колонкой (ϋενείοδίΐ Οϋδ-ΗΘ-5, 4,6x250 см); растворитель: ЮмМ КН2РО4/Н3РО4 (рН 2,8)/ацетонитрил (в объемном соотношении 9:1); скорость потока: 1 мл/мин; абсорбцию измеряли при 230 нм). Удельную активность выражали в виде количества (мкмоль) образовавшегося никотинамида/мл/мин/ОП₆1_0нм·

Скорости превращения алифатических нитрилов в обогатительной среде (табл. 1) с использованием выделенных бактерий представлены в табл. 5, влияние индукторов и кофакторов, внесенных в основную среду (табл. 2), представлено в табл. 4, а сравнение активности Ашусо1а1орь1ь и Шюйососсиь в основной среде (табл. 2) представлено в табл. 6. Данные из табл. 4 свидетельствуют о том, что нитрилгидратаза из Ашусо1а1оры8 ΝΑ40 экспрессируется конститутивным образом, однако для проявления активности в качестве кофактора необходим кобальт.

(2) Влияние температуры на рост штамма ΝΑ40

Субкультуры (2 мл) инкубировали в среде, представленной в табл. 3, в течение 2 дней при 37°С, затем их пересевали в 20 мл среды, представленной в табл. 3 и содержащейся во встряхиваемых колбах. Культивирование проводили при 37, 40, 45, 50 и 55°С в течение 3-4 дней при встряхивании. Измеряли рост клеток и оценивали нитрилгидратазную активность при 20°С. В табл. 7 представлены данные о влиянии температуры на нитрилгидратазную активность и рост клеток.

Таблица 4 Влияние индукторов и кофакторов на удельную активность в основной среде

Индуктор	Рост	Общая активность (мкмоли/м л/мин)	Удельная активность (мкмоли/мл /мин/ОП)
-	1,26	20,9	16,6
¢-капролактам	0,66	9,52	14,5
кротонамид	3,41	22,9	6,72
метакриламид	3,33	2,46	0,74
бутирамид	2,19	0,19	0,88
пропионамид	1,91	0,92	0,48
мочевина	1,72	2,97	1,73
Кофактор	Рост <θΠ_61011Μ>	Общая активность (мкмоли/мл/мин)	Удельная активность (мкмоли/мл/мин/ОП)
-	7,97	0,10	0,01
Ре8О₄*7Н₂О	8,32	3,36	0,40
СоС1₂*6Н₂0	8,41	47,8	5,68

-5009075

Таблица 5

Скорости превращения алифатических нитрилов при использовании выделенных бактерий

Штамм	Субстрат	Рост (0П₆ю нм*	Общая активность (мкмоли/мл/мин)	Удельная активность (мкмоли/мл/мин/ОП)
Атусо1а1ор818 ΝΕ31 (ϋδΜΖ 11616)	адипонитрил	2,68	0,377	0,141
Лсйпотайига зрасНх Е3733	адипонитрил	1,62	0,347	0,214
Асйпогпайига зраШх Е3736	адипонитрил	1,36	3,00	2,21
АсНпотайига зрасПх 45А32	азеланитрил	5,81	18,8	3,23
АсЕпотайига зрасНх 4501	н-октаннитрил	7,24	32,2	4,45
АсНпотайига зрасНх С15	циануксусная кислота	2,04	7,01	3,43
Атусо1а1ор818 ΝΑ40 (Ώ8ΜΖ 11617)	азеланитрил	5,92	33,0	5,57

Таблица 6

Сравнение активностей Атусо1а1ор818 и Кйобососсиз гйобосйгоиз Н

	Микроорганизм Атусо1а1оры8 ΝΑ40 Φ8ΜΖ 11617) (мкмоли/мл/мин)	Микроорганизм КЬойососсия гЬойосНгоиз Л
Активность в отношении 3цианпиридина	303	314
	Очищенный фермент из	Очищенный фермент из
	штамма ΝΑ40	штамма Л (мкмоли/мин/мг
	(мкмоли/мин/мг протеина)	протеина)
Активность в отношении 3цианпиридина	1110	371

