PL194729B1 - Nowe mikroorganizmy rodzaju Actinomadura i Amycolatopsis oraz gatunku Rhodococcus, nowy enzym o aktywności hydratazy nitrylowej oraz sposób wytwarzania amidów - Google Patents
Nowe mikroorganizmy rodzaju Actinomadura i Amycolatopsis oraz gatunku Rhodococcus, nowy enzym o aktywności hydratazy nitrylowej oraz sposób wytwarzania amidówInfo
- Publication number
- PL194729B1 PL194729B1 PL98338249A PL33824998A PL194729B1 PL 194729 B1 PL194729 B1 PL 194729B1 PL 98338249 A PL98338249 A PL 98338249A PL 33824998 A PL33824998 A PL 33824998A PL 194729 B1 PL194729 B1 PL 194729B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- microorganisms
- nitrile
- rhodococcus
- amycolatopsis
- cyanopyridine
- Prior art date
Links
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 68
- 241000187643 Amycolatopsis Species 0.000 claims abstract description 53
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 16
- GZPHSAQLYPIAIN-UHFFFAOYSA-N 3-pyridinecarbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CN=C1 GZPHSAQLYPIAIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 34
- -1 aromatic nitrile Chemical class 0.000 claims description 18
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 claims 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 69
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 57
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 32
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 108010024026 Nitrile hydratase Proteins 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 17
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 17
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 17
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 16
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 16
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 16
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 16
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 description 14
- 241000894007 species Species 0.000 description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241001327989 Actinoallomurus spadix Species 0.000 description 12
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 12
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 10
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 7
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- MLIREBYILWEBDM-UHFFFAOYSA-N cyanoacetic acid Chemical compound OC(=O)CC#N MLIREBYILWEBDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 6
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- WBUOVKBZJOIOAE-UHFFFAOYSA-N 3-chlorobenzonitrile Chemical compound ClC1=CC=CC(C#N)=C1 WBUOVKBZJOIOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GJNGXPDXRVXSEH-UHFFFAOYSA-N 4-chlorobenzonitrile Chemical compound ClC1=CC=C(C#N)C=C1 GJNGXPDXRVXSEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GYCMBHHDWRMZGG-UHFFFAOYSA-N Methylacrylonitrile Chemical compound CC(=C)C#N GYCMBHHDWRMZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 5
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- NHWQMJMIYICNBP-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzonitrile Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C#N NHWQMJMIYICNBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JAUPUQRPBNDMDT-UHFFFAOYSA-N 2-chloropyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClC1=NC=CC=C1C#N JAUPUQRPBNDMDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FFNVQNRYTPFDDP-UHFFFAOYSA-N 2-cyanopyridine Chemical compound N#CC1=CC=CC=N1 FFNVQNRYTPFDDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N butanamide Chemical compound CCCC(N)=O DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N butyronitrile Chemical compound CCCC#N KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 150000001869 cobalt compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 125000000695 menaquinone group Chemical group 0.000 description 4
- QXOYPGTWWXJFDI-UHFFFAOYSA-N nonanedinitrile Chemical compound N#CCCCCCCCC#N QXOYPGTWWXJFDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- GPHQHTOMRSGBNZ-UHFFFAOYSA-N pyridine-4-carbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=NC=C1 GPHQHTOMRSGBNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- BEOUGZFCUMNGOU-UHFFFAOYSA-N tuberculostearic acid Chemical compound CCCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O BEOUGZFCUMNGOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 4
