EA006444B1

EA006444B1 - Микроорганизмы amycolatopsis, способные превращать нитрил в амид, фермент с нитрилгидратазной активностью, полученный из указанных микроорганизмов, и способы их использования

Info

Publication number: EA006444B1
Application number: EA200000135A
Authority: EA
Inventors: Карен Трейси Робинс; Тору Нагасава
Original assignee: Лонца Аг
Priority date: 1997-07-22
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2005-12-29
Also published as: DK1002122T3; NO996401D0; EA200000135A1; HU226274B1; US20030148478A1; MX215285B; EA009075B1; CN1108372C; SK192000A3; SK283395B6; AU8978398A; ATE234932T1; TR200000150T2; US20080050798A1; NO996401L; CN1269950C; WO1999005306A1; ES2190098T3; PL194729B1; US7556956B2

Abstract

В изобретении описан новый биотехнологический способ получения амидов из нитрилов. Этот способ основан на применении микроорганизмов рода Amycolatopsis.

Description

Настоящее изобретение относится к новым микроорганизмам рода Лтуео1а1ор515. а также к новому способу получения амидов с использованием этих микроорганизмов, соответственно с использованием экстракта ферментов этих микроорганизмов.

Для получения амидов, таких, как, например, амид никотиновой кислоты, который является важным для животных и людей витамином комплекса витаминов В, уже известны многочисленные биотехнологические способы. Широко известно, что содержащие нитрилгидратазу микроорганизмы превращают нитрилы в соответствующие амиды. Так, в ЕР-А 0188316 описан способ получения амида никотиновой кислоты из 3-цианпиридина с использованием микроорганизмов родов ККобососсик, Аг1НгоЬас1сг или микобактерий.

Недостатком этого способа является то, что эти микроорганизмы обладают лишь незначительной активностью в отношении превращения 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты.

В ЕР-А 0307926 описано превращение 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты с помощью микроорганизмов вида Кйобососсик гйобосйгоик И. Для того, чтобы эти микроорганизмы катализировали требуемое превращение, их необходимо индуцировать.

Еще одним недостатком этого способа является то, что Кйобососсик гйобосйгоик 11 имеет красную окраску и вследствие этого происходит окрашивание продукта. Кроме того, этот микроорганизм обладает лишь незначительной теплостойкостью и ингибируется, например, субстратом 3-цианпиридином.

Еще один способ получения амида никотиновой кислоты из 3-цианпиридина с помощью микроорганизмов вида Кйобососсик гйобосйгоик Л описан в ЕР-А 0362829. Для повышения удельной активности содержащих нитрилгидратазу микроорганизмов в среду для культивирования в качестве индуктора добавляют мочевину или производное мочевины. При использовании этого способа, равно как и способа, описанного выше, происходит окрашивание продукта.

Далее в \УО 95/17505 описан способ получения ароматических амидов из соответствующих нитрилов с помощью микроорганизмов вида Кйобососсик гйобосйгоик М33. Недостатком этого способа является красная окраска ККобососсик гйобосйгоик М33, а также высокое значение К_М для субстрата 3цианпиридина.

Задачей настоящего изобретения является устранение этих недостатков и разработка такого способа получения амидов, который обеспечивал бы получение соответствующих амидов с высоким выходом и высокой степенью чистоты.

Указанная задача решается с помощью новых микроорганизмов, а также с помощью способа с их использованием.

Суть способа по изобретению заключается в том, что используемый в качестве субстрата нитрил превращают в соответствующий амид с помощью микроорганизмов рода Атусо1а1ор818, с помощью экстракта ферментов этих микроорганизмов или с помощью очищенной нитрилгидратазы из микроорганизмов рода Атусо1аЮр818.

Применяемые для биотрансформации нитрилы, такие, как, например, 3-цианпиридин, представляют собой имеющиеся в продаже соединения.

Микроорганизмы по изобретению обладают способностью превращать используемые в качестве субстрата нитрилы в соответствующие амиды. Предпочтительно, чтобы эти микроорганизмы обладали способностью расти на средах, содержащих нитрилы или амиды в качестве единственных источников углерода и/или азота.

Микроорганизмы по изобретению получают путем соответствующего отбора, например, из образцов почвы, ила или сточных вод с помощью обычных микробиологических методов. Целесообразно осуществлять отбор микроорганизмов путем выращивания в среде, содержащей нитрилы или амиды предпочтительно в качестве единственных источников углерода и азота, в присутствии ионов кобальта. Пригодные для осуществления отбора нитрилы и амиды представляют собой прежде всего нитрилы, которые также применяют в качестве субстрата для последующей биотрансформации, и соответствующие получаемые из них амиды. Пригодные для роста среды также известны специалисту в данной области; например, может использоваться среда, представленная в табл. 1.

Как правило, микроорганизмы до осуществления собственно биотрансформации культивируют (выращивают) в одних и тех же условиях, при этом применяют указанные выше среды.

Как известно специалистам, нитрилгидратаза образуется только тогда, когда среда для роста содержит ионы кобальта в качестве кофактора. Пригодными кобальтовыми соединениями, образующими ионы кобальта являются соли, содержащие Со²⁺ или Со³⁺. Примерами содержащих Со²⁺ или Со³⁺ солей являются хлорид кобальта, сульфат кобальта и ацетат кобальта.