(3) Для определения активности штамма ΝΑ40 в отношении других субстратов клетки с сухой массой 0,0388 мг инкубировали в описанном выше буфере. Реакцию начинали путем добавления соответствующего субстрата и смесь инкубировали при встряхивании в течение 10 мин при 20°С. Реакцию прекращали, добавляя 0,2 мл 2н. НС1, и реакционную смесь центрифугировали в течение короткого промежутка времени. Надосадочную жидкость анализировали с помощью ЖХВР или газовой хроматографии. В табл. 8 приведены условия опытов по определению специфичности в отношении субстрата, а в табл. 9 представлены данные по специфичности покоящихся клеток штамма ΝΑ40 в отношении различных субстратов.

Соответствующие условия опытов обобщены в табл. 8, а результаты - в табл. 9.

Таблица 7

Влияние температуры выращивания на нитрилгидратазную активность и на рост клеток

Температура	Рост (мг/мл)	Общая активность (мкмоли/мл/мин)	Удельная активность (мкмоли/мл/мин/мг)	Относительная активность (%)
37°С	6,16	4,69	0,761	100
40° С	5,79	9,89	1,71	225
45° С	6,56	4,83	0,736	97
50° С	5,96	1,16	0,195	26

- 6 009075

Таблица 8

Условия опытов для определения специфичности в отношении субстрата

Субстрат	Субстрат (мМ)	Метод анализа	Образовавшийся амид
3-цианпиридин	1,0	ЖХВР	никотинамид
2-цианпиридин	0,25	ЖХВР	2-пиколинамид
4-цианпиридин	0,25	ЖХВР	пиридин-4-карбоксамид
кротонитрил	0,4	ЖХВР	кротонамид
бензонитрил	0,03	ЖХВР	бензамид
акрилнитрил	0,4	ЖХВР	акриламид
орто-хлорбензонитрил	0,15	ЖХВР	орто - хлор бензамид
мета-хлорбензонитрил	0,15	ЖХВР	мета - хлор бензамид
пара-хлорбензонитрил	0,15	ЖХВР	пара-хлорбензамид
2-хлор-3-цианпиридин	0,15	ЖХВР	2 - хлорникотинамид
ацетонитрил	0,4	ГХ	ацетамид
пропионитрил	0,4	ГХ	пропионамид
м етакрилнитрил	0,4	ГХ	метакриламид
н-бутиронитрил	0,4	ГХ	н-бутирамид

Примечание: орто-, мета-, парахлорбензонитрил и 2-хлор-З-цианпиридин добавляли в реакционную смесь в виде раствора в метаноле.

Таблица 9 Специфичность нитрилгидратазы штамма ΝΑ40 в отношении субстрата

Субстрат	Относительная активность (%)	Субстрат	Относительная активность (%)
3-цианпиридин	100	мета - хлорбензонитрил	75
4-цианпиридин	168	пара-хлорбензонитрил	16
2-цианпиридин	128	2-хлор-Зцианпиридин	126
бензонитрил	51	ацетонитрил	-
кротонитрил	52	пропионитрил	105
акрилнитрил	115	метакрилнитрил	130
орто-хлорбензонитрил	96	н-бутиронитрил	194

(4) Температурный оптимум покоящихся клеток и их теплостойкость

Реакцию проводили в течение 10 мин в стандартной реакционной смеси. Температурный оптимум находился в диапазоне от 35 до 40°С (фиг. 5). После этого клетки инкубировали в течение 30 мин при различных температурах и оценивали активность в стандартных реакционных условиях. Как видно из фиг. 4, теплостойкость сохранялась приблизительно до 40°С.