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- NKKMVIVFRUYPLQ-NSCUHMNNSA-N crotononitrile Chemical compound C\C=C\C#N NKKMVIVFRUYPLQ-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 3
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 3
- YSIMAPNUZAVQER-UHFFFAOYSA-N octanenitrile Chemical compound CCCCCCCC#N YSIMAPNUZAVQER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940080818 propionamide Drugs 0.000 description 3
- FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N propionitrile Chemical compound CCC#N FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- ZONJATNKKGGVSU-UHFFFAOYSA-N 14-methylpentadecanoic acid Chemical class CC(C)CCCCCCCCCCCCC(O)=O ZONJATNKKGGVSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGHSBPIZNUXPLA-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)=O JGHSBPIZNUXPLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 2
- 241001518128 Rhodococcus coprophilus Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N adiponitrile Chemical compound N#CCCCCC#N BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 2
- JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N epsilon-caprolactam Chemical compound O=C1CCCCCN1 JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 2
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- QPYAIIGNPFMEIE-ZDVGBALWSA-N (2e,4e)-3-methyl-5-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)penta-2,4-dienoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C QPYAIIGNPFMEIE-ZDVGBALWSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFMPMSCZPVNPEM-UHFFFAOYSA-N 2-bromobenzonitrile Chemical compound BrC1=CC=CC=C1C#N AFMPMSCZPVNPEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBGDLYUEXLWQBZ-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1Cl RBGDLYUEXLWQBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DUJMVKJJUANUMQ-UHFFFAOYSA-N 4-methylpentanenitrile Chemical compound CC(C)CCC#N DUJMVKJJUANUMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005725 8-Hydroxyquinoline Substances 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHLXCSLQDSCWRR-UHFFFAOYSA-N C(#N)C1=CC=NC=C1.N1=C(C=CC=C1)C(=O)N Chemical compound C(#N)C1=CC=NC=C1.N1=C(C=CC=C1)C(=O)N DHLXCSLQDSCWRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GCSAKAPMIJCSFR-UHFFFAOYSA-N CCCC#N.CC(=C)C(N)=O Chemical compound CCCC#N.CC(=C)C(N)=O GCSAKAPMIJCSFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XXAXVMUWHZHZMJ-UHFFFAOYSA-N Chymopapain Chemical compound OC1=CC(S(O)(=O)=O)=CC(S(O)(=O)=O)=C1O XXAXVMUWHZHZMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVIDVUAQUKENEK-UHFFFAOYSA-N ClC1=C(C#N)C=CC=C1.C(C=C)(=O)N Chemical compound ClC1=C(C#N)C=CC=C1.C(C=C)(=O)N DVIDVUAQUKENEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIUDGYMCSHLZAE-UHFFFAOYSA-N ClC1=CC=C(C#N)C=C1.ClC=1C=C(C(=O)N)C=CC1 Chemical compound ClC1=CC=C(C#N)C=C1.ClC=1C=C(C(=O)N)C=CC1 QIUDGYMCSHLZAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEWZYDAJEVWWMA-UHFFFAOYSA-N ClC1=NC=CC=C1C#N.ClC1=CC=C(C(=O)N)C=C1 Chemical compound ClC1=NC=CC=C1C#N.ClC1=CC=C(C(=O)N)C=C1 LEWZYDAJEVWWMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 241001524109 Dietzia Species 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N Pentanenitrile Chemical compound CCCCC#N RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ISWQCIVKKSOKNN-UHFFFAOYSA-L Tiron Chemical compound [Na+].[Na+].OC1=CC(S([O-])(=O)=O)=CC(S([O-])(=O)=O)=C1O ISWQCIVKKSOKNN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000204066 Tsukamurella Species 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- ASLHGDLLKNKXKM-UHFFFAOYSA-N acetamide propanenitrile Chemical compound CCC#N.CC(N)=O ASLHGDLLKNKXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000005219 aminonitrile group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000008430 aromatic amides Chemical class 0.000 description 1
- UQZCELIAPOTGHG-UHFFFAOYSA-N benzamide;prop-2-enenitrile Chemical compound C=CC#N.NC(=O)C1=CC=CC=C1 UQZCELIAPOTGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical class [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L cobalt(2+) sulfate Chemical class [Co+2].[O-]S([O-])(=O)=O KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- QAHREYKOYSIQPH-UHFFFAOYSA-L cobalt(II) acetate Chemical class [Co+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O QAHREYKOYSIQPH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940116901 diethyldithiocarbamate Drugs 0.000 description 1