В качестве кобальтового соединения целесообразно применять соль, содержащую Со²⁺, такую, как, например, СоС1₂. Выращивание можно также осуществлять в присутствии витамина В₁₂ вместе с металлическим кобальтом или другими кобальтовыми соединениями, которые ίη кйи дают ионы кобальта. Целесообразно применять кобальтовое соединение в количестве от 1 до 10 мг/л, предпочтительно от 1 до 3 мг/л.

- 1 006444

Как правило, выращивание осуществляют при температуре от 20 до 50°С и при значении рН в диапазоне от 5 до 8, предпочтительно при температуре от 30 до 45°С и значении рН в диапазоне от 5,5 до 7,5.

Собственно биотрансформацию можно осуществлять с помощью микроорганизмов рода Атусо1аίορδΐδ, с использованием экстракта ферментов этих микроорганизмов или с использованием очищенной нитрилгидратазы из этих микроорганизмов. Целесообразно осуществлять биотрансформацию с использованием микроорганизмов, относящихся к видам Атусо1а1ор818 ΝΕ 31 и Атусо1а1ор§18 ΝΑ40, или их функционально эквивалентных вариантов и мутантов. Особенно предпочтительно применять микроорганизмы, относящиеся к виду Атусо1а1орз18 ΝΑ40. Микроорганизмы указанных видов в соответствии с Будапештским договором были депонированы 03.06.1997 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Оен18сЬе 8атт1нпд уоп М1кгоогдат8теп ипй /е11кн11нгеп ОтЪН, Мазсйегойег^ед 1Ъ, 0-38124. Брауншвейг, Германия) под названиями Атусо1а1ор818 ΝΕ 31 и Атусо1а1ор818 NΑ40 и получили регистрационные номера 08 ΜΖ 11616 и соответственно 08 ΜΖ 11617. Оба эти микроорганизма были более точно идентифицированы и отнесены к еще не описанным в литературе видам рода Атусо1а1ор818.

Таким образом, изобретение также относится к микроорганизмам рода Атусо1а1ор818, которые обладают способностью превращать амид в нитрил, прежде всего к микроорганизмам, имеющим название Атусо1а1орз18 NΑ40 ^8ΜΖ 11617) и Атусо1а1орз18 ΝΕ31 ^8ΜΖ 11616).

Под функционально эквивалентными вариантами и мутантами подразумеваются микроорганизмы, происходящие из вышеуказанных организмов-предшественников и обладающие в основном такими же свойствами и функциями, что и последние. Такие варианты и мутанты могут возникать случайно, например, в результате облучения ультрафиолетовым светом, или под действием вызывающих мутации химических веществ.

Идентификация Атусо1аТов815 ΝΑ40

Цвет воздушного мицелия

Цвет субстратного мицелия белый оранжевый

Цвет диффундировавшего пигмента

Спектр сахаров

АРА ГАЛ МАД

КСИ глю РИБ следы +

Тип

ДАП

Менахинон (в %)

8/4

9/0

9/2

9/4

9/6

9/8

ОБ (+) +

+ + +

Гомология 168-рДНК

Фосфолипиды, такие как ФЭ, ОН-ФЭ, лизо-ФЭ, мет-ФЭ, ФХ, ФГА, ФИ, ФИМ, ФГ, ДФГ, ГЛ

96,9% не исследовали

Жирные кислоты изо-16 изо-15 изо-17 антеизо-15 антеизо-17 10-Ме-16 10-Ме-17 2-ОН-15 2-ОН-16 + + + + ( + ) ( + ) ( + )

Тип мк

- 2 006444

Идентификация Ашусо1а1ор818 ΝΕ31

Цвет воздушного мицелия Цвет субстратного мицелия	белый оранжевый
Цвет диффундировавшего пигмента Спектр сахаров АРА ГАЛ МАД КСИ глю РИБ	+ + следы +
Тип	А
ДАП Менахинон (в %) 8/4 9/0 9/2 9/4 9/6 9/8	ЦБ ( + ) + + + +
Гомология 168-рДНК Фосфолипиды, такие, как ФЭ, ОН-ФЭ, лизо-ФЭ,	96,1% не исследовали

мет-ФЭ, ФХ, ФГА, ФИ, ФИМ, ФГ, ДФГ, ГЛ

Жирные кислоты изо-16 изо-15 изо-17 антеизо-15 антеизо-17 10-Ме-16 10-Ме-17 2-ОН-15 2-ОН-16	+ + + + ( + ) ( + ) ( + ) + + +
Тип	ЗГ
МК	-

Сокращения и пояснения, использовавшиеся при идентификации (+) 1-5% + 5-15% + + 15-30%

+++	>30%
ДАП АРА ГАЛ МАД КСИ ГЛЮ	диаминопимелиновая кислота арабиноза галактоза мадуроза ксилоза глюкоза

РИБ рибоза

Типы сахаров даны согласно БесБеуаИег и др., 1971

Типы жирных кислот даны согласно Кгорреп81еб1, 1985 и 1992

9/4 МК-9 (Н₄)

9/6 МК-9 (н₆)

9/8 МК-9 (н₈)

МК ФЭ ОН-ФЭ мет-ФЭ ФХ ФГА

миколовые кислоты фосф атидилэтаноламин гидрокси-ФЭ фосфатидилметилэтаноламин фосфатидилхолин фосфатидилглюкозамин

