NO319663B1 - Mikroorganismer som er i stand til a omdanne nitril og enzymekstrakt med nitrilhydrataseaktivitet, samt fremgangsmate for fremstilling av amider ved anvendelse derav. - Google Patents

Abstract

En ny bioteknologisk fremgangsmåte for fremstilling av nitriler med utgangspunkt fra amider er beskrevet. Mikroorganismer fra slektene Amycolatopsis, Actinomadura eller Rhodococcus blir benyttet i denne fremgangsmåte.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører mikroorganismer som er i stand til å omdanne nitril og enzymekstrakt og enzym med nitrilhydrataseaktivitet, samt fremgangsmåte for fremstilling av amider ved anvendelse derav.

Oppfinnelsen dreier seg om nye mikroorganismer av slekten Actinomadura, Amycolatopsis eller Rhodococcus, og til en ny fremgangsmåte for fremstilling av amider der disse mikroorganismer eller enzymekstrakter fra disse mikroorganismer anvendes.

For amider slik som for eksempel nikotinamid, et vitamin i vitamin B-komplekset som er essensielt for dyr og menneske, er en rekke bioteknologiske fremgangsmåter allerede kjent. Generelt vet man at mikroorganismer som inneholder nitrilhydratase omdanner nitriler til de tilsvarende aminer. Således beskriver EP-A-0 188 316 en fremgangsmåte for fremstilling av nikotinamid som starter fra 3-cyanopyridin ved å bruke mikroorganismer av slekten Rhodococcus, Arthrobacter eller Microbacterium. En ulempe med denne prosessen er at disse mikroorganismer bare har lav aktivitet med henblikk på overføring av 3-cyanopyridin til nikotinamid.

EP-A-0 307 926 beskriver omdannelsen av 3-cyanopyridin til nikotinamid ved hjelp av mikroorganismer av arten Rhodococcus rhodochrous J1. For at disse mikroorganismer skal katalysere den ønskede konversjon må de induseres. En videre ulempe med denne prosess er at Rhodococcus rhodochrous J1 er rødfarget og at en misfarging av produktet derfor oppstår. I tillegg har denne mikroorganismen lav varmestabilitet og hemmes for eksempel av substratet 3-cyanopyridin.

En videre fremgangsmåte for fremstilling av nikotinamid som begynner fra 3-cyanopyridin ved hjelp av mikroorganismer av arten Rhodococcus rhodochrous J1 er beskrevet i EP-A-0 362 829. For å øke den spesifikke aktivitet til mikroorganismene som inneholder nitril hydratase, ble urea eller et ureaderivat tilsatt til dyrkningsmediet som en induserende forbindelse. Som i prosessen som er beskrevet før blir produktet også i denne prosess misfarget.

US patent nr. 5 200 331 beskriver en fremgangsmåte for biotransformasjon av et nitril til et amid ved bruk av mikroorganismer av familiene Rhodococcus sp. A32 med deponeringsbetegnelse FERM BP-1046 og Rhodococcus sp A33 med deponeringsbetegnelse FERM BP-1047.

I tillegg beskriver WO 95/17 505 en fremgangsmåte for fremstilling av aromatiske amider som starter fra de tilsvarende nitriler ved hjelp av mikroorganismer av arten Rhodococcus rhodochrous M33. En ulempe ved denne prosess er rødfargen til Rhodococcus rhodochrous M33 og også den høye KM-verdi for substratet 3-cyanopyridin.

Formålet ved den foreliggende oppfinnelse var å eliminere disse ulemper og å gjøre tilgjengelig en fremgangsmåte for fremstilling av amider der de tilsvarende amider kan isoleres med godt utbytte og høy renhetsgrad.

Dette formål blir oppnådd ved hjelp av foreliggende oppfinnelse som i ett aspekt dekker mikroorganismer fra slekten Amycolatopsis eller Actinomadura, kjennetegnet ved at de er i stand til å omdanne et nitril til et amid, og enzymekstrakter av disse.

I et annet aspekt av oppfinnelsen omfattes mikroorganismer, av artene Rhodococcus GF 270 og GF 376, som deponert under deponeringsnummeme DSM 12211 og DSM 12175, og deres varianter og mutanter med ekvivalente egenskaper, kjennetegnet ved at de er i stand til å omdanne et nitril til et amid, og enzymekstrakter fra disse.

Formålet ved foreliggende oppfinnelse blir og oppnådd ved hjelp av fremgangsmåten for fremstilling av amider, kjennetegnet ved at et nitril, som substrat, blir omdannet til det tilsvarende amid ved hjelp av mikroorganismene i følge et av kravene 1 til 3, ved bruk av et enzymekstrakt fra disse mikroorganismer eller ved hjelp av enzymet i følge krav 4.

I følge oppfinnelsen blir fremgangsmåten utført ved å omdanne et nitril som substrat til det tilsvarende amid ved hjelp av mikroorganismer av slekten Actinomadura, Amycolatopsis eller Rhodococcus, ved å bruke et enzymekstrakt fra disse mikroorganismene eller ved hjelp av renset nitrilhydratase fra mikroorganismer fra slekten Amycolatopsis eller Actinomadura.

Nitrilene benyttet for biotransformasjonen, slik som for eksempel 3-cyanopyridin, er kommersielt tilgjengelige forbindelser.