- LMBWSYZSUOEYSN-UHFFFAOYSA-N diethyldithiocarbamic acid Chemical compound CCN(CC)C(S)=S LMBWSYZSUOEYSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001902 dimevamide Drugs 0.000 description 1
- FRKBLBQTSTUKOV-UHFFFAOYSA-N diphosphatidyl glycerol Natural products OP(O)(=O)OCC(OP(O)(O)=O)COP(O)(O)=O FRKBLBQTSTUKOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZTOMUSMDRMJOTH-UHFFFAOYSA-N glutaronitrile Chemical compound N#CCCCC#N ZTOMUSMDRMJOTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- VFQXVTODMYMSMJ-UHFFFAOYSA-N isonicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=NC=C1 VFQXVTODMYMSMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 150000008146 mannosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003540 oxyquinoline Drugs 0.000 description 1
- IPWFJLQDVFKJDU-UHFFFAOYSA-N pentanamide Chemical compound CCCCC(N)=O IPWFJLQDVFKJDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N phenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1 HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067157 phenylhydrazine Drugs 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N pirenzepine hydrochloride Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].C1CN(C)CCN1CC(=O)N1C2=NC=CC=C2NC(=O)C2=CC=CC=C21 FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- TWNDNUUBEBLCNU-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-carbonitrile;pyridine-3-carboxamide Chemical compound N#CC1=CC=CC=N1.NC(=O)C1=CC=CN=C1 TWNDNUUBEBLCNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N semicarbazide Chemical compound NNC(N)=O DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- IAHFWCOBPZCAEA-UHFFFAOYSA-N succinonitrile Chemical compound N#CCCC#N IAHFWCOBPZCAEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/03—Actinomadura
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/829—Alcaligenes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
1. Mikroorganizmy rodzaju Amycolatopsis lub Actinomadura, znamienne tym, ze maja zdol- nosc konwersji nitrylu do amidu, a takze ich enzymowe ekstrakty. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są nowe mikroorganizmy rodzaju Actinomadura, Amycolatopsis lub Rhodococcus, nowy enzym o aktywności hydratazy nitrylowej oraz nowy sposób wytwarzania amidów przy użyciu tych mikroorganizmów lub przy użyciu ekstraktów enzymów tych mikroorganizmów.
Znanych jest wiele biotechnologicznych sposobów wytwarzania amidów takich jak, przykładowo, amid kwasu nikotynowego (nikotynamid), będący witaminą z grupy witamin B kompleks, niezbędną dla zwierząt i ludzi. Ogólnie wiadomo, że mikroorganizmy zawierające hydratazę nitrylową przekształcają nitryle w odpowiednie amidy. I tak, w dokumencie EP-A-0 188 316 opisano sposób wytwarzania nikotynamidu wychodząc z 3-cyjanopirydyny przy użyciu mikroorganizmów rodzaju Rhodococcus, Arthrobacter lub Microbacterium.
Niedogodnością tego sposobu jest to, że wskazane mikroorganizmy wykazują jedynie niską aktywność w zakresie przekształcania 3-cyjanopirydyny w nikotynamid.
W dokumencie EP-A-0 307 926 opisano przekształcanie 3-cyjanopirydyny w nikotynamid za pomocą mikroorganizmów z gatunku Rhodococcus rhodochrous J1. Mikroorganizmy te wymagają indukowania aby katalizować żądaną konwersję.
Następną niedogodnością tego sposobu jest to, że Rhodococcus rhodochrous J1 ma czerwone zabarwienie i w związku z tym zachodzi odbarwianie produktu. Ponadto, mikroorganizm ten wykazuje niską termostabilność i jest inhibitowany, przykładowo, przez wyjściową 3-cyjanopirydynę.
Inny sposób wytwarzania nikotynamidu wychodząc z 3-cyjanopirydyny za pomocą mikroorganizmów z gatunku Rhodococcus rhodochrous J1 opisano w dokumencie EP-A-0 362 829. W celu podwyższenia specyficznej aktywności mikroorganizmów zawierających hydratazę nitrylową, do pożywki hodowlanej dodawano jako induktory mocznik lub jego pochodne. Jak w sposobie opisanym wcześniej, odbarwianie produktu również ma miejsce w tym procesie.
Ponadto, w dokumencie WO 95/17505 opisano sposób wytwarzania aromatycznych amidów z odpowiednich wyjściowych nitrylów za pomocą mikroorganizmów z gatunku Rhodococcus rhodochrous M33. Niedogodnością tego sposobu jest czerwone zabarwienie Rhodococcus rhodochrous M33, jak również wysoka wartość Km dla wyjściowej 3-cyjanopirydyny.
Celem obecnego wynalazku jest wyeliminowanie tych niedogodności i zapewnienie sposobu wytwarzania amidów, w którym odpowiednie amidy mogą być wyodrębnione z dobrą wydajnością i czystością.