(5) рН-оптимум и рН-стабильность покоящихся клеток

Для определения этих характеристик проводили реакцию в течение 10 мин в стандартной реакционной смеси, в которой калий-фосфатный буфер заменяли различными 0,1М буферами. Как видно из фиг. 6, оптимальное значение рН находится в диапазоне от 4,5 до 10. После инкубации клеточной суспензии в течение 30 мин при 20°С при различных значениях рН клетки центрифугировали. Затем клетки промывали и ресуспендировали в 0,1М калий-фосфатном буфере с рН 7,0. Реакцию проводили в течение 10 мин в стандартных условиях при добавлении 3-цианпиридина. Фермент оставался стабильным при значениях рН в диапазоне от 4,5 до 10,0 (фиг. 7).

(6) Накопление никотинамида, получаемого из 3-цианпиридина с использованием штамма ΝΑ40

Реакцию проводили в реакционной смеси (30 мл), содержащей 500мМ 3-цианпиридин, 40мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,0) и покоящиеся клетки (сухая масса 2,3 мг). В ходе реакции 7 раз добавляли 3-цианпиридин (500мМ) по мере израсходования предыдущей порции. Таким образом, в течение 15 ч было внесено 4,0 моль 3-цианпиридина, в результате образовывалось 3,89 моль (475 г/л) никотинамида, что соответствует выходу 97,3%. Никотиновая кислота не образовывалась.

Пример 3. Идентификация микроорганизмов рода Ашусо1а1оры8

Идентификация основывалась на использовании следующих 5 хемотаксономических маркеров.

1. Диагностическая аминокислота пептидогликана: мезодиаминопимелиновая кислота.

2. Диагностические сахара: арабиноза и галактоза.

3. Миколовые кислоты: миколовые кислоты отсутствуют.

4. Менахинон: МК-9 (Н₄).

5. Спектр жирных кислот: изо/антеизоразветвленные и 2-гидроксижирные кислоты, кроме того, выявлены незначительные количества 10-метилразветвленных жирных кислот. Такой спектр жирных кислот обнаружен у всех представителей рода Ашусо1а1оры8 (спектр жирных кислот 3ί).

Комбинация этих химических признаков достаточна для обнаружения всех видов рода Ашусо1а1оры8.

Характеристики жирных кислот обеих культур сравнивали с информацией, находящейся в банке данных жирных кислот, с использованием анализа основных компонентов. С помощью этого метода оказалось возможным отнести как штамм ΝΕ31, так и штамм ΝΑ40 к роду Ашусо1а1оры8, однако осуществить видовую идентификацию оказалось невозможным, так как коэффициент корреляции был слишком низким. Однако на основе сравнения спектра жирных кислот обоих штаммов было установлено, что они представляют собой два штамма, относящиеся к различным видам.

Этот факт был подтвержден результатами анализа последовательности 168-рДНК. В этом случае также была установлена принадлежность к роду Ашусо1а1оры8, однако не была установлена принадлежность ни к одному из описанных видов рода Ашусо1а1оры8. С помощью этого метода путем прямого секвенирования была определена последовательность 168-рДНК, полученная в результате амплификации с использованием ПЦР гена 168-рДНК. Диагностическую часть последовательности 168-рДНК сравнивали с последовательностями типичных представителей видов рода Ашусо1а1оры8 и родственных таксонов. Результаты показали, что штамм принадлежит к роду Ашусо1а1оры8. Было обнаружено наибольшее сходство с Ашусо1а!ор818 шеШапойса, составляющее для штамма NΑ40 96,9% и для штамма ΝΕ31 96,1%. Сходство последовательностей обоих штаммов между собой составляло 99,0%. Исследования заявителей, проведенные на представителях рода Ашусо1а1оры8, свидетельствуют о том, что для надежной идентификации видов коэффициент корреляции должен быть выше 99,5%. Поскольку величина 96,9% существенно меньше 99,5%, то можно предположить, что оба изолята не относятся к представителям известных видов Ашусо1а!оры8.

На основе представленных результатов изоляты не могут быть отнесены к какому-либо из известных видов Ашусо1а!оры8. Заявители исходили из того, что NΑ40 и ΝΕ31 представляют собой штаммы двух новых, до сих пор не описанных видов рода Ашусо1а1оры8.