Mikroorganismene i følge oppfinnelsen har evne til å omdanne nitriler som substrater til de tilsvarende amider. Fortrinnsvis har disse mikroorganismene evnen til å vokse på nitriler eller amider som den eneste kilde for C og/eller N.

Mikroorganismene i følge oppfinnelsen kan fremskaffes ved hjelp av passende seleksjon, for eksempel fra jordprøver, søle eller avfallsvann ved hjelp av vanlige mikrobiologiske teknikker. Mest effektivt blir mikroorganismene utvalgt med hjelp med nitriler eller amider som de fortrinnsvis eneste kilder to C og N i nærvær av koboltioner. Nitriler og amider som passer for seleksjon er spesielt nitrilene som også benyttes som substrater i den senere biotransformasjon og de tilsvarende amider som kan fremskaffes fra disse. Passende vekstmedier er på samme måte kjent til personen som er øvet i faget, for eksempel mediet beskrevet i tabell 1 som kan benyttes.

Vanligvis blir mikroorganismene dyrket på samme måte også før den relevante biotransformasjonen, der de ovenfor nevnte medier blir benyttet.

Som kjent i faget er en nitrilhydratase bare dannet når vekstmediet inneholder koboltioner som kofaktor. Passende "koboltforbindelser som produserer koboltioner" er salter med Co<2+> eller Co<*.> Eksempler på Co<2+> og Co<3+->salter er koboltklorider, koboltsulfater og koboltacetater. Mest hensiktsmessig er koboltforbindelsen som benyttes et Co<2*-> salt slik som for eksempel C0CI2. Vekst kan imidlertid også utføres i nærvær av vitamin B12 sammen med metallisk kobolt eller andre koboltforbindelser som produserer et koboltion in situ. Mest hensiktsmessig blir koboltforbindelsen benyttet i en mengde på fra 1 til 10 mg/l, fortrinnsvis fra 1 tii 3 mg/l.

Vanligvis blir dyrkning utført ved en temperatur fra 20 til 50 °C og ved en pH mellom pH 5 og pH 8, fortrinnsvis fra 30 til 45 °C og mellom pH 5.5 og pH 7.5.

Den relevante biotransformering kan utføres ved bruk av mikroorganismer fra slekten Actinomadura, Amycolatopsis, ved bruk av et enzymekstrakt fra disse mikroorganismer eller ved hjelp av renset nitrilhydratase fra disse mikroorganismer. Mest hensiktsmessig blir biotransformeringen utført ved bruk av mikroorganismer av slekten Actinomadura spadix, for eksempel i isolatene Actinomadura spadix E3733, Actinomadura spadix E3736, Actinomadura spadix 45A32, Actinomadura spadix 4501 eller Actinomadura spadix Cl 5. Biotransformeringen blir fortrinnsvis utført ved å bruke mikroorganismer som tilsvarer arten Amycolatopsis NE 31 og Amycolatopsis NA 40 eller deres funksjonelt likeverdige varianter og mutanter. Mikroorganismer som tilsvarer arten Amycolatopsis NA 40 er spesielt foretrukne. Mikroorganismer fra de nevnte arter ble deponert 1997.06.03 i Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH), Mascheroderweg 1b, D-38124 Brunswick under benevnelsene Amycolatopsis NE 31 og Amycolatopsis NA 40 i følge Budapest overenskomsten, og har deponeringsnumrene henholdsvis DSMZ 11616 og DSMZ 11617. Disse to mikroorganismer har blitt identifisert med slekten Amycolatopsis som ikke tidligere har blitt beskrevet i litteraturen.

Således dreier oppfinnelsen seg også om mikroorganismer av slekten Amycolatopsis eller Actinomadura som har evne til å overføre et amid til et nitril, spesielt mikroorganismer med benevnelsene Amycolatopsis NA 40 ( DSMZ 11617) og Amycolatopsis NE 31 (DSMZ 11616).

I tillegg har det blitt funnet at spesifikke mikroorganismer fra slekten Rhodococcus har bedre egenskaper for overføring av nitriler til amider enn Rhodococcus rhodochrous J1 som er beskrevet i EP-A-0 362 829. Disse mikroorganismer er Rhodococcus GF 674, Rhodococcus GF 578, Rhodococcus Gf 473, Rhodococcus GF 270 ( DSMZ 12211) og Rhodococcus GF376 (DSMZ 12175) eller deres funksjonelt likeverdige varianter og mutanter. Mikroorganismen DSMZ 12175 ble deponert på 15. mai 1998 og mikroorganismen DSMZ 12211 på 8. juni 1998 i Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH (Tysk samling av mikroorganismer og cellekulturer GmbH) ifølge Budapest overenskomsten. Rhodococcus stammene GF 270, GF 376, GF 473, GF 578 og GF 674 har blitt plassert ifølge identifikasjon til arter fra slekten Rhodococcus som foreløpig ikke er beskrevet i litteraturen. Således dreier oppfinnelsen seg om mikroorganismene Rhodococcus GF 270 og Rhodococcus GF 376. Også mikroorganismene Rhodococcus GF 473, Rhodococcus GF 578 og Rhodococcus GF674 er beskrevet.

I motsetning til mikroorganismene fra slekten Actinomadura eller Amycolatopsis blir mikroorganismene fra slekten Rhodococcus hensiktsmessig indusert før den relevante overføring. Passende induserende forbindelser er de som er beskrevet i EP-A-0 307 926, slik som for eksempel acetamid, butyramid, methacrylamid, propionamid, crotonamid og valeramid.