Cel ten został osiągnięty dzięki wyodrębnieniu nowych mikroorganizmów według wynalazku, uzyskaniu nowego enzymu według wynalazku, jak również dzięki opracowaniu sposobu według wynalazku opartego na zastosowaniu tych mikroorganizmów lub enzymu.
Wynalazek obejmuje mikroorganizmy rodzaju Amycolatopsis lub Actinomadura, które cechują się tym, że mają zdolność konwersji nitrylu do amidu, a także ich enzymowe ekstrakty.
Korzystnie są to mikroorganizmy gatunku Amycolatopsis NA40 i Amycolatopsis NE31, zdeponowane pod numerami depozytowymi, odpowiednio - DSM 11617 i DSM 11616, oraz ich funkcjonalnie równoważne odmiany i mutanty.
Wynalazek obejmuje także mikroorganizmy gatunku Rhodococcus GF270 i GF376, zdeponowane pod numerami depozytowymi, odpowiednio - DSM 12211 i DSM 12175, oraz ich funkcjonalnie równoważne odmiany i mutanty, cechujące się tym, że mają zdolność konwersji nitrylu do amidu, jak również ich enzymowe ekstrakty.
Także enzym mający aktywność hydratazy nitrylowej, otrzymywalny z wyżej zdefiniowanych mikroorganizmów rodzaju Amycolatopsis lub Actinomadura, objęty jest obecnym wynalazkiem.
Korzystnie, enzym według wynalazku cechuje się tym, że
a) jego optimum pH zawiera się w granicach pH 6,5±1,0
b) jego optimum temperatury zawiera się w przedziale 35°C - 40°C przy pH=7,0
c) jego wartość Km dla wyjściowej 3-cyjanopirydyny wynosi 41,7 mM ± 7,7 mM.
Sposób wytwarzania amidów, według wynalazku polega na tym, że nitryl - jako substrat, przekształca się w odpowiedni amid stosując wyżej zdefiniowane mikroorganizmy według wynalazku, stosując enzymowe ekstrakty tych mikroorganizmów, bądź stosując zdefiniowany wyżej enzym według wynalazku.
W sposobie według wynalazku korzystnie jako nitryl stosuje się ewentualnie podstawiony alifatyczny nitryl o 1 do 10 atomach węgla.
PL 194 729 B1
Alternatywnie, zgodnie ze sposobem według wynalazku jako nitryl stosuje się ewentualnie podstawiony aromatyczny nitryl o 4 do 10 atomach węgla w układzie pierścieni aromatycznych. Korzystnie, stosuje się aromatyczny nitryl wybrany spośród związków o wzorze ogólnym 1 albo 2, gdzie każdy z podstawników R1 i R2 oznacza atom wodoru, atom chlorowca lub grupę C^-alkilową.
Zgodnie z wynalazkiem, reakcję prowadzi się w temperaturze od 0°C do 50°C i przy pH od 4,5 do 10.
Zgodnie ze sposobem według wynalazku reakcję korzystnie prowadzi się stosując mikroorganizmy rodzaju Amycolatopsis, oznaczone jako NA40 (DSMZ 11617) lub NE31 (DSMZ 11616), bądź stosując ich funkcjonalnie równoważne odmiany i mutanty.
Tak więc, sposób według wynalazku prowadzi się przekształcając nitryl - jako substrat, w odpowiedni amid przy zastosowaniu mikroorganizmów z rodzaju Actinomadura, Amycolatopsis lub Rhodococcus, przy użyciu enzymowych ekstraktów tych mikroorganizmów, bądź oczyszczonej hydratazy nitrylowej mikroorganizmów z rodzaju Amycolatopsis lub Actinomadura.
Nitryle poddawane biotransformacji takie, jak przykładowo 3-cyjanopirydyna, są substancjami dostępnymi w handlu.
Mikroorganizmy według wynalazku są zdolne do przekształcania nitryli jako substratów w odpowiednie amidy. Korzystnie, powyższe mikroorganizmy posiadają zdolność wzrostu na nitrylach lub amidach jako wyłącznych źródłach węgla i/lub azotu.