- 3 006444

ФИ фосфатидилинозитол

ФИМ фосфатидилинозитолманнозид

ФГ фосфатидилглицерин

ДФГ дифосфатидилглицерин

ГЛ гликолипид

Жирные кислоты изо-16 изогексадекановые кислоты или 14-метилпентадекановые кислоты 10-Ме-18 туберкулостеариновая кислота

2-ОН-16 2-гидроксипальмитиновая кислота

Экстракт ферментов может быть получен путем хорошо известного специалистам разрушения микроорганизмов, например, с помощью ультразвука, с помощью пресса типа Френч или с использованием лизозима. Очевидно, что для осуществления способа этот экстракт ферментов, равно как и целые клетки микроорганизмов, могут быть иммобилизованы на пригодном носителе, представляющем собой полимер, или абсорбирован на пригодном носителе.

Ферменты по изобретению, обладающие нитрилгидратазной активностью, могут быть получены из микроорганизмов рода Лшусо1а1ор818, прежде всего из штамма Атусо1а1ор818 ΝΑ40 (Ό8ΜΖ 11617), и они обладают способностью превращать нитрил в амид.

Основными свойствами этих ферментов являются следующие:

а) рН-оптимум составляет 6,5±1,0;

б) температурный оптимум при рН 7,0 находится между 35 и 40°С;

в) значение К_м для субстрата 3-цианпиридина составляет 41,7±7,7мМ (20°С, 45мМ фосфатный буфер, рН 7,0), прежде всего ферменты имеют

г) молекулярную массу 105 кДа, что может быть определено, например, с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

В качестве субстрата для биотрансформации могут применяться в принципе любые нитрилы. Целесообразно применять либо алифатические нитрилы, содержащие от 1 до 10 атомов углерода, при необходимости замещенные, например, гидрокси-, аминогруппой, галогеном или карбоксигруппой, либо замещенные или незамещенные ароматические нитрилы, содержащие от 4 до 10 атомов углерода в ароматической кольцевой системе. В качестве алифатических нитрилов, содержащих от 1 до 10 атомов углерода, могут применяться динитрилы, гидроксинитрилы, аминонитрилы, такие, как, например, ноктаннитрил, циануксусная кислота, изокапронитрил, н-валеронитрил, адипонитрил, глутаронитрил, сукцинонитрил, себаконитрил, пропионитрил, кротонитрил, акрилнитрил, метакрилнитрил, нитрил нмасляной кислоты или азеланитрил. В качестве ароматических нитрилов, содержащих от 4 до 10 атомов углерода, могут применяться нитрилы общих формул

где К¹ и К² обозначают атом водорода, атом галогена или С₁-С₄алкил. Атом галогена может представлять собой Е, С1, Вг или I.

С₁-С₄алкил может представлять собой метил, этил, пропил, изопропил, трет-пропил, бутил, изобутил или трет-бутил. Пригодными представителями ароматических нитрилов общей формулы I или II являются 2-, 3- или 4-цианпиридин, бензонитрил, фтор-, хлор-, бромбензонитрил, например, орто-, мета-, пара-хлорбензонитрил или 2-хлор-3-цианпиридин. Предпочтительно в качестве ароматического нитрила, содержащего от 4 до 10 атомов углерода, применять 3-цианпиридин.

Биотрансформацию с применением однократной или непрерывной загрузки субстрата целесообразно проводить таким образом, чтобы концентрация субстрата не превышала 40 мас.%, предпочтительно 30 мас.%.

Способ целесообразно осуществлять с использованием покоящихся (не растущих) клеток.

В качестве сред для биотрансформации пригодны обычные в данной области техники среды, такие, как, например, низкомолярный фосфатный буфер, буфер ИЕРЕ8 (\-2-гидроксиэтилпиперазин-\'-2этансульфоновая кислота), цитратный буфер, боратный буфер, среды, состав которых представлен в таблицах 1-3, или их модифицированные формы, такие как, например, среда, описанная в примере 8(1), или буфер трис-НС1.

Биотрансформацию целесообразно проводить при температуре от 0 до 50°С и при значении рН в диапазоне от 4,5 до 10, предпочтительно при температуре от 20 до 40°С и при значении рН в диапазоне от 4,5 до 10,0.

- 4 006444

В особенно предпочтительном варианте осуществления биотрансформацию можно проводить в присутствии С|-С.(спиртов. В качестве СрС₄спиртов могут применяться метанол, этанол, пропанол или бутанол. Предпочтительно применяют метанол.

По завершении превращения соответствующие амиды могут быть выделены с помощью обычных методов переработки, например, с помощью кристаллизации.

Примеры

Пример 1. Культивирование микроорганизмов родов Асйпотайига и Лтусо1а1ор818.

а) В различные образцы почвы, помещенные в обогатительную среду, состав которой приведен в табл. 1, вносили различные нитрилы или амиды в качестве источников углерода и азота и инкубировали в течение 7-10 дней при 37°С или 45°С. После этого культуры пересевали в такую же среду и еще раз культивировали в течение 7-10 дней при 37°С. Весь процесс повторяли трижды. После этого культуры разжижали и высевали на планшеты для получения отдельных колоний. Планшеты инкубировали в течение 5 дней при 37°С. После этого различные колонии тестировали на требуемую активность.