Пример 4. Очистка нитрилгидратазы из микроорганизма штамма NΑ40

Штамм культивировали при 37°С в течение 3 дней в среде, состав которой приведен в табл. 3. Клетки 2-литровой культуры собирали центрифугированием и затем ресуспендировали в 0,85%-ном растворе №С1. После этого клетки переносили в 0,1М калий-фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 44мМ н-масляную кислоту, и обрабатывали ультразвуком. Экстракт клеток центрифугировали и отделяли клеточный дебрис. Этот экстракт применяли для очистки фермента.

На протяжении всей очистки применяли калий-фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 44мМ нмасляную кислоту. Как видно из табл. 10, фермент после трех стадий очистки достигал гомогенного состояния.

Таблица 10

Очистка нитрилгидратазы из штамма NΑ40

	Общая активность (единицы)	Общий протеин (мг)	Удельная активность (ед./мг)	Обогащение
экстракт без клеток	73300	1020	71,9	1
ДЭАЭ- 8ер11асе1	68000	110	620	8,62
фенил- ТОУОРЕАКЬ	64800	61,4	1105	15,4

Примечание: 1 единица соответствует количеству фермента, которое катализирует образование никотинамида со скоростью 1 мкмоль/мин при 20°С.

Пример 5. Изучение свойств нитрилгидратазы (1) Определение молекулярной массы, структуры субъединиц и содержания ионов кобальта

С помощью хроматографии на колонках типа 03000 8Ш (0,75x60 см) с Т8К-гелем с использованием 0,1М калий-фосфатного буфера (рН 7,0) с добавлением 0,2М КС1 и 44мМ н-масляной кислоты было установлено, что молекулярная масса равна 106 кДа. Было обнаружено, что фермент состоит из 2 раз

- 8 009075 личных субъединиц а и β, молекулярные массы которых соответственно равны 30000 и 26000 Да.

На фиг. 1 показана диаграмма определения молекулярной массы с помощью хроматографии на колонке СЗООО 8 XV с Т8К-гелем.

На фиг. 2 показана диаграмма определения молекулярной массы с помощью электрофореза в ДСНПААГ.

На фиг. 3 показан спектр поглощения очищенного фермента. Была обнаружена широкая полоса поглощения при 300-400 нм.

(2) Специфичность очищенного фермента в отношении субстрата

Определение специфичности в отношении субстрата проводили аналогично примеру 2(1). Результаты представлены в табл. 11.

Таблица 11 Специфичность очищенной нитрилгидратазы в отношении субстрата

Субстрат	(М)	Общая активность (мкмоли/мл/мин)	Относительная активность (%)
ферментативная реакция	реакция с использованием покоящихся клеток
3-цианпиридин	1,0	17,7	100	100
2-циа нпирид ин	0,25	39,1	221	128
4-цианпиридин	0,25	31,6	179	168
кротонитрил	0,4	Н,9	67	52
бензонитрил	0,03	11,3	64	51
акрилнитрил	0,4	16,6	94	115
орто- хл орбе н з о нитрил	0,15	22,4	127	96
мета- хлорбензонитрил	0,15	15,9	90	75
пара- хлорбензонитрил	0,15	2,30	13	16
2-хлор-Зцианпиридин	0,15	16,0	90	126
ацетонитрил	0,4	-	-	-—--
пропионитрил	0,4	39,3	222	105
метакрил нитрил	0,4	22,1	125	130
н-бутиронитрил	0,4	17,9	101	194

В реакционную смесь (2,0 мл) добавляли 1,7 единицы фермента. Реакционная смесь содержала соответствующий субстрат в 45мМ фосфатном буфере (рН 7,0).

(3) Определение значения К_м

Значение К_м, которое определяли на основе диаграммы Ыпс\\са\сг-Вигк. для З-цианпиридина составляет 41,7мМ, а для акрилнитрила 3,7мМ. Сравнение со штаммом Ююйососсик г1юс1ос11гои5 Л, у которого значение К_м для З-цианпиридина составляет 200мМ, показывает, что данный параметр у штамма ΝΑ40 имеет существенно меньшую величину. Это является одним из основных преимуществ штамма ΝΑ40.