"Funksjonelt ekvivalente varianter og mutanter" blir forstått som mikroorganismer som er avledet fra de ovenfor nevnte kildeorganismer og som har i hovedsak de samme karakteristika og funksjoner som disse. Varianter og mutanter av denne type dannes ved tilfeldighet, for eksempel ved ultrafiolett stråling eller ved tilsetting av mutagene kjemikalier.

Identifikasjon av Amycolatopsis NA 40

Sukkerspektrum Menaquinoner (i %) Fettsyrer

Identifikasjon av Amycolatopsis NE 31

Sukkerspektrum Menaquinoner (i%) Fettsyrer

Forkortelser og forklaringer for identifikasjon

Sukkertyper i følge Lechevalier et al. 1971

Fettsyretyper i følge Kroppenstedt 1985 og 1992.

Identifikasjon av GF270, GF376, GF578, og GF 674

Identifikasjon av disse stammer blir basert på 5 karakteristika som er uavhengige av hverandre. 1. Morfologi og farge av koloniene: kortgrenete hyfer, som desintegrerer i stav-og sporelignede elementer.

Koloniene til GF 270 og GF 376 er lakserøde (RAL 3022) og koloniene til GF 578 og GF 674 er lys røde (RAL 3012).

2. Diaminosyrene i peptidoglykanet: meso-diaminopimelinsyre.

3. Mykolsyrer: Rhodococcus mykolsyrer: Bestemmelsene av den langkjedete mykolsyre ble utført ved hjelp av høytemperatur gasskromotografi. Eluerings-profilene til mykolsyrene fra GF 270 og GF 376 og de fra GF 473, GF 578 og GF 674 var identiske. Mykolsyrelengden til GF 270 og GF 376 var Cæ - C46 og lengden for GF 473, GF 578 og GF 674 var C40 - C48- Mykolsyremønstrene ble sammenlignet med mykolsyremønstrene i Rhodococcus stammer. GF 270 ble identifisert med en meget lav korrelasjonsfaktor (0.086) som del av Rhodococcus rhodochrous, det var ikke mulig å identifisere GF 376 med denne fremgangsmåte. De andre tre isolater GF 473, GF 578 og GF 674 ble identifisert med en meget lav korrelasjonsfaktor som deler av Rhodococcus ruber. 4. Fettsyremønster: uforgrenete, mettede og umettede fettsyrer inkluderende tuberkulostearinsyre. Fettsyremønsteret er diagnostisk for alle Rhodococcus slekter og de nært relaterte Mycobacterium, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella og noen Corynebakteriearter. Identifikasjon av artsnivået ble oppnådd ved kvalitative og kvantitative forskjeller i fettsyremønstrene hos GF 270, GF 376, GF 473, GF 578 og GF 674 med fettsyremønstrene til Rhodococcus arter. 5. Undersekvensene til 16S rDNA fra GF 270 og GF 376 var identiske (100%), selv om sammenligningen av disse med Rhodococcus stammene kun viste 99.1% likhet med den nærmest relaterte Rhodococcus rhodochrous. GF 473 og GF 578 var identiske i deres 16S rDNA sekvens (100%). GF 674 skiller seg fra GF 578 i bare et basepar utav 500 (99.8%). Alle tre isolater viser kun en fjern relasjon med Rhodococcus coprophilus (98.4).

Basert på kjemotaksiske og molekylærbiologiske resultater kan det konkluderes at det på den ene side GF 270 og GF 376 og på den andre side GF 473, GF 578 og GF 674 er stammer til to nye Rhodococcus arter.

GF 270 og GF 376 er nært beslektet med Rhodococcus rhodochrous i deres 16S rDNA (99.1%), mens GF 473, GF 578 og GF 674 bare er fjernt relatert til Rhodococcus coprophilus (98.4).

Enzymekstraktet kan fremskaffes ved profesjonelt vanlig knusing av mikroorganismer, slik som for eksempel ved disrupsjon ved hjelp av ultralyd, ved hjelp av den Fransk pressemetode eller ved hjelp av lysozymfremgangsmåten. Enzymekstraktet og selvfølgelig også de komplette mikroorganismeceller kan immobiliseres på et passende støttemateriale, vanligvis pakket inn i en polymer, for å utføre prossesen, eller være absorbert på et passende støttemateriale.

Enzymene ifølge oppfinnelsen med nitrilhydrataseaktivitet kan fremskaffes fra mikroorganismene ifølge oppfinnelsen, spesielt fra slekten Amycolatopsis og har evne til å omdanne et nitril til et amid, mer spesielt kan de fremskaffes fra Amycolatopsis NA 40 (DSMZ 11617).

Spesielt disse enzymene har de følgende egenskaper:

a) et pH optimum på pH 6.5 ± 1.0

b) et temperaturoptimum mellom 35 og 40 °C ved en pH på 7.0

c) en Kwverdi for substratet 3 - cyanopyridin på 41.7 mM ± 7.7 mM

(20 °C, 45 mM fosfatbuffer, pH 7.0)

spesielt har enzymene en

d) molekylvekt på 106 kDa, slik som for eksempel bestemt ved hjelp av

SDS-PAGE.