Таким путем выделяли штаммы Лтусо1а1орз18 ΝΑ40 (Ώ8ΜΖ 11617) и Атусо1а1ор818 ΝΕ31 (Ώ8ΜΖ 11616) и затем выращивали их в оптимизированной среде (табл. 3) при встряхивании в течение 90-100 ч при 37°С.

Для Атусо1а1орз18 ΝΕ31 (Ώ8ΜΖ 11616), Асйпотайига зрай1х Ε3733 и Асйпотайига зрай1х Ε3736 в качестве источника углерода и азота использовали адипонитрил, для Атусо1а1ор818 ΝΑ40 (Ώ8ΜΖ 11617) и Асйпотайига зрай1х 45А32 в качестве источника углерода и азота использовали азеланитрил, для Асйпотайига зрай1х 4501 в качестве источника углерода и азота использовали н-октанитрил, а для Асйпотайига зрай1х С15 в качестве источника углерода и азота использовали циануксусную кислоту.

б) Штамм Атусо1а1орз18 NΑ40 культивировали в среде, состав которой представлен в табл. 3. Культивирование осуществляли в субкультурах (в пробирках объемом 4 мл) и в основной культуре (в колбах объемом 500 мл) в аэробных условиях при температуре 37°С в течение 2, соответственно 3-4 дней. Рост клеток измеряли турбидиметрическим методом при длине волны 610 нм и сухую массу клеток подсчитывали следующим образом: масса сухих клеток (в мг/мл) = ОП_{610 нм} х 0,277.

Таблица 1

Обогатительная среда
нитрил	2,0 г
КН₂РО₄	7,0 г
Μβ8Ο₄·7Η₂Ο	0,1 г
смесь витаминов	1,0 мл
СоС1₂»6Н₂О	2,0 мг
Ре8О₄»7Н₂О	2,0 мг

добавить воду до 1 л (рН 6,7-7,3) Таблица 2
Основная среда
мальтоза	2,0 г
ΝβΝΟ₃	1,0 г
К₂НРО₄	0,1 г
Μβ8Ο₄·7Η₂Ο	0,05 г

добавить воду до 100 мл (рН 7,0)

Таблица 3

Оптимизированная среда

ϋ-глюкоза	4,5 г
мясной экстракт	0,5 г
К₂НРО₄	0,1 г
Μβ8Ο₄·7Η₂Ο	0,05 г
СоС1₂*6Н₂О	1,0 мг
добавить воду до 100 мл (рН 7,0)

- 5 006444

Пример 2. Биотрансформапия с использованием микроорганизмов родов АсБпотабига и Атусо1аΐορδίδ.

(1) Для определения нитрилгидратазной активности реакционную смесь (2 мл), содержащую 3цианпиридин (1,0М, 1,0 мл), калий-фосфатный буфер (рН 7,0, 0,1М, 0,5 мл) и 0,5 мл суспензии клеток, инкубировали при перемешивании при 20°С в течение 30 мин. Реакцию прекращали путем добавления 0,2 мл 3н. НС1. После кратковременного центрифугирования определяли содержание образовавшегося никотинамида с помощью ЖХВР (система типа 81ιιιηαάζιι 8Ρ1) 6А с С18-колонкой (Ώονοίοδίΐ ΟΏ8-ΗΟ-5, 4,6х250 см); растворитель: 10мМ КН₂РО₄/Н₃РО₄ (рН 2,8)/ацетонитрил (в объемном соотношении 9:1); скорость потока: 1 мл/мин; абсорбцию измеряли при 230 нм). Удельную активность выражали в виде количества (в мкмолях) образовавшегося никотинами-да/мл/мин/ОП_{610 нм}.

Скорости превращения алифатических нитрилов в обогатительной среде (табл. 1) с использованием выделенных бактерий представлены в табл. 5, влияние индукторов и кофакторов, внесенных в основную среду (табл. 2), представлено в табл. 4, а сравнение активности Атусο1аΐορδ^δ и КБобососсш в основной среде (табл. 2) представлено в табл. 6. Данные из табл. 4 свидетельствуют о том, что нитрилгидратаза из АтусоЫор^^ ΝΑ40 экспрессируется конститутивным образом, однако для проявления активности в качестве кофактора необходим кобальт.

(2) Влияние температуры на рост штамма ΝΑ40.

Субкультуры (2 мл) инкубировали в среде, представленной в табл. 3, в течение 2 дней при 37°С, затем их пересевали в 20 мл среды, представленной в табл. 3 и содержащейся во встряхиваемых колбах. Культивирование проводили при 37, 40, 45, 50 и 55°С в течение 3-4 дней при встряхивании. Измеряли рост клеток и оценивали нитрилгидратазную активность при 20°С. В табл. 7 представлены данные о влиянии температуры на нитрилгидратазную активность и рост клеток.

