DE60129547T2 - Verfahren zur kultivierung von mikroorganismen - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen kultivierter mikrobieller Zellen mit starker Nitrilhydratase-Enzymaktivität innerhalb einer kurzen Zeit und in einer hohen Ausbeute.
  • Technischer Hintergrund
  • In den vergangenen Jahren ist unter dem Gesichtspunkt des Energiesparens eine erneute Aktivität in Versuchen gesehen worden, Mikroorganismen oder deren Enzyme als Biokatalysatoren zur Herstellung von Substanzen zu benutzen. Nitrilhydratase ist als Enzym bekannt, welches Nitril hydratiert, um dadurch die entsprechenden Amide herzustellen. Insbesondere ist es als Katalysator nützlich, um Acrylamid aus Acrylonitril herzustellen.
  • Als Mikroorganismen mit Nitrilhydratase-Herstellungsfähigkeit sind beispielsweise Bakterien bekannt, die zum Genus Nocardia [siehe Japanische Patentoffenlegung (kokai) Nr. 54-129190 ], der Genus Rhodococcus [siehe Japanische Patentoffenlegung (kokai) Nr. 2-470 ], der Genus Rhizobium [siehe Japanische Patentoffenlegung (kokai) Nr. 5-236977 ], der Genus Klebsiera [siehe Japanische Patentoffenlegung (kokai) Nr. 5-30982 ], der Genus Aeromonas [siehe Japanische Patentoffenlegung (kokai) Nr. 5-30983 ], der Genus Agrobacterium [siehe Japanische Patentoffenlegung (kokai) Nr. 8-154691 ], der Genus Bacillus [siehe Japanische Patentoffenlegung (kokai) Nr. 8-187092 ], der Genus Pseudonocardia [siehe Japanische Patentoffenlegung (kokai) Nr. 8-56684 ] und ähnliche angehören. In jeder der oben erwähnten Veröffentlichungen ist ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen, die Nitrilhydratase-Aktivität herstellen, beschrieben.
  • Des Weiteren ist im Hinblick auf die Verwendung einer Kohlenstoffquelle bei der Kultivierung in dem Abschnitt „Auswirkungen der Kohlenstoffquellen" in Applied Microbiology and Biotechnology (1991) 34: 783-788 beschrieben, dass „beim Herstellen der Nitrilhydratase unter Verwendung von R. rhodochrous J1 die geeignetste Kohlenstoffquelle 2 % Glucose" ist.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Keines der Verfahren, das in den oben erwähnten Publikationen beschrieben wurde, ist industriell als Verfahren zum Erhalt kultivierter mikrobieller Zellen mit Nitrilhydratase-Aktivität innerhalb einer kurzen Zeit und in einer hohen Ausbeute anwendbar.
  • Zum Zweck der Induktion des Enzyms werden Kobaltionen zur Kulturlösung nach dem Verfahren hinzugegeben, welches in der Japanischen Patentanmeldung Offenlegungsschrift (kokai) Nr. 2-470 beschrieben, obwohl es durch die Verwendung einer derartigen Kobalt-Ionen-Konzentration schwierig ist, immer eine stabile Gewinnung kultivierter mikrobieller Zellen mit Nitrilhydratase-Enzymaktivität innerhalb einer kurzen Dauer und in hoher Ausbeute zu bewirken. Des Weiteren verursacht die Zugabe einer großen Menge an Kobaltionen zum Medium eine merkbare Wachstumsinhibition und im Gegensatz dazu ist es nicht möglich, kultivierte Mikrobenzellen mit Nitrildydratase-Aktivität innerhalb einer kurzen Zeit und in hoher Ausbeute zu erhalten.
  • Um zusätzlich kultivierte Mikrobenzellen mit Nitrilhydratase-Aktivität in einer kurzen Zeit und in hoher Ausbeute zu bekommen, werden Glucose oder Sucrose als Kohlenstoffquelle als bevorzugt angesehen, und die Verwendung von Ketosen, wie Fructose und Zuckeralkoholen, wie Mannitol, ist konventionell als wissenschaftlich unmöglich angesehen worden.
  • Das Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein Verfahren zum Erhalt von kultivierten mikrobiellen Zellen mit Nitrilhydratase-Aktivität innerhalb kurzer Zeit und in einer hohen Ausbeute bereitzustellen, welches die obigen Probleme löst.