(4) Теплостойкость и температурный оптимум

Очищенный фермент инкубировали при различных температурах в течение 30 мин при рН 7,0 и затем в течение 1 мин при 20°С оценивали превращение З-цианпиридина в амид никотиновой кислоты. При температуре выше 40°С фермент терял активность. Теплостойкость, как и в случае покоящихся клеток, сохранялась приблизительно до 40°С, температурный оптимум находился в диапазоне от 35 до 40°С (фиг. 5).

(5) рН-оптимум и рН-стабильность

Для определения этих характеристик проводили реакцию превращения З-цианпиридина в амид никотиновой кислоты при 20°С в реакционной смеси (2,0 мл), содержащей различные буферы (42,5мМ), 1,71 единицы очищенного фермента и 500мМ 3-цианпиридин. рН-Оптимум составлял приблизительно 6,5±1,0 (фиг. 8).

Для оценки рН-стабильности инкубировали 4,2 единицы очищенного фермента в течение 1 ч при 20°С в различных буферах (45мМ). Часть инкубированного раствора (1,71 единицы) добавляли в стандартную реакционную смесь (ср. пример 2(1)). Оценивали сохранившуюся активность. Фермент сохранял стабильность при значениях рН в диапазоне от 5 до 9. Результаты представлены на фиг. 9.

-9009075 (6) Ингибиторы

Оценивали влияние различных ингибиторов. Результаты обобщены в табл. 12.

Таблица 12

Влияние различных ингибиторов на активность очищенного фермента

Ингибитор	мМ	Относительная активность (%)
-		100
N - этилмал еинимид	1	97
йодуксусная кислота	1	39
4-хлорртутьбензойная кислота	0,1	69
азид натрия	1	59
гидроксиламин	1	37
фенилгидразин	1	8
семикарбазин	1	82
тирон (двунатриевая соль 4,5-дигидрокси- 1,3- бензолдисульфоновой кислоты)	1	110
орто-фенантролин	1	89
а -, а ’ - дипиридил	1	100
8 - гидроксихинолин	1	110
ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота)	1	115
диэтилдитиокарбамат	1	89

Пример 6. Влияние метанола на покоящиеся клетки штамма ΝΑ40

Реакцию проводили в течение 10 мин в присутствии различных концентраций (0-20 об.%) метанола в реакционных смесях, состав которых приведен в табл. 13. Как видно из табл. 14, активность повышается при добавлении 5-15% метанола.

Таблица 13

Реакция с использованием покоящихся клеток

	Методы
1	2	3	4	5
1,0М 3-цианпиридин	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл
0,1М КФБ * (рН 7,0)	0,9 мл	0,8 мл	0,7 мл	0,6 мл	0,5 мл
метанол	-	0,1 мл	0,2 мл	0,3 мл	0,4 мл
суспензия клеток (0,388 мг/мл)	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл
Общий объем	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл

Примечание: * КФБ обозначает калий-фосфатный буфер.

Таблица 14

Влияние метанола на активность штамма Атусо1а1ор818 ΝΑ40

Методы	Метанол [об.%]	Относительная активность [%1
1	0	100
2	5	123
3	10	128
4	15	130
5	20	105

Пример 7. Накопление микроорганизмов рода КЪобососсиз

Различные образцы почвы вносили в обогатительную среду, состав которой приведен в табл. 1 и которая содержала в качестве источника углерода и азота циануксусную кислоту, и согласно методу, описанному в примере 1, выделяли микроорганизмы КЪобососсиз ΘΡ270, ΘΡ578, ΘΡ473 и ΘΡ376.

Пример 8. Биотрансформация с использованием микроорганизмов рода КЪобососсиз (1) Теплостойкость микроорганизмов КЪобососсиз ΘΡ674, КЪобососсиз ΘΡ578, КЪобососсиз ΘΡ270 и КЪобососсиз ΘΡ376 по сравнению с КЪобососсиз гйобосйгоиз И.