Таблица 4. Влияние индукторов и кофакторов на удельную активность в основной среде

Индуктор	Рост (ОП₆₁₀тР	Общая активность (мкмоли/мл/мин)	Удельная активность (мкмоли/мл/мин/ОП)
-	1,26	20,9	16,6
ε-капролактам	0,66	9,52	14,5
крото намид	3,41	22,9	6,72
метакриламид	3,33	2,46	0,74
бутирамид	2,19	0,19	0,88
пропионамид	1,91	0,92	0,48
мочевина	1,72	2,97	1,73
Кофактор	Рост <θ^Π610 и»?	Общая активность (мкмоли/мл/мин)	Удельная активность (мкмоли/мл/ мин/ОП)
-	7,97	0,10	0,01
Ре8О₄«7Н₂О	8,32	3,36	0,40
СоС1₂*6Н₂О	8,41	47,8	5,68

Таблица 5. Скорости превращения алифатических нитрилов при использовании выделенных бактерий

Штамм	Субстрат	Рост <ОП₆ю _нм)	Общая активность (мкмоли/мл / мин)	Удельная активность (мкмоли/мл/ мин/ОП)
Ашусо1а1ор818 ΝΕ31 (Ό8ΜΖ 11616)	адипонитрил	2,68	0,377	0,141
АсИпотабига зрасйх Е3733	адипонитрил	1,62	0,347	0,214
Асйпотабига врасНх Е3736	адипонитрил	1,36	3,00	2,21
АсИпотабига 5раб1х 45А32	азеланитрил	5,81	18,8	3,23
АсИпотабига враб1х 4501	н-октаннитрил	7,24	32,2	4,45
АсИпотабига 8раб1х С15	циануксусная кислота	2,04	7,01	3,43
Атусо1а1ор518 ΝΑ40 Φ8ΜΖ 11617)	азеланитрил	5,92	33,0	5,57

- 6 006444

Таблица 6. Сравнение активностей Атусо1а1ор§1§ и КЪоТососсиз гйойосЬгоиз Л

	Микроорганизм Ашусо1а(оры$ ΝΑ40 Φ8ΜΖ 11617) (мкмоли/мл/мин)	Микроорганизм Шюйососсиз гЬойосйгоих Л
Активность в отношении 3цианпиридина	303	314
	Очищенный фермент из штамма ΝΑ40 (мкмоли/мин/мг протеина)	Очищенный фермент из штамма Л (мкмоли/мин/мг протеина)
Активность в отношении 3цианпиридина	1110	371

(3) Для определения активности штамма ΝΑ40 в отношении других субстратов клетки с сухой массой 0,0388 мг инкубировали в описанном выше буфере. Реакцию начинали путем добавления соответствующего субстрата и смесь инкубировали при встряхивании в течение 10 мин при 20° С. Реакцию прекращали, добавляя 0,2 мл 2н. НС1, и реакционную смесь центрифугировали в течение короткого промежутка времени. Надосадочную жидкость анализировали с помощью ЖХВР или газовой хроматографии. В табл. 8 приведены условия опытов по определению специфичности в отношении субстрата, а в табл. 9 представлены данные по специфичности покоящихся клеток штамма ΝΑ40 в отношении различных субстратов.

Соответствующие условия опытов обобщены в табл. 8, а результаты - в табл. 9.

Таблица 7. Влияние температуры выращивания на нитрилгидратазную активность и на рост клеток

Температура	Рост (мг/мл)	Общая активность (мкмоли/мл/мин)	Удельная активность (мкмоли/мл/мин/мг)	Относительная активность (%)
37°С	6,16	4,69	0,761	100
40° С	5,79	9,89	1,71	225
45° С	6,56	4,83	0,736	97
50° С	5,96	1,16	0,195	26

Таблица 8. Условия опытов для определения специфичности в отношении субстрата

Субстрат	Субстрат (мМ)	Метод анализа	Образовавшийся амид
3-цианпиридин	1,0	ЖХВР	никотинамид
2-цианпиридин	0,25	ЖХВР	2-пиколинамид
4-цианпиридин	0,25	ЖХВР	пиридин-4- карбоксамид
кротонитрил	0,4	ЖХВР	кротонамид
бензонитрил	0,03	ЖХВР	бензамид
акрилнитрил	0,4	ЖХВР	акриламид
орто-хлорбензонитрил	0,15	ЖХВР	орто - хлорбензамид
мета-хлорбензонитрил	0,15	ЖХВР	мета - хлорбензамид
пара - хлорбензонитрил	0,15	ЖХВР	пара-хлорбензамид
2-хлор-3-цианпиридин	0,15	ЖХВР	2-хлорникотинамид

Субстрат	Субстрат (мМ)	Метод анализа	Образовавшийся амид
ацетонитрил	0,4	ГХ	ацетамид
пропионитрил	0,4	гх	пропионамид
метакрилнитрил	0,4	ГХ	метакриламид
н - бутиронитрил	0,4	гх	н-бутирамид

Примечание: орто-, мета-, парахлорбензонитрил и 2-хлор-3-цианпиридин добавляли в реакционную смесь в виде раствора в метаноле.

- 7 006444

Таблица 9. Специфичность нитрилгидратазы штамма ΝΑ40 в отношении субстрата

Субстрат	Относительная активность (%)	Субстрат	Относительная активность (%)
3-цианпиридин	100	мета-хлорбензонитрил	75
4-цианпиридин	168	пара-хлорбензонитрил	16
2-цианпиридин	128	2-хлор-Зцианпиридин	126
бензонитрил	51	ацетонитрил	-
кротонитрил	52	пропионитрил	105
акрилнитрил	115	метакрилнигрил	130
орто-хлорбензонитрил	96	н - бутиронитрил	194

(4) Температурный оптимум покоящихся клеток и их теплостойкость.