  • Die vorstelligen Erfinder haben intensive Studien über die Kulturbedingungen durchgeführt, um industriell innerhalb einer kurzen Zeit und in einer hohen Ausbeute mikrobielle Zellen zu gewinnen, die Nitrilhydratase-Aktivität haben . Als Ergebnis haben die Erfinder es möglich gefunden, stark aktive mikrobielle Zellen zu erhalten, sowie die Wachstumsinhibierung selbst in Gegenwart einer großen Menge an Kobaltionen in Kulturlösung zu reduzieren, indem das Vorhandensein einer Ketose, z. B. Fructose und/oder eines Zuckeralkohols, z. B. Mannitol in der Kulturlösung ermöglicht wird. Auf diese Weise ist die vorliegende Erfindung erfüllt worden.
  • Das bedeutet, dass die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kultivierung eines Mikroorganismus mit Nitrilhydratase-Produktionsfähigkeit in einem Mediumsubstrat ist, welches einen Zuckeralkohol und/oder eine Ketose und ein Kobaltion enthält. Hier beträgt die Kobaltionen-Konzentration vorzugsweise 15 mg/l oder mehr bezüglich CoCl2. Zusätzlich wird der Zuckeralkohol vorzugsweise durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt:
    Figure 00030001
    worin n eine ganze Zahl von 2 bis 4 darstellt.
  • Des Weiteren wird die Ketose durch die folgende allgemeine Formel (II) dargestellt:
    Figure 00040001
    worin n 3 darstellt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden ein Zuckeralkohol und/oder eine Ketose als Kohlenstoffquelle verwendet. Jedoch ist nicht konventionell bekannt, dass das Vorhandensein dieser Zuckerverbindung in einer Kulturlösung die Reduktion der Wachstumsinhibierung ermöglicht, welche den Kobaltionen zuzuschreiben ist.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend im Detail beschrieben.
  • Die Mikroorganismen von Interesse gemäß der vorliegenden Erfidnung sind nicht besonders beschränkt, sofern sie Nitrilhydratase-Produktionsfähigkeit besitzen. Genauer gesagt schließen bevorzugte Beispiele der Mikroorganismen ein Nocardia sp. N-775, beschrieben in der Japanischen Untersuchten Patentveröffentlichung (kokoku) Nr. 6-17918 , Rhodococcus rhodochrous J-1, beschrieben in der geprüften Japanischen Patentveröffentlichung (kokoku) Nr. 06-55148 , Klebsiella sp. MCI2609, beschrieben in der geprüften Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 05-30982 , Aeromonas sp. MCI2614, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 05-30983 , Citrobacter freundii MCI2615, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 05-30984 , Agrobacterium rhizogenes IAM13570 und Agrobacterium tumefaciens, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 05-103681 , Xanthobacter flavas JCM1204, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 05-161495 , Erwinia nigrifluens MAFF03-01435, Enterobacter sp. MCI2707, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 05-236975 , Streptomyces sp. MCI2691, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 05-236976 , Rhizobium sp. MCI2610, Rhizobium sp. MCI2643, Rhizobium loti IAM13588, Rhizobium legminosarum IAM12609 und Rhizobium merioti IAM12611, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 05-236977 , Candida guilliermondii NH-2, Pantoea agglomerans NH-3 und Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae NH-26T2, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 05-15384 , Agrobacterium radiobacter SC-C15-1, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 06-14786 , Bacillus smithii SC-J05-1, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 07-25494 , Pseudonocardia thermophila ATCC19285, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 08-56684 , und Pseudonocardia thermophila JCM3095, beschrieben in der Japanischen Patentoffenlegung (kokai) Nr. 09-275978 .
  • Zusätzlich schließen die Mikroorganismen von Interesse gemäß der vorliegenden Erfindung Transformanten ein, die irgendeinen Wirt haben, wobei das Nitrilhydratasegen aus den obigen Mikroorganismen kloniert wurde, exprimiert wird.
  • Bevorzugte Beispiele hierfür schließen MT-10822-Bakterienstamm (FERM BP-5785), beschrieben in USP 5,807,730 ein, worin Escherichia coli als typischer Wirt verwendet werden.