Для определения теплостойкости перечисленные выше микроорганизмы культивировали в описанных ниже средах.

- 10 009075

Штамм КБобососсик гБобосБгоик Л культивировали в течение 72 ч в среде, описанной в ЕР-А 0307926. Микроорганизмы КБобососсик СЕ674, 6Р578, 6Р270 и 6Р376 культивировали в течение промежутка времени, составляющего до 96 ч, при рН 7,0 в следующих средах.

Штамм КБобососсик СР674 культивировали в среде, содержащей 1,0 г/л экстракта дрожжей, 5,0 г/л фруктозы, 10,0 г/л солодового экстракта, 5,0 г/л ацетамида, 2,0 г/л КН₂РО₄, 0,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 10,0 мг СоС1₂-6Н₂О. Штамм КБобососсик СР578 культивировали в среде, содержащей 1,0 г/л экстракта дрожжей, 15,0 г/л фруктозы, 10,0 г/л солодового экстракта, 25,0 г/л ацетамида, 2,0 г/л КН₂РО₄, 0,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 5,0 мг СоС1₂-6Н₂О. Штамм КБобососсик 6Р270 культивировали в среде, содержащей 12,5 г/л экстракта дрожжей, 5,0 г/л цитрата натрия, 7,5 г/л метакриламида, 2,0 г/л КН₂РО₄, 0,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 30,0 мг СоС1₂-6Н₂О. Штамм КБобососсик СР376 культивировали в среде, содержащей 1,0 г/л экстракта дрожжей, 10,0 г/л цитрата натрия, 15,0 г/л солодового экстракта, 7,5 г/л бутирамида, 2,0 г/л КН₂РО₄, 0,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 15,0 мг СоС1₂-6Н₂О.

Затем покоящиеся клетки инкубировали в течение 15 мин при различных температурах и после этого определяли сохранившуюся активность в стандартных реакционных условиях согласно примеру 2(1).

При этом было установлено, что штамм КБобососсик СР674 при температуре 50°С обладает относительной активностью, близкой к 100%, а при 60°С еще сохраняет приблизительно 10% активности. Штамм КБобососсик СР578 при температуре 50°С также обладает относительной активностью, составляющей 100%, и обладает относительной активностью, составляющей 20% при 60°С. Штамм КБобососсик СР376 обладает 100%-ной относительной активностью при температуре до 50°С, 70%-ной активностью при 60°С и при 70°С сохраняет еще приблизительно 5%-ную относительную активность. КБобососсик СР270 обладает почти 100%-ной относительной активностью при температуре до 60°С и также еще сохраняет при 70°С 5%-ную относительную активность. В сравнении с этим штамм КБобососсик гБобосБгоик Л сохраняет до 50°С 100%-ную относительную активность, при 60°С имеет 80%-ную активность и при 70°С полностью теряет активность.

Таким образом, можно утверждать, что штаммы КБобососсик СР270 и СР376 обладают лучшей теплостойкостью по сравнению со штаммом Л, при этом штамм СР270 обладает наиболее высокой теплостойкостью.

(2) Оптимальное значение рН для штаммов КБобососсик

Влияние значения рН на нитрилгидратазную активность штаммов КБобососсик СР674, СР578, 6Р270 и 6Р376 определяли аналогично примеру 2(5).

Оптимальное значение рН для штамма КБобососсик СР674 составляет 7,5-9,5, для СР578 составляет 8-8,5, для 6Р270 составляет 6-7,0 и для 6Р376 составляет 6-8.

(3) Специфичность штаммов КБобососсик в отношении субстрата

Данные о специфичности в отношении субстрата в виде значений относительной активности обобщены в табл. 15.