Реакцию проводили в течение 10 мин в стандартной реакционной смеси. Температурный оптимум находился в диапазоне от 35 до 40°С (фиг. 5). После этого клетки инкубировали в течение 30 мин при различных температурах и оценивали активность в стандартных реакционных условиях. Как видно из фиг. 4, теплостойкость сохранялась приблизительно до 40°С.

(5) рН-оптимум и рН-стабильность покоящихся клеток.

Для определения этих характеристик проводили реакцию в течение 10 мин в стандартной реакционной смеси, в которой калий-фосфатный буфер заменяли различными 0,1М буферами. Как видно из фиг. 6, оптимальное значение рН находится в диапазоне от 4,5 до 10. После инкубации клеточной суспензии в течение 30 мин при 20°С при различных значениях рН клетки центрифугировали. Затем клетки промывали и ресуспендировали в 0,1М калий-фосфатном буфере с рН 7,0. Реакцию проводили в течение 10 мин в стандартных условиях при добавлении 3-цианпиридина. Фермент оставался стабильным при значениях рН в диапазоне от 4,5 до 10,0 (фиг. 7).

(6) Накопление никотинамида. получаемого из 3-цианпиридина с использованием штамма ΝΑ40.

Реакцию проводили в реакционной смеси (30 мл), содержащей 500мМ 3-цианпиридин, 40мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,0) и покоящиеся клетки (сухая масса 2,3 мг). В ходе реакции 7 раз добавляли 3-цианпиридин (500мМ) по мере израсходования предыдущей порции. Таким образом, в течение 15 ч было внесено 4,0 моля 3-цианпиридина, в результате образовывалось 3,89 моля (475 г/л) никотинамида, что соответствует выходу 97,3%. Никотиновая кислота не образовывалась.

Пример 3. Идентификация микроорганизмов рода Атусо1а1ор818.

Идентификация основывалась на использовании следующих 5 хемотаксономических маркеров:

1. Диагностическая аминокислота пептидогликана: мезодиаминопимелиновая кислота.

2. Диагностические сахара: арабиноза и галактоза.

3. Миколовые кислоты: миколовые кислоты отсутствуют.

4. Менахинон: МК-9 (Н₄).

5. Спектр жирных кислот: изо/антеизо-разветвленные и 2-гидроксижирные кислоты, кроме того, выявлены незначительные количества 1 0-метилразветвленных жирных кислот. Такой спектр жирных кислот обнаружен у всех представителей рода Атусо1а1ор818 (спектр жирных кислот 31).

Комбинация этих химических признаков достаточна для обнаружения всех видов рода Атусо1а1ор818.

Характеристики жирных кислот обеих культур сравнивали с информацией, находящейся в банке данных жирных кислот, с использованием анализа основных компонентов. С помощью этого метода оказалось возможным отнести как штамм ΝΕ31, так и штамм ΝΑ40 к роду Атусо1а1ор818, однако осуществить видовую идентификацию оказалось невозможным, так как коэффициент корреляции был слишком низким. Однако на основе сравнения спектра жирных кислот обоих штаммов было установлено, что они представляют собой два штамма, относящиеся к различным видам.

Этот факт был подтвержден результатами анализа последовательности 168-рДНК. В этом случае также была установлена принадлежность к роду Атусо1а1ор818, однако не была установлена принадлежность ни к одному из описанных видов рода Атусо1а1ор818. С помощью этого метода путем прямого секвенирования была определена последовательность 168-рДНК, полученная в результате амплификации с использованием ПЦР гена 168-рДНК. Диагностическую часть последовательности 168-рДНК сравнивали с последовательностями типичных представителей видов рода Атусо1а1ор818 и родственных таксонов. Результаты показали, что штамм принадлежит к роду Атусо1а1ор818. Было обнаружено наибольшее

- 8 006444 сходство с Атусо^оркш теШапоИса, составляющее для штамма ΝΑ40 96,9% и для штамма ΝΕ31 96,1%. Сходство последовательностей обоих штаммов между собой составляло 99,0%. Исследования заявителей, проведенные на представителях рода Атусо^орыз, свидетельствуют о том, что для надежной идентификации видов коэффициент корреляции должен быть выше 99,5%. Поскольку величина 96,9% существенно меньше 99,5%, то можно предположить, что оба изолята не относятся к представителям известных видов Атусо^орыз.

На основе представленных результатов изоляты не могут быть отнесены к какому-либо из известных видов АтусокПорзь. Заявители исходили из того, что NΑ40 и ΝΕ31 представляют собой штаммы двух новых, до сих пор не описанных видов рода АтусокПорзь.

Идентификационные характеристики микроорганизмов рода Атусо1а1оц818

Цвет воздушного мицелия

Цвет субстратного мицелия

Цвет диффундировавшего пигмента

Спектр сахаров

АРА

ГАЛ

МАД

КСИ

ГЛЮ

РИБ

Тип

ДАП

Менахинон (в %)

8/4

9/0

9/2

9/4

9/6

9/8

Гомология 168-рДНК

Фосфолипиды

ФЭ

ОН-ФЭ лизо-ФЭ мет-ФЭ ФХ ФГА ФИ ФИМ ФГ ДФГ ГЛ

Тип

V +

А

ЭЬ ( + ) +

+ + + >99,5% +

+ +

ν +

+ +ОН-ФЭ

Жирные кислоты
изо-16	+ 4- +
изо-15	+
изо-17	(+)
антеизо-15	+
антеизо-17	(+)
10-Ме-16	(+)
10-Ме-17	+
2-ОН-15	+
2-ОН-16	+
Тип	зг
мк

Пример 4. Очистка нитрилгидратазы из микроорганизма штамма NΑ40.