Mikroorganizmy według wynalazku są możliwe do uzyskania w wyniku odpowiedniej selekcji, przykładowo, z próbek gleby, szlamu lub ścieków przy zastosowaniu zwyczajnych technik mikrobiologicznych. Dogodnie, mikroorganizmy selekcjonuje się metodą hodowli z nitrylami lub amidami jako wyłącznymi źródłami węgla i azotu, w obecności jonów kobaltu. Nitrylami i amidami odpowiednimi do prowadzenia selekcji są, w szczególności, nitryle stosowane również jako substraty w późniejszej biotransformacji i odpowiednie, otrzymywane z nich amidy. Odpowiednie pożywki wzrostu są również dobrze znane biegłym w sztuce i przykładowo można stosować pożywkę zdefiniowaną w tabeli 1.
Zwyczajowo, mikroorganizmy są hodowane (wzrastają) w taki sam sposób także przed faktyczną biotransformacją, przy użyciu wyżej wspomnianych pożywek.
Jak specjalistom wiadomo, hydrataza nitrylowa powstaje jedynie wtedy, gdy pożywka wzrostu zawiera jony kobaltu jako kofaktor. Odpowiednimi „związkami kobaltu dostarczającymi jony kobaltu są sole Co2+ lub Co3+. Przykładami soli Co2+ lub Co3+ są chlorki kobaltu, siarczany kobaltu i octany kobaltu.
Korzystnie, odpowiednim związkiem kobaltu jest sól Co2+ taka, jak przykładowo CoCh Hodowlę jednakże można również prowadzić w obecności witaminy B12 wraz z metalicznym kobaltem lub z innymi związkami kobaltu, które generują jony kobaltu „in situ. Korzystnie, związek kobaltu jest stosowany w ilości od 1 do 10 mg/l, korzystnie od 1 do 3 mg/l.
Zwyczajowo, hodowlę prowadzi się w przedziale temperatury od 20 do 50°C i przy pH między 5 a 8, korzystnie od 30 do 45°C i przy pH między 5,5 a 7,5.
Faktyczną biotransformację można prowadzić stosując mikroorganizmy z rodzaju Actinomadura, Amycolatopsis, stosując enzymowe ekstrakty tych mikroorganizmów lub oczyszczoną hydratazę nitrylową z tych mikroorganizmów. Dogodnie, biotransformację prowadzi się stosując mikroorganizmy z gatunku Actinomadura spadix, przykładowo wyodrębnione szczepy Actinomadura spadix E3733, Actinomadura spadix E3736, Actinomadura spadix 45A32, Actinomadura spadix 4501 lub Actinomadura spadix C15. Biotransformację korzystnie prowadzi się przy użyciu mikroorganizmów odpowiadających gatunkom Amycolatopsis NE31 i Amycolatopsis NA40 lub ich równoważnym funkcjonalnie odmianom i mutantom. Szczególnie korzystnie stosuje się mikroorganizmy odpowiadające gatunkowi Amycolatopsis NA40. Mikroorganizmy z wymienionych gatunków zdeponowano 03.06.1997 r. w Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH], Mascheroderweg 1 b, D-38124 Brunswick pod nazwą Amycolatopsis NE31 i Amycolatopsis NA40, zgodnie z konwencją budapeszteńską i mają, odpowiednio, numery depozytowe DSMZ 11616 i DSMZ 11617. Powyższe dwa mikroorganizmy zidentyfikowano bardziej dokładnie i mogą być zakwalifikowane jako gatunki rodzaju Amycolatopsis, które nie były jeszcze opisane w literaturze.
Wynalazek obejmuje zatem także mikroorganizmy z rodzaju Amycolatopsis lub Actinomadura, które są zdolne do przekształcenia nitrylu w amid, w szczególności mikroorganizmy oznaczone jako Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) i Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616).
PL 194 729 B1
Ponadto stwierdzono, że specyficzne mikroorganizmy z rodzaju Rhodococcus posiadają lepsze właściwości przekształcania nitryli w amidy niż Rhodococcus rhodochrous J1 opisany w EP-A-0 362 829. Tymi mikroorganizmami są: Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF270 (DSMZ 12211) i Rhodococcus GF376 (DSMZ 12175) lub ich funkcjonalnie równoważne odmiany i mutanty. Mikroorganizm DSMZ 12175 zdeponowano 15.05.1998 r., a mikroorganizm DSMZ 12211 zdeponowano 8.06.1998 r. w Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH], zgodnie z konwencją budapeszteńską.