(4) Накопление никотинамида штаммами КБобососсик

Штаммы КБобососсик 6Р674, 6Р578, 6Р270 и 6Р376 культивировали аналогично примеру 2(6) с использованием в качестве субстрата 3-цианпиридина (приблизительно 500мМ). При этом штамм КБобососсик СР674 продуцировал в течение 25 ч 6М никотинамида, штамм СР578 продуцировал в течение 10 ч 5,5М никотинамида, штамм СР270 продуцировал в течение 20 ч приблизительно 8,5М никотинамида и штамм СР376 продуцировал в течение 20 ч 7,5М никотинамида.

(5) Толерантность активности штаммов КБобососсик в отношении 3-цианпиридина

Для изучения толерантности в отношении 3-цианпиридина покоящиеся клетки инкубировали в течение 15 мин при 20°С при концентрациях 3-цианпиридина в диапазоне от 1 до 10% (мас./об.), после чего клетки центрифугировали. После промывки клеток 0,85%-ным ЛаС1 измеряли сохранившуюся активность.

Толерантность в отношении 3-цианпиридина в качестве субстрата изучали при различных концентрациях субстрата. Было установлено, что при концентрации субстрата 2% (мас./об.) нитрилгидратазная активность штамма КБобососсик тБобосБтоик Л снижается в 1,4 раза, нитрилгидратазная активность штамма КБобососсик СР674 снижается в 1,4 раза при концентрации субстрата 4% (мас./об.), нитрилгидратазная активность штамма КБобососсик СР578 остается практически постоянной вплоть до концентрации субстрата 8%, нитрилгидратазная активность штамма КБобососсик СР270 снижается в 1,7 раза при концентрации субстрата 4% (мас./об.) и нитрилгидратазная активность штамма КБобососсик СР376 снижается в 1,25 раза при концентрации субстрата 10% (мас./об.).

Штамм КБобососсик тБобосБтоик Л обладает наихудшей толерантностью в отношении 3цианпиридина по сравнению с другими штаммами КБобососсик.

- 11 009075

Таблица 15

	КЬоДососсиз гИобосЬгоиз Л	Кйойососсиз СР674	Кйодососсиз СР578	Кйобососсих СР270	КИоДососсиз СР376
3-цианпиридин	100 (%)	100 (%)	100(%)	100 (%)	100(%)
2-цианпиридин	45	308	200	15,7	54,3
4-цианпиридин	70	231	167	55,6	79,8
бензонитрил	27	138	85,1	13,4	57,2
2 - хлорбензонитрил	2,8	64,8	49,0	0	0
3 - хлорбензонитрил	43	27,8	28,9	8,41	8,63
4-хлорбензонитрил	13	0	0	0	0
ацетонитрил	608	1,49	347	659	806
пропионитрил	434	274	132	37,3	245
н-бутиронитрил	352	491	368	181	195
акрилнитрил	478	147	101	192	257
кротонитрил	78,2	98,0	124	37,1	ПО
метакрилнитрил	86,9	176	122	0	0

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Штамм микроорганизма Кйобососсиз зр. ОР270 Ό8Μ 12211, а также его функционально эквивалентные варианты и мутанты, способные превращать нитрил в амид.

2. Штамм микроорганизма Кйобососсиз зр. ОР376 Ό8Μ 12175, а также его функционально эквивалентные варианты и мутанты, способные превращать нитрил в амид.

3. Способ получения амидов, отличающийся тем, что нитрил, применяемый в качестве субстрата, превращают в соответствующий амид с помощью штаммов микроорганизма по п.1 или 2, или экстракта, содержащего нитрилгидратазу, полученного из указанного микроорганизма.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве нитрила используют необязательно замещенный алифатический нитрил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве нитрила используют необязательно замещенный алифатический нитрил, содержащий от 4 до 10 атомов углерода.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве нитрила используют ароматический нитрил, выбранный из соединений общих формул где К¹ и К² обозначают атом водорода, атом галогена или С_гС₄алкил.

7. Способ по любому из пп.3-6, отличающийся тем, что превращение осуществляют при температуре от 0 до 50°С и при значении рН от 4,5 до 10.