Nitriler kan generelt bli benyttet som substrater for biotransformasjon. Mest hensiktsmessig blir enten alifatiske nitriler med 1 til 10 karbonatomer, eventuelt substituert av for eksempel hydroksyl, amino, halogen eller karboksyl, eller substituerte eller ikke-substituerte aromatisk nitriler med 4 til 10 karbonatomer i den aromatiske ringstruktur benyttet. Alifatiske nitriler med 1 til 10 karbonatomer som kan benyttes er dinitriler, hydroksynitriler, aminonitriler slik som for eksempel n-oktan-nitril, cyanoeddiksyre, isokapronitril, n-valeronitril, adiponitril, glutaronitril, suksinonitril, sebakonitril, propionitril, krotononitril, akrylonitril, metakrylnonitril, n-butyronitril eller azelanitril. Aromatiske nitriler med 4 til 10 karbonatomer som kan benyttes er nitriler med den generelle formel der R<1> og R2 er et hydrogenatom, et halogenatom eller CM-akryl. F, Cl, Br eller I kan benyttes som halogenatom. Metyl, etyl, propyl, isopropyl, tert-propyl, butyl, isobutyl eller tert-butyl kan benyttes som Ci^-alkyl. Hensiktsmessige representanter for de aromatiske nitriler med den generell formel I eller II er 2-, 3-eller 4-cyanopyridin, benzonitril, fluoro-.kloro eller bromobenzonitril, slik som for eksempel o-, m- eller p-klorobenzonitril eller 2-kloro-3-cyanopyridin. 3- Cyanopyridin er fortrinnsvis benyttet som aromatisk nitril med 4-10 karbonatomer.

Biotransformasjonen er hensiktsmessig utført med tilsetning av substrat i en del eller kontinuerlig slik at substratkonsentrasjonen ikke overstiger 40 vekt%, fortrinnsvis 30 vekt%.

Prosessen blir hensiktsmessig utført med hvilende (ikke-voksende) celler.

Passende medier for biotransformasjonen er de som er vanlig i spesialistfeltet, slik som for eksempel lavmolekylvekstfosfat buffere, HEPES-buffere, sitratbuffere, borat- buffere, media i følge tabellene 1 til 3, eller modifiserte fonner av disse slik som for eksempel de som er beskrevet i eksempel 8 (1) eller TRIS/HCI buffere.

Biotransformasjonen blir hensiktsmessig utført ved en temperatur på fra 0 til 50 °C og en pH mellom 4.5 og pH 10, fortrinnsvis ved en temperatur fra 20 til 40 °C og ved en pH mellom 4.5 og pH 10.0.

I en spesielt foretrukket utførelse kan biotransformasjonen utføres i nærvær av C-M-atkoholer. C1-4- alkoholer som benyttes kan være metanol, etanol, propanol eller butanol. Metanol er fortrinnsvis benyttet.

Etter reaksjonen kan de tilsvarende amider deretter isoleres ved vanlige fremgangsmåter, slik som for eksempel ved krystallisering.

Eksempler:

Eksempel 1

Vekst av mikroorganismer av slekten Actinomadura eller Amycolatopsis

a) Ulike jordprøver ble inokulert med forskjellige nitriler eller amider som kilder for C og N i anrikningsmediet i følge tabell 1 og inkubert ved 37 °C eller 45 °C i

7 til 10 dager. Kulturene ble deretter overført til det samme mediet og igjen

dyrket ved 37°C i 7 til 10 dager. Hele prosessen ble gjentatt tre ganger. Kulturene ble deretter fortynnet og platet ut for å fremskaffe individuelle kolonier. Platene ble inkubert ved 37 °C i 5 dager. De ulike kolonier ble deretter analysert med henblikk på den ønskede aktivitet.

Amycolatopsis NA 40 (DSMZ 11617) og Amycolatopsis NE 31 (DSMZ 11616) ble isolert på denne måte og deretter dyrket i det optimaliserte medium (tabell 3) i 90-100 timer med omristing ved 37 °C . Adiponitril fungerte som en kilde for C og N for Amycolatopsis NE 31 (DSMZ 11616), Actinomadura spadix E3733 og Actinomadura spadix E3736, azelanitril fungerte som C og N kilde for Amycolatopsis NA 40 (DSMZ 11617) og Actinomadura spadix 45A32, n-oktan-nitril fungerte som C og N kilde for Actinomadura spadix 4501 og cyanoedikksyre fungerte som C og N kilde for Actinomadura spadix C15.

b) Amycolatopsis NA 40 ble dyrket i mediet i følge tabell 3. Dyrkingen ble utført i 2 eller 3 til 4 dager ved temperatur på 37 °C under aerobe betingelser i

subkulturer (4ml/rør) og i en "hovedkultur" (500 ml/flaske). Celleveksten ble målt turbidimetrisk ved 610 nm og tørrvekten av cellene ble regnet ut på følgende måte: vekt av de tørre celler i mg/ml = OD6ionm x 0.277.