  • Als Mediumsubstrat schließen Beispiele der Kohlenstoffquelle ein Zuckeralkohol ein, welche durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird und/oder eine Ketose, die durch die allgemeine Formel (II) dargestellt wird. Genauer gesagt, sind Fructose, Mannitol und Sorbitol bevorzugt.
  • Diese Kohlenstoffquellen können auch in einer geeigneten Kombination daraus verwendet werden.
    Figure 00060001
    (worin n eine ganze Zahl von 2 bis 4 darstellt)
    Figure 00060002
    (worin n 3 darstellt).
  • Irgendeine Zufuhrquelle für Kobaltionen kann verwendet werden, sofern es ein divalentes oder trivalentes Kobaltsalz ist. Beispiele hierfür schließen Kobaltchlorid, Kobaltsulfat, Kobaltacetat, Kobaltbromid und Kobaltborat ein. Zusätzlich können Vitamin B12 oder ähnliche als Kohlenstoffquelle dienen. Des Weiteren beträgt die Kobaltionenkonzentration bezüglich CoCl2 15 mg/l oder mehr, vorzugsweise 15 bis 300 mg/l.
  • Die Stickstoffquelle, wie Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, und Ammoniumnitrat; organische Nährstoffquellen, wie Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Peptone, und Sojabohnenhydrolysat; und anorganische Salze, wie beispielsweise Phosphate, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze, Eisensalze, Kobaltsalze und andere Spurmineralsalze werden zur Herstellung des Mediums ausgewählt. Falls nötig, kann ein Enzyminduktor, wie beispielsweise Harnstoff oder dessen Derivate hinzugefügt werden.
  • Des Weiteren kann, falls notwendig, die Kohlenstoffquelle, die Kobaltionen oder ähnliche in Portionen während der Kultivierung hinzugegeben werden.
  • Während der Kultivierung wird der pH-Wert normal bei 5 bis 10 gehalten, vorzugsweise bei 7 bis 9. Die Kultivierungstemperatur beträgt normalerweise 25 bis 50°C, vorzugsweise 30 bis 40°C, und die Kultivierung wird aerob für 1 bis 3 Tage durchgeführt.
  • Beste Art der Durchführung der Erfindung
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung genauer durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.
  • [Beispiel 1]
  • (1) Kultivierung von Mikroben
  • ➀ Vorkulturbedingungen:
  • (Medienzusammensetzung)
    • Fructose 2 % (w/v), Polypepton 5 % (w/v) (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), Hefeextrakt 0,3 % (w/v) (Oriental Yeast Co., Ltd.), KH2PO4 0,1 % (w/v), K2HPO4 0,1 % (w/v), MgSO4·7H2O 0,1 % (w/v), pH 7
  • (Kulturverfahren)
  • 100 ml des Mediums wurden in einen 500 ml Erlenmeyerkolben geschüttet und der Kolben wurde mit einem Baumwollstopfen versiegelt. Das Medium wurde in einem Autoclav für 20 min. bei 121°C sterilisiert. Dann wurde der Rhodococcus rhodochus J-1-Stamm (FERM BP-1478) inokuliert und das Gemisch wurde einer Schüttelkultivierung für 48 Stunden bei 30°C unterworfen.
  • ➁ Hauptkulturbedingungen
  • (Mediumzusammensetzung)
    • Ausgangsmedium: Hefeextrakt 0,2 % (w/v), KH2PO4 0,1 % (w/v), K2HPO4 0,1 % (w/v), MgSO4·7H2O 0,1 % (w/v), CoCl2·6H2O 0,002 % (w/v), Ammoniumsulfat 0,025 % (w/v), Fructose 2 % (w/v), Harnstoff 2 % (w/v), Ethanol 0,4 % (v/v), Pluronic L61 0,1 % (w/v) (Asahi Denka Kogyo K.K.), pH 7
    • Medium nach Zugabe: Fructose 20 % (w/v), Ethanol 5 % (v/v), Ammoniumsulfat 6 % (w/v), pH 6,5
  • (Kulturverfahren)
  • Zwei Liter des Ausgangsmediums wurden in einen 3-Liter Mini-Fass-Fermenter (Takasugi Seisakusho) gegeben und mit einem Autoclav für 20 min. bei 121°C sterilisiert. Jedoch wurden daneben die Fructose, Ethanol und Harnstoff aseptisch filtriert (unter Verwendung eines 0,45-Mikrometer Filterpapiers, das von Advantec Toyo Kaisha, Ltd. hergestellt wird) und dann zum Medium gegeben. Nach Beendigung der oben erwähnten Vorkultur wurden 20 ml der vorkultivierten Lösung hierin inokuliert und das erhaltene Medium wurde für 44 Stunden bei 30°C unter den Bedingungen eines Innentankdrucks von 0,098 MPa, einer Rührrate von 600 UpM, einer Luftflussmenge von 1 vvm und einem pH von 7 kultiviert.