Штамм культивировали при 37°С в течение 3 дней в среде, состав которой приведен в табл. 3. Клетки 2-литровой культуры собирали центрифугированием и затем ресуспендировали в 0,85%-ном растворе №С1. После этого клетки переносили в 0,1М калий-фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 44мМ н-масляную кислоту, и обрабатывали ультразвуком. Экстракт клеток центрифугировали и отделяли клеточный дебрис. Этот экстракт применяли для очистки фермента.

- 9 006444

На протяжении всей очистки применяли калий-фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 44мМ нмасляную кислоту. Как видно из табл. 10, фермент после трех стадий очистки достигал гомогенного состояния.

Таблица 10. Очистка нитрилгидратазы из штамма NΑ40

	Общая активность (единицы)	Общий протеин (мг)	Удельная активность (ед./мг)	Обогащение
экстракт без клеток	73300	1020	71,9	1
ДЭАЭ- 8ер11асе1	68000	ПО	620	8,62
фенилТОУОРЕАКЬ	64800	61,4	1105	15,4

Примечание: 1 единица соответствует количеству фермента, которое катализирует образование никотинамида со скоростью 1 мкмоль/мин при 20°С.

Пример 5. Изучение свойств нитрилгидратазы.

(1) Определение молекулярной массы, структуры субъединид и содержания ионов кобальта.

С помощью хроматографии на колонках типа Θ3000 8А (0,75х60 см) с Т8К-гелем с использованием 0,1М калий-фосфатного буфера (рН 7,0) с добавлением 0,2М КС1 и 44мМ н-масляной кислоты было установлено, что молекулярная масса равна 106 кДа. Было обнаружено, что фермент состоит из 2 различных субъединиц α и β, молекулярные массы которых соответственно равны 30000 и 26000 Да.

На фиг. 1 показана диаграмма определения молекулярной массы с помощью хроматографии на колонке Θ3000 8А с Т8К-гелем.

На фиг. 2 показана диаграмма определения молекулярной массы с помощью электрофореза в ДСНПААГ.

На фиг. 3 показан спектр поглощения очищенного фермента. Была обнаружена широкая полоса поглощения при 300-400 нм.

(2) Специфичность очищенного фермента в отношении субстрата.

Определение специфичности в отношении субстрата проводили аналогично примеру 2(1). Результаты представлены в табл. 11.

Таблица 11. Специфичность очищенной нитрилгидратазы в отношении субстрата

Субстрат	(М)	Общая активность (мкмоли/мл/мин)	Относительная активность (%)
ферментативная реакция	реакция с использованием покоящихся клеток
3-цианпиридин	1,0	17,7	100	100
2-цианпиридин	0,25	39,1	221	128
4-цианпиридин	0,25	31,6	179	168
кротонитрил	0,4	11,9	67	52


Субстрат	(М)	Общая активность (мкмоли/мл/мин)	Относительная активность (%)
ферментативная реакция	реакция с использованием покоящихся клеток
бензонитрил	0,03	11,3	64	51
акрилнитрил	0,4	16,6	94	115
орто- хлорбензонитрил	0,15	22,4	127	96
мета- хлорбензонитрил	0,15	15,9	90	75
парахлорбензонитрил	0,15	2,30	13	16
2-хлор-Зцианпиридин	0,15	16,0	90	126
ацетонитрил	0,4	-	-	-
пропионитрил	0,4	39,3	222	105
метакрилнитрил	0,4	22,1	125	130
н-бутиронитрил	0,4	17,9	101	194

- 10 006444

В реакционную смесь (2,0 мл) добавляли 1,7 единицы фермента. Реакционная смесь содержала соответствующий субстрат в 45мМ фосфатном буфере (рН 7,0).

(3) Определение значения К_м.

Значение К_м, которое определяли на основе диаграммы Ьте^еауег-Вигк, для 3-цианпиридина составляет 41,7мМ, а для акрилнитрила 3,7мМ. Сравнение со штаммом КЬобососсиз гйобосйгоиз Л, у которого значение К_м для 3-цианпиридина составляет 200мМ, показывает, что данный параметр у штамма ΝΑ40 имеет существенно меньшую величину. Это является одним из основных преимуществ штамма ΝΑ40.

(4) Теплостойкость и температурный оптимум.

Очищенный фермент инкубировали при различных температурах в течение 30 мин при рН 7,0 и затем в течение 1 мин при 20°С оценивали превращение 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты. При температуре выше 40°С фермент терял активность. Теплостойкость, как и в случае покоящихся клеток, сохранялась приблизительно до 40°С, температурный оптимум находился в диапазоне от 35 до 40°С (фиг. 5).

(5) рН-оптимум и рН-стабильность.

Для определения этих характеристик проводили реакцию превращения 3-цианпиридина в амид никотиновой кислоты при 20°С в реакционной смеси (2,0 мл), содержащей различные буферы (42,5мМ), 1,71 единицы очищенного фермента и 500мМ 3-цианпиридин. рН-Оптимум составлял приблизительно 6,5±1,0 (фиг. 8).