Eksempel 2

Biotransformasjoner med mikroorganismer fra slektene Actinomadura eller Amycolatopsis

(1) For bestemmelse av nitrilhydrataseaktivitet ble en reaksjonsblanding (2 ml) som inneholdt 3-cyanopyridin (1.0 M, 1.0 ml), kaliumfosfatbuffer (pH 7.0,1 M, 0.5 ml) og 0.5 ml av cellesuspensjon ble inkubert ved 20 °C i 30 minutter med omrøring. Reaksjonen ble stoppet med tilsetning av 0.2 ml 3 N HCI. Etter rask sentrifugering ble nikotinamidet som var dannet bestemt ved hjelp av HPLC (Shimadzu SPD 6 A system med bruk av C18 søyle (Develosil ODS-HG-5, 4.6 x 250 cm), eluent: 10mM KH2PO4/H3PO4 (pH 2.8) / acetonitril 9:1 (v/v), strømningshastighet: 1 ml/minutt, absorpsjonen ble målt ved 230 nm). Den spesifikke aktivitet ble uttrykket som umol nikotinamid dannet per ml per minutt per ODeionm-

Reaksjonshastigheten til alifatiske nitriler i et anrikningsmedium (Tabell 1)med isolerte bakterier er sammenfattet i tabell 5, effektene av de induserende forbindelser og kofaktorer i basalmediet (tabell 2) er sammenfattet i tabell 4 og aktivitets-sammenligning av Amycolatopsis til Rhodococcus i basalmediet (tabell 2) er sammenslått i tabell 6. Resultatene fra tabell 4 viser at nitrilhydratase fra Amycolatopsis NA 40 er konstitutivt uttrykket, mens kofaktoren kobolt er nødvendig for aktivitet.

(2) Effekt av temperatur på vekst av NA 40

Subkulturer (2 ml) ble inkubert ved 37 °C i 2 dager i mediet i følge tabell 3, og deretter overført til risteflasker som inneholdt 20 ml medium i følge tabell 3. Dyrking ble utført ved 37,40,45, 50 og 55 °C i 3 til 4 dager med omristing. Celleveksten ble målt og nitrilhydrataseaktivitet ble bestemt ved 20 °C. Tabell 7 viser effekten av temperaturen på nitrilhydrataseaktivitet og på cellevekst.

(3) For bestemmelse av aktivitet av NA 40 med henblikk på et antall ulike substrater ble celler med en tørrvekt på 0.0388 mg inkubert i bufferen beskrevet over. Reaksjonen ble påbegynt ved tilsetning av passende substrat og inkubert ved 20°C med risting i 10 minutter. Reaksjonen ble stoppet med tilsetning av 0.2 ml av 2 N HCI, og reaksjonsblandingen ble raskt sentrifugert. Supematanten ble analysert ved hjelp av HPLC eller gasskromotografi. Tabell 8 viser analysebetingelsen for substratspesifisitet, og tabell 9 viser substratspesifisiteten til hvilende NA 40-celler med henblikk på ulike substrater. De henholdsvise analyserbetingelser er sammenfattet i tabell 8, og resultatene er sammenfattet i tabell 9.

(4) Temperaturoptimum og termal stabilitet i hvilende celler Reaksjonen ble utført i standard reaksjonsblandingen i 10 minutter. Temperaturoptimum var mellom 35 og 40 °C (fig.5). Cellene ble deretter inkubert i ulike temperaturer i 30 minutter og aktiviteten ble testet under standard reaksjonsbetingelser. Som man kan se fra figur 4 er varme-stabiliteten 40 °C.

(5) pH-optimum og pH-stabilitet i hvilende celler.

For dette formål ble reaksjonen utført i 10 minutter i standard reaksjonsblanding der kaliumfosfatbufferen hadde blitt byttet ut med ulike 0.1 M buffere. Som kan sees fra figur 6 var pH-optimum mellom 4.5 og 10. Etter at celle-suspensjonen hadde blitt inkubert ved 20 °C i 30 minutter ved ulike pH-verdier ble cellene sentrifugert. Cellene ble deretter vasket og resuspendert i 0.1 M kaliumfosfatbuffer pH 7.0. Reaksjonen ble utført i 10 minutter ved tilsetning av 3 - cyanopyridin under standardbetingelser. Enzymet var stabilt mellom pH 4.5 og pH 10.0 (fig. 7). (6) Akkumulering av nikotinamid fra 3-cyanopyridin ved hjelp av NA 40 Reaksjonen ble utført i en reaksjonsblanding (30 ml) som omfattet 500mM 3-cyanopyridin, 40 mM kaliumfosfatbuffer ( pH 7.0) og hvilende celler (tørr vekt 2.3mg). Under reaksjonen ble 3-cyanopyridin (500mM) tilsatt 7 ganger så raskt som det ble brukt opp. På denne måte ble 4.0 M 3-cyanopyridin tilsatt i løpet av 15 timer og 3.89 M (475 g/l) nikotinamid ble dannet, noe som tilsvarer utbytte på 97.3 %. Nikotinsyre ble ikke dannet.

Eksempel 3

Identifikasjon av mikroorganismer fra slekten Amycolatopsis

De følgende 5 kjemotaksonomiske markører støttet identifikasjonen:

1. Diagnostisk aminosyre i peptidoglykanet: mesodiaminopimelinsyre

2. Diagnostiske sukkere: arabinose og galaktose

3. Mykolsyre: mykolsyre var fraværende

4. Menaquinoner: MK-9 (H4)

5. Fettsyremønster: Iso/anteisoforgrenete og 2-hydroksyfettsyrer, små mengder av 10- metylforgrenete fettsyrer ble også påvist. Dette fettsyremønsteret ble funnet i alle representanter fra genus Amycolatopsis (fettsyremønster 3 f)-

Kombinajon av disse kjemiske egenskaper er diagnostisk for alle arter fra slekten Amycolatopsis.