  • Zusätzlich wurde von 20 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung das zusätzliche Nachmedium hinzugegeben, bei einer Fließrate von 20 ml/h, bis zum Ende der Kultivierung.
  • (2) Bestimmung der Nitrilhydratase-Aktivität
  • 0,1 ml der Kulturlösung und 4,90 ml 1/20 M Phosphatpufferlösung (pH 7,7) wurden gemischt und weitere 5 ml 1/20 M Phosphatpufferlösung (pH 7,7), enthaltend 5,0 % (w/v) Acrylonitril wurden zugegeben, und das Gemisch wurde dann für 10 Minuten bei 10°C umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurden die mikrobiellen Zellen abfiltriert und durch Zentrifugieren abgetrennt. Acrylamid in dem Überstand wurde durch Gaschromatographie (GC-14B hergestellt von Shimadzu Corporation) quantifiziert. Die Analyse wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Verwendung einer 1 m Glassäule gepackt mit Poropack PS (Säulenpackungsmaterial hergestellt von Waters Corporation); Säulentemperatur 230°C; unter Verwendung von FID bei 250°C.
  • Danach wurde eine Einheit Enzymaktivität in der oben erwähnten Aktivitätsbestimmung als die Umwandlung von 1 μmol Acrylonitril in Acrylamid in 1 Minute definiert. Bezüglich der Aktivität wurde eine Untersuchung pro Kulturlösung und pro mikrobieller Zelle durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. In der Tabelle wurden 100 als Wert für die Aktivität bei der Kultivierung in Gegenwart von 0,002 % (w/v) CoCl2·6H2O genommen, die Aktivitätswerte in den anderen Kulturbedingungen sind als relative Aktivitätswerte (%) angegeben.
  • [Beispiele 2 bis 5]
  • Die Beispiele 2 bis 5 wurden in gleicher Weise wie Beispiel 1 durchgeführt, außer der Verwendung von Hauptkulturmedium, zu dem die folgenden Konzentrationen an CoCl2·6H2O anstelle von 0,002 % (w/v) an CoCl2·6H2O gegeben wurden: 0,005 % (w/v) im Beispiel 2, 0,01 % (w/v) im Beispiel 3, 0,02 % (w/v) im Beispiel 4, und 0,03 % (w/v) im Beispiel 5. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • [Beispiele 6 und 7]
  • Die Beispiele 6 und 7 wurden in gleicher Weise wie Beispiel 3 durchgeführt, außer dass zur Verwendung sowohl von der Präkultur und der Hauptkulturmedien, in die Mannitol (Beispiel 6) oder Sorbitol (Beispiel 7) anstelle von Fructose gegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • [Vergleichsbeispiel 1]
  • Vergleichsbeispiel 1 wurde in gleicher Weise wie Beispiel 1, außer der Verwendung von Vorkultur- und Hauptkulturmedien, zu denen Glucose anstelle von Fructose gegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • [Vergleichsbeispiele 2 bis 5]
  • Die Vergleichsbeispiele 2 bis 5 wurden in gleicher Weise wie Vergleichsbeispiel 1 durchgeführt, außer dass Hauptkulturmedium verwendet wurde, zu dem die folgenden Konzentrationen an CoCl2·6H2O anstelle von 0,002 % (w/v) an CoCl2·6H2O gegeben wurden: 0,005 % (w/v) für das Vergleichsbeispiel 2, 0,01 % (w/v) für das Vergleichsbeispiel 3, 0,02 % (w/v) für das Vergleichsbeispiel 4, und 0,03 % (w/v) für das Vergleichsbeispiel 5. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • [Beispiel 8]
  • Beispiel 8 wurde in gleicher Weise wie Beispiel 1 durchgeführt, außer dass der Nocardia sp. N-775-Stamm (hinterlegt als N-755 unter der Zugangs-Nr. FERM BP-961) anstelle des Rhodococcus rhodochrous J-l-Stamms verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • [Beispiel 9]