Для оценки рН-стабильности инкубировали 4,2 единицы очищенного фермента в течение 1 ч при 20°С в различных буферах (45мМ). Часть инкубированного раствора (1,71 единицы) добавляли в стандартную реакционную смесь (ср. пример 2(1)). Оценивали сохранившуюся активность. Фермент сохранял стабильность при значениях рН в диапазоне от 5 до 9. Результаты представлены на фиг. 9.

(6) Ингибиторы.

Оценивали влияние различных ингибиторов. Результаты обобщены в табл. 12.

Таблица 12. Влияние различных ингибиторов на активность очищенного фермента

Ингибитор	мМ	Относительная активность (%)
-		100
N -этилмалеинимид	1	97
йодуксусная кислота	1	39
4-хлорртутьбензойная кислота	0,1	69
азид натрия	1	59
гидроксиламин	1	37
фенилгидразин	1	8
семикарбазин	1	82
тирон (двунатриевая соль 4,5-дигидрокси- 1,3-бензолдисульфоновой кислоты)	1	110

Ингибитор	мМ	Относительная активность (%)
орто - фенантролин	1	89
а -, а ’ - дипиридил	1	100
8 - гидроксихинолин	1	ПО
ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота)	1	115
диэтилдитиокарбамат	1	89

Пример 6. Влияние метанола на покоящиеся клетки штамма ΝΑ40.

Реакцию проводили в течение 10 мин в присутствии различных концентраций (0-20 об.%) метанола в реакционных смесях, состав которых приведен в табл. 13. Как видно из табл. 14, активность повышается при добавлении 5-15% метанола.

- 11 006444

Таблица 13. Реакция с использованием покоящихся клеток

	Методы
1	2	3	4	5
1,0М 3-цианпиридин	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл
0,1М КФБ * (рН 7,0)	0,9 мл	0,8 мл	0,7 мл	0,6 мл	0,5 мл
метанол	-	0,1 мл	0,2 мл	0,3 мл	0,4 мл
суспензия клеток (0,388 мг/мл)	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл
Общий объем	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл	2,0 мл

Примечание: * КФБ обозначает калий-фосфатный буфер.

Таблица 14. Влияние метанола на активность штамма Ашусо1а1ор818 ΝΑ40

Claims

1. Микроорганизм Ашусо1а1оры8 δρ.ΝΑ31 (Ώ8Μ 11616), а также его варианты и мутанты, способные превращать нитрил в амид.

2. Микроорганизм Ашусо1а1оры8 δρ.ΝΑ40 (Ώ8Μ 11617), а также его варианты и мутанты, способные превращать нитрил в амид.

3. Фермент с нитрилгидратазной активностью, полученный из микроорганизмов рода Ашусо1а1ор818, характеризующийся

а) оптимумом активности при рН 6,5±0,1,

б) оптимумом активности при температуре между 35 и 40°С при рН 7,0,

в) константой К_м 41,7±7,7 ммоль при использовании в качестве субстрата 3-цианпиридина.

4. Фермент по п.3, полученный из микроорганизма по п.1.

5. Фермент по п.3, полученный из микроорганизма по п.2.

6. Экстракт с нитрилгидратазной активностью из микроорганизмов, содержащий фермент по любому пп.3-5.

7. Применение микроорганизмов рода Ашусо1а1оры8 для превращения нитрила в амид.

8. Применение по п.7, где микроорганизмы являются микроорганизмами по п.1.

9. Применение по п.7, где микроорганизмы являются микроорганизмами по п.2.

10. Применение экстракта по п.6 для превращения нитрила в амид.

11. Способ получения амидов, предусматривающий инкубирование смеси, содержащей в качестве субстрата нитрил, с

а) микроорганизмами рода Ашусо1а1орыз, способными превращать нитрил в амид, или

б) ферментсодержащим экстрактом с нитрилгидратазной активностью из вышеуказанных микроорганизмов по п.6, или

в) ферментом с нитрилгидратазной активностью по пп.3-5.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве нитрила применяют необязательно замещенный гидрокси, амино, галогеном или карбокси алифатический нитрил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что в качестве нитрила применяют необязательно замещенный галогеном или С1-С4алкилом алифатический нитрил, содержащий от 4 до 10 атомов углерода в ароматической кольцевой системе.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что ароматический нитрил выбирают из соединений общих формул

- 12 006444 где К¹ и К² обозначают атом водорода, атом галогена или С₁-С₄алкил.

15. Способ по любому из пп.11-14, отличающийся тем, что инкубирование осуществляют при температуре от 0 до 50°С и при значении рН от 4,5 до 10.

16. Способ по пп.11-15, в котором используют микроорганизм по п.1.

17. Способ по пп.11-16, в котором используют микроорганизм по п.2.

18. Способ по пп.11-17, в котором используют ферментсодержащий экстракт по п.6.

- 13 006444

Фиг. 4

Фиг. 5

Фиг. 6

—Δ— —▲— Буфер ГЛИЦИН-НС1 Лимонная кислота/натрий-цитратный буфер —о— —·— Калий-фосфатный буфер Буфер трис-НС1 Буфер глицин-ИаОН

Фиг. 7

- 14 006444

Лимонная кислота/натрий-цитратный буфер Калий-фосфатный буфер

Буфер трис-НС1

Буфер Н₃ВО₃-МаОН

Фиг. 8