Fettsyreresultatene fra de to kulturer ble sammenlignet med hjelp av hoved-komponentanalyser ved å bruke innføringer i fettsyredatabasen. Ved å bruke denne fremgangsmåten var det mulig å plassere både NE 31 og NA 40 til slekten Amycolatopsis, men en identifikasjon av arten var imidlertid ikke mulig, siden korrelasjonsfaktoren var for liten. Sammenligningen av fettsyremønstrene til begge stammer viste imidlertid at de er to stammer av ulike typer.

Resultatet ble bekreftet av resultatene fra analysene av 16 S rDNA sekvensen. Her ble også lokalisasjonen til genus Amycolatopsis foretatt, men ikke til noen av de Amycolatopsis arter som er beskrevet. I denne fremgangsmåte ble sekvensen til 16 S rDNA bestemt ved hjelp av direkte sekvensering av det PCR-amplifiserte 16 S rDNA-gen. Den diagnostiske del av 16 S rDNA-sekvensen ble sammenlignet med sekvensene til type arter fra slekten Amycolatopsis og relaterte mikrober. Resultatet viste at stammen hører til slekten Amycolatopsis. Den høyeste overensstemmelse ble funnet med Amycolatopsis metanolika med 96.9% (NA 40) og 96.1% (NE 31). Mellom dem viste de to isolatene overenstemmelse i sekvens på 99.0%. Våre studier på representanter av slekten Amycolatopsis har vist at korrelasjonsfaktoren må være høyere enn 99.5% for en god identifikasjon av arter. Siden verdien 96.9 % er klart under 99.5 % kan det antas av dette at de to isolatene ikke var representanter for noen kjente Amycolatopsis arter.

Basert på de foreliggende resultater var det ikke mulig å plassere isolatene i noen av de kjente Amycolatopsis artene. Vi antar fra dette at NA 40 og NE 31 representerer to nye tidligere ikke bekrevne arter fra slekten Amycolatopsis.

Identifikasjonskaraterisktika av mikroorganismer fra slekten Amycolatopsis

Farge på luftmycelium

Farge på substratmycelium

Farge på diffundert pigment

Sukkerspektrum

Menaquinoner (i %) Fosfolipider

Fettsyrer

Eksempel 4

Rensing av nitrilhydratase fra mikroorganismestamme NA 40

Stammen ble dyrket ved 37 °C i 3 dager i mediet i følge tabell 3. Cellene fra en 2 liters kultur ble oppsamlet ved hjelp av sentrifugering og deretter resuspendert i 0.85 % styrke NaCI-løsning. Cellene ble deretter overført til 0.1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7.0) som inneholdt 44 mM n-smørsyre og behandlet med ultralyd. Celleekstraktene ble sentrifugert og cellefragmentene ble fjernet. Dette ekstrakt ble benyttet for rensing av enzymet.

Under hele renseprosedyren var kaliumfosfatbuffer (pH 7.0) som inneholdt 44 mM n-smørsyre benyttet. Som kan sees i tabell 10 ble enzymet renset til homogenitet i tre trinn. 1 enhet: mende av enzym som katalyserer dannelsen av en umol nikotinamid/minutt ved 20 °C.

Eksempel 5

Karakterisering av nitrilhydratase

(1) Bestemmelse av molekylvekt, sub-enhetstruktur og innhold av koboltion.

Molekylvekt ble bestemt å være 106 kDa ved hjelp av kromatografi på en TSK gelsøyle G 3000 SW (0.75 x 60 cm) ved hjelp av 0.1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7.0) inneholdende 0.2 M KCI og 44 mM n - smørsyre. Det ble bestemt at enzymet består av to ulike subenheter, alfa og beta, som hadde molekylvekt verdier som ble bestemt som å være henholdsvis 30 000 og 26 000. Figur 1 viser bestemmelse av molekylvekt ved kromatografi på TSK gel G3000 SW. Figur 2 viser bestemmelse av molekylvekt ved hjelp av SDS - PAGE Figur 3 viser absorpsjonsspektrum av det rensete enzym. En bred absorpsjon på 300 - 400 nm ble observert.

(2) Substratspesifisitet av renset enzym.

Substratspesifisiteten ble bestemt på samme måte som i eksempel 2 (1). Resultatene blir sammenfattet i tabell 11.

1.7 enheter av et enzym ble tilsatt reaksjonblandingen (2.0ml). Reaksjonens blanding inneholdt de respektive substrater i 45 mM fosfatbuffer (pH 7.0).

(3) Bestemmelse av KM-verdien

KM-verdien ble bestemt til å være 41.7 mM for 3-cyanopyridin og å være 3.7 mM for akrylonitril ved hjelp av Lineweaver - Burk diagrammet. Sammenlignet med Rhodococcus rhodochrous J1, som hadde en KM relativ til 3 - cyanopyridin på 200 mM er verdien for NA 40 signifikant lavere. Dette er en av de store fordeler med NA 40.

(4) Varmestabilitet og temperaturoptimum.