  • Beispiel 9 wurde in gleicher Weise wie Beispiel 8 durchgeführt, außer der Verwendung von Hauptkulturmedium, zu dem 0,01 % (w/v) an CoCl2·6H2O anstelle von 0,002 % (w/v) an CoCl2·6H2O gegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • [Beispiele 10 und 11]
  • Beispiele 10 und 11 wurden in gleicher Weise wie Beispiel 9 durchgeführt, außer der Verwendung von Vorkultur- und Hauptkulturmedien, zu denen Mannitol (Beispiel 10) oder Sorbitol (Beispiel 11) anstelle von Fructose gegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • [Vergleichsbeispiel 6]
  • Vergleichsbeispiel 6 wurde in gleicher Weise wie Beispiel 8 durchgeführt, außer der Verwendung von Vorkultur- und Hauptkulturmedien, zu denen Glucose anstelle von Fructose gegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • [Vergleichsbeispiel 7]
  • Vergleichsbeispiel 7 wurde in gleicher Weise wie Vergleichsbeispiel 6 durchgeführt, außer der Verwendung von Hauptkulturmedium, zu dem 0,01 % (w/v) an CoCl2·6H2O anstelle von 0,002 % (w/v) CoCl2·6H2O gegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 1
    Zucker CoCl2-Konzentration Aktivität pro mikrobieller Zelle Aktivität pro Kulturlösung
    Beispiel 1 Fru 0,002 100 100
    Beispiel 2 Fru 0,005 215 195
    Beispiel 3 Fru 0,01 252 229
    Beispiel 4 Fru 0,02 259 230
    Beispiel 5 Fru 0,03 259 231
    Beispiel 6 Mannitol 0,01 250 252
    Beispiel 7 Sorbitol 0,01 259 247
    Vergleichsbeispiel 1 Glc 0,002 100 18
    Vergleichsbeispiel 2 Glc 0,005 100 16
    Vergleichsbeispiel 3 Glc 0,01 48 6
    Vergleichsbeispiel 4 Glc 0,02 37 3
    Vergleichsbeispiel 5 Glc 0,03 7 0,2
    Tabelle 2
    Zucker CoCl2-Konzentration Aktivität pro mikrobieller Zelle Aktivität pro Kulturlösung
    Beispiel 8 Fru 0,002 100 100
    Beispiel 9 Fru 0,01 207 188
    Beispiel 10 Mannitol 0,01 217 197
    Beispiel 11 Sorbitol 0,01 230 209
    Vergleichsbeispiel 6 Glc 0,002 83 15
    Vergleichsbeispiel 7 Glc 0,01 55 10
  • [Beispiel 12]
  • (1) Kultivierung von Mikroben
  • ➀ Vorkulturbedingungen
  • (Mediumzusammensetzung)
    • Polypepton 1 % (w/v), Hefeextrakt 0,5 % (w/v), NaCl 0,5 % (w/v), Ampicillin·Na 100 μg/ml, pH 7 (LB Medium)
  • (Kulturmethode)
  • 100 ml des Mediums wurden in einen 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben, und der Kolben wurde mit einem Baumwollstopfen versiegelt. Das Medium wurde durch einen Autoclaven für 20 min. bei 121°C sterilisiert. Dann wurde der MT-10822-Stamm (FERM BP-5785) hierin inokuliert und das Gemisch wurde einer Schüttelkultivierung für 6 Stunden bei 37°C unterworfen.
  • ➁ Hauptkulturbedingungen
  • (Mediumzusammensetzung)
    • Hefeextrakt 0,5 % (w/v), Polypepton 2 % (w/v), NaCl 0,06 % (w/v), KCl 0,02 % (w/v), MgCl2·6H2O 0,2 % (w/v), CoCl2·6H2O 0,002 % (w/v), MgSO4·7H2O 0,243 % (w/v), Fructose 4 % (w/v), Pluronic L61 0,02 % (w/v), pH 7
  • (Kulturverfahren)
  • Zwei Liter des Ausgangsmediums wurden in einen 3-Liter Mini-Fass-Fermenter gegeben und in einem Autoclav für 20 Minuten bei 121°C sterilisiert. Jedoch wurden daneben Fructose und MgSO4·7H2O aseptisch filtriert (unter Verwendung eines 0,45-Mikrometer Filterpapiers, das von Advantec Toyo Kaisha, Ltd. hergestellt wird) und dann zum Medium gegeben. Nach Beendigung der oben erwähnten Vorkultur wurden 20 ml der kultivierten Lösung inokuliert und das erhaltene Medium wurde für 12 Stunden bei 37°C unter den Bedingungen eines Innentankdrucks von 0,025 MPa, einer Rührrate von 800 UpM und einer Luftflussmenge von 1 vvm und einem pH-Wert von 7 kultiviert.