Det rensete enzym ble inkubert i 30 minutter ved pH 7.0 ved ulike temperaturer, og overføringer av 3 - cyanopyridin til nikotinamid ble deretter målt ved 20 °C i ett minutt. Enzymet ble inaktivert ved en temperatur på større enn 40 °C. Varmestabilteten var omtrent 40 °C som i hvilende celler, og temeraturoptimum var mellom 35 og 40 °C (figur 5).

(5) PH-Optimum og pH-stabilitet

For dette formål ble overføring av 3-cyanopyridin til nikotinamid utført ved 20 °C i en reaksjonsblanding (2.0.ml) som inneholdt ulike buffere (42.5mM),

1.71 enheter av renset enzym og 500mM 3-cyanopyridin. pH-optimum var ved omtrent pH 6.5 ± 1.0 (figur 8).

For bestemmelse av pH-stabilitet ble 4.2 enheter av renset enzym inkubert ved 20 °C i en time i ulike buffere (45mM). En del av den inkuberte løsning, 1.71 enheter, ble tilsatt til standardreaksjonsblandingen (sammenlign eksempel 2 (1)). Den gjenværende aktivitet ble bestemt. Enzymet var stabilt i et pH område fra pH 5 til 9. Resultatet er vist i figur 9.

(6) Inhibitorer

Effekter av ulike inhibitorer ble bestemt. Resultatene er sammenfattet i tabell 12.

Eksempel 6

Effekt av metanol på hvilende NA 40 celler

Reaksjonen ble utført i 10 minutter i nærver av 0 - 20 (v/v) metanol i følge tabell 13. Som vist i tabell 14 blir aktiviteten øket ved tilsetning av 5 - 15 % metanol.

Eksempel 7

Anrikning av mikroorganismer fra slekten Rhodococcus

Ulike jordprøver ble inokulert med cyanoeddiksyre som en kilde for C og N i anriket medium i følge tabell 1, og mikroorganismene Rhodococcus GF 270, GF 578, GF 473 og GF 376 ble isolert i følge eksempel 1.

Eksempel 8

Biotransformasjon ved bruk av mikroorganismer fra genus Rhodococcus (1) Varmestabilitet for mikroorganismene Rhodococcus GF 674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF270 og Rhodococcus GF376 sammenlignet med Rhodococcus rhodochrous J1.

For å bestemme varmestabilitet ble mikroorganismene beskrevet over dyrket i de følgende medier. Rhodococcus rhodochrous J1 ble dyrket i 72 timer i mediet beskrevet i EP-A 0 307 926. Mikroorganismene Rhodococcus GF 674, GF578, GF270 og GF376 ble dyrket i de følgende medier ved pH 7.0 i opp til 96 timer: Rhodococcus GF 674 i et medium som besto av 1.0 g/l gjærekstrakt, 5.0 g/l fruktose, 10.0 g/l maltekstrakt, 5.0 g/l acetamid, 2.0 g/l KH2P04, 0.5 g/l MgS04 x 7H20 og 10.0 mg CoCI2 x 6H20. Rhodococcus GF578 i et medium som inneholdt 1.0 g/l gjærekstrakt, 15.0 g/l fruktose, 10.0 g/l maltekstrakt, 25.0 g/l acetamid, 2.0 g/l KH2P04, 0.5 g/l MgS04 x 7H20 og 5.0 mg CoCI2 x 6H20. Rhodococcus GF270 i et medium som inneholdt 12.5 g/l gjærekstrakt, 5.0 g/l natriumsitrat, 7.5 g/l metakrylamid, 2.0 g/l KH2P04, 0.5 g/l MgS04 7H20 og 30.0 mg CoCI2 6H20. Rhodococcus GF376 i et medium som inneholdt 1.0 g/l gjærekstrakt, 10.0 g/l natriumsitrat, 15.0 g/l maltekstrakt, 7.5 g/l butyramid, 2.0 g/l KH2P04, 0.5 g/l MgS04 7H20 og 15.0 mg CoCI2 6H20.

De hvilende celler ble deretter inkubert i 15 minutter ved ulike temperaturer og den gjenværende aktivitet ble deretter bestemt under standard reaksjons-betingelse i følge eksempel 2(1).

Under dette arbeidet ble det funnet at Rhodococcus GF674 hadde en relativ aktivitet på nesten 100% ved en temperatur på 50 °C og fremdeles omtrent en aktivitet på 10 % ved 60 °C. Rhodococcus GF578 hadde på samme måten 100 % aktivitet ved 50 °C og en relativ aktivitet på 20 % ved 60 °C. Rhodococcus GF376 hadde 100 % relativ aktivitet opp til 50°C, 70 % relativ aktivitet ved 60 °C og nesten 5 % relativ aktivitet ved 70 °C. Rhodococcus GF270 hadde en relativ aktivitet på nesten 100 % opp til 60 °C og på samme måte fremdeles 5 % relativ aktivitet ved 70 °C. Sammenlignet med dette hadde Rhodococcus rhodochrous J1 100 % relativ aktivitet opp til 50 °C, 80 % ved 60 °C og ingen aktivitet lenger ved 70 °C.

I sammenfatning kan det derfor bli understreket at Rhodococcus GF270 og GF 376 hadde en bedre J1, og GF 270 hadde den beste varmestabilitet.

(2) pH-optimum av RhodococcussXammene.

Effekt av pH på nitrilhydrataseaktiviteten til fi/rødococcus-stammene GF674, GF578, GF 270 og GF 376 ble bestemt som beskrevet i eksempel 2 (5). pH-optimum til Rhodococcus GF674 var ved pH 7.5 - 9.5, til GF 578 ved pH 8

- 8.5, til GF 270 ved pH 6 - 7.0 og GF 376 hadde optimum ved pH 6-8.

(3) Substratspesifisitet til /7/rodococcus-stammene

Substratspesifisiteten er sammenfattet som relativ aktivitet i tabell 15.

(4) Nikotinamid akkumulering i ff/røc/ococcus-stammene

Analogt med eksempel 2 (6) ble RhodococcussXammene GF674, GF 578, GF 270 og GF 376 dyrket med 3 - cyanopyridin (omtrent 500 mM). I løpet av denne inkubering dannet Rhodococcus GF647 6 M nikotinamid i løpet av 25 timer, GF 578 dannet 5.5 M nikotinamid i løpet av 10 timer, GF 270 dannet omtrent 8.5 M nikotinamid innen 20 timer og GF 376 dannet 7.5 M nikotinamid innen 20 timer.

(5) Toleranse for 3-cyanopyridin på aktiviteten til flfiotfococcus-stammene For å teste toleranse for 3-cyanopyridin ble hvileceller inkubert i 15 minutter ved 20 °C med ulike konstentrasjoner av 3-cyanopyridin mellom 1 og 10

(vekt/volum), og cellene ble deretter fjernet ved sentrifugering. Etter å ha vasket cellene med 0.85 % NaCI ble den gjenværende aktivitet målt.

Toleranse for 3 - cyanopyridin som substrat ble analysert ved ulike substrat - konsentrasjoner. Det ble funnet at ved en substratkonsentrasjon på 2 %

(vekt/volum) falt nitrilhydrataseaktiviteten til Rhodococcus rhodochrous J1 med faktor på 1.4 , nitrilhydrataseaktiviteten til Rhodococcus GF674 ved en substratkonsentrasjon på 4 % (vekt/volum) falt med faktor 1.4 % , nitrilhydrataseaktiviteten til Rhodococcus GF578 var nesten konstant opp til en substratkonsentrasjon på 8 %, nitrilhydrataseaktiviteten til Rhodococcus GF270 ved en substratkonsentrasjone på 4% (vekt/volum) falt med faktoren 1.17 og nitrilhydrataseaktiviteten til Rhodococcus GF376 ved en substrat - konsentrasjon på 10 % (vekt/volum) falt med faktoren 1.25.

Sammenlignet med de andre Rhodococcus stammene viste Rhodococcus rhodochrous J1 den dårligste toleranse for 3-cyanopyridin.

Claims (11)

1. Mikroorganismer fra slekten Amycolatopsis eller Actinomadura, karakterisert ved at de er i stand til å omdanne et nitril til et amid, og enzymekstrakter av disse.

2. Mikroorganismer i følge krav 1, karakterisert ved artene Amycolatopsis NA 40 og Amycolatopsis NE 31, som deponert under deponeringsnummerne DSM 11617 og DSM 11616 og deres varianter og mutanter med ekvivalente egenskaper.

3. Mikroorganismer av artene Rhodococcus GF 270 og GF 376, som deponert under deponeringsnummerne DSM 12211 og DSM 12175, og deres varianter og mutanter med ekvivalente egenskaper, karakterisert ved at de er i stand til å omdanne et nitril til et amid, og enzymekstrakter fra disse.

4. Enzym med nitrilhydrataseaktivitet, karakterisert ved at det kan fremskaffes fra mikroorganismene i følge kravene 1 og 2.

5. Enzym i følge krav 4, karakterisert veda) et pH-optimum på pH 6.5 ± 1.0 b) et temperaturoptimum mellom 35 og 40 °C ved en pH på 7.0 c) en KM-verdi for substratet 3-cyanopyridin på 41.7 mM ± 7.7 mM.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av amider, karakterisert ved at et nitril, som substrat, blir omdannet til det tilsvarende amid ved hjelp av mikroorganismene i følge et av kravene 1 til 3, ved bruk av et enzymekstrakt fra disse mikroorganismer eller ved hjelp av enzymet i følge krav 4.

7. Framgangsmåte i følge krav 6, karakterisert ved at nrtrilet som benyttes er et eventuelt substituert alifatisk nitril med 1 til 10 karbonatomer.

8. Fremgangsmåte i følge krav 6, karakterisert ved at nitrilet som benyttes er et eventuelt substituert aromatisk nitril med 4 til 10 karbonatomer i det aromatiske ringsystem.

9. Fremgangsmåte i følge krav 8, karakterisert ved at det aromatiske nitrilet er valgt fra forbindelsene med den generelle formel der R<1> og R2 er et hydrogenatom, et halogenatom eller C-M-alkyl.

10. Fremgangsmåte i følge et av kravene 6 til 9, karakterisert ved at omdanningen blir utført ved en temperatur på fra 0 til 50 °C og ved en pH fra 4.5 til 10.

11. Fremgangsmåte i følge et av kravene 6 til 10, karakterisert ved at omdanningen blir utført ved hjelp av mikroorganismer av slekten Amycolatopsis som har benevnelsen NA 40 (DSMZ 11617) eller NE 31 (DSMZ 11616) eller ved å bruke deres varianter og mutanter med ekvivalente egenskaper.