  • (2) Bestimmung der Nitrilhydrataseaktivität
  • Die Bestimmung der Nitrilhydrataseaktivität wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (2) durchgeführt. Bezogen auf die Aktivität wurde eine Untersuchung pro Kulturlösung und pro mikrobieller Zelle durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. In der Tabelle sind die Aktivitätswerte unter den anderen Kulturbedingungen als relative Aktivitätswerte (%) angegeben, indem 100 als Wert für die Aktivität unter der Kultivierung in Gegenwart von 0,002 % (w/v) an CoCl2·6H2O genommen wurde.
  • [Beispiel 13]
  • Beispiel 13 wurde in gleicher Weise wie Beispiel 12 durchgeführt, außer der Verwendung von Hauptkulturmedium, zu dem 0,01 % (w/v) an CoCl2·6H2O anstelle von 0,002 % (w/v) an CoCl2·6H2O gegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • [Beispiele 14 und 15]
  • Die Beispiele 14 und 15 wurden in gleicher Weise wie Beispiel 13 durchgeführt, außer der Verwendung von Hauptkulturmedium, zu dem Mannitol (Beispiel 14) oder Sorbitol (Beispiel 15) anstelle von Fructose gegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • [Vergleichsbeispiel 8]
  • Vergleichsbeispiel 8 wurde in gleicher Weise wie Beispiel 12 durchgeführt, außer der Verwendung von Hauptkulturmedium, zu dem Glucose anstelle von Fructose gegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • [Vergleichsbeispiel 9]
  • Vergleichsbeispiel 9 wurde in gleicher Weise wie Vergleichsbeispiel 8 durchgeführt, außer der Verwendung von Hauptkulturmedium, zu dem 0,01 % (w/v) CoCl2·6H2O anstelle von 0,002 % (w/v) an CoCl2·6H2O gegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
    Zucker CoCl2-Konzentration Aktivität pro mikrobieller Zelle Aktivität pro Kulturlösung
    Beispiel 12 Fru 0,002 100 100
    Beispiel 13 Fru 0,01 342 363
    Beispiel 14 Mannitol 0,01 528 113
    Beispiel 15 Sorbitol 0,01 436 363
    Vergleichsbeispiel 8 Glc 0,002 87 87
    Vergleichsbeispiel 9 Glc 0,01 38 35
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Ketose, wie Fructose, Zuckeralkohole, beispielsweise Mannitol, können die Wachstumsinhibierung reduzieren, die durch Kobaltionen bei der Kultivierung eines Mikroorganismus mit Nitrilhydrataseaktivität verursacht wird. Als Ergebnis ist es möglich, mikrobielle Zellen mit Nitrilhydratase-Enzymaktivität innerhalb einer kurzen Zeit und in hoher Ausbeute zu gewinnen.

Claims (4)

  1. Verfahren zum Kultivieren eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit, Nitrilhydratase herzustellen, in einem Mediumsubstrat, das einen Zuckeralkohol und/oder Ketose sowie ein Kobaltion enthält, wobei die Konzentration an Kobaltion 15 mg/l oder mehr, bezogen auf CoCl2, beträgt.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Zuckeralkohol durch die allgemeine Formel (I) dargestellt wird:
    Figure 00160001
    wobei n eine ganze Zahl von 2 bis 4 darstellt.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Ketose durch die allgemeine Formel (II) dargestellt wird:
    Figure 00160002
    wobei n 3 darstellt.
  4. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Konzentration an Kobaltion 20 mg/l oder mehr, bezogen auf CoCl2, beträgt.
DE60129547T 2000-03-21 2001-03-21 Verfahren zur kultivierung von mikroorganismen Expired - Lifetime DE60129547T2 (de)

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