Gatunki Rhodococcus GF270, GF376, GF473, GF578 i GF674 zaklasyfikowano na podstawie identyfikacji jako gatunki rodzaju Rhodococcus, które nie zostały jeszcze opisane w literaturze. A więc, wynalazek obejmuje również mikroorganizmy Rhodococcus GF270, Rhodococcus GF376, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF578 i Rhodococcus GF674.
W przeciwieństwie do mikroorganizmów rodzaju Actinomadura lub Amycolatopsis, mikroorganizmy rodzaju Rhodococcus dogodnie indukuje się przed faktyczną konwersją. Odpowiednimi induktorami są induktory opisane w EP-A-0 307 926 takie, jak przykładowo acetamid, butyramid, metakrylamid, propionamid, krotonamid i waleramid.
Przez określenie „funkcjonalnie równoważne odmiany i mutanty należy rozumieć mikroorganizmy pochodzące od wyżej wymienionych źródłowych organizmów i zasadniczo mające takie same charakterystyki i funkcje jak one. Odmiany i mutanty tego typu mogą powstawać przypadkowo, przykładowo w wyniku napromieniowania światłem UV lub pod wpływem mutagennych chemikaliów.
Identyfikacja Amycolatopsis NA40
| Barwa grzybni napowietrzonej | biała |
| Barwa grzybni wyjściowej | pomarańczowa |
| Barwa zdyfundowanego pigmentu | - |
| Profil cukrów | |
| ARA | + |
| GAL | + |
| MAD | - |
| XYL | - |
| GLU | ślady |
| RIB | + |
| Typ | A |
| DAP | DL |
| Menachinony (w %) | |
| 8/4 | - |
| 9/0 | (+) |
| 9/2 | + |
| 9/4 | +++ |
| 9/6 | - |
| 9/8 | - |
| Homologia z 16S rDNA | 96,9% |
| Fosfolipidy takie jak: | nie badano |
| PE, OH-PE, lizo PE, met PE, PC, | |
| NPG, PI, PIM, PG, DPG, GL | |
| Kwasy tłuszczowe | |
| izo 16 | +++ |
| izo 15 | + |
| izo 17 | (+) |
| anteizo 15 | (+) |
| anteiso 17 | (+) |
| 10-Me 16 | - |
| 10-Me 17 | + |
| 2-OH 15 | + |
| 2-OH 16 | + |
PL 194 729 B1
| Typ | 3f |
| MS | - |
| Identyfikacja Amycolatopsis NE31 | |
| Barwa grzybni napowietrzonej | biała |
| Barwa grzybni wyjściowej | pomarańczowa |
| Barwa zdyfundowanego pigmentu | - |
| Profil cukrów | |
| ARA | + |
| GAL | + |
| MAD | - |
| XYL | - |
| GLU | ślady |
| RIB | + |
| Typ | A |
| DAP | DL |
| Menachinony (w %) | |
| 8/4 | - |
| 9/0 | (+) |
| 9/2 | + |
| 9/4 | +++ |
| 9/6 | - |
| 9/8 | - |
| Homologia z 16S rDNA | 96,1 % |
| Fosfolipidy takie jak: | nie badano |
| PE, OH-PE, lyso PE, met PE, PC, | |
| NPG, PI, PIM, PG, DPG, GL | |
| Kwasy tłuszczowe | |
| izo 16 | +++ |
| izo 15 | + |
| izo 17 | (+) |
| anteizo 15 | (+) |
| anteiso 17 | (+) |
| 10-Me 16 | - |
| 10-Me 17 | + |
| 2-OH 15 | + |
| 2-OH 16 | + |
| Typ | 3f |
| MS | - |
| Skróty i objaśnienia stosowane przy identyfikacji | |
| (+) | 1-5% |
| + | 5-15 % |
| ++ | 15-30% |
| +++ | > 30% |
| DAP | kwas diaminopimelowy |
| ARA | Arabinoza |
| GAL | Galaktoza |
| MAD | Maduroza |
| XYL | Ksyloza |
| GLU | Glukoza |
| RIB | ryboza |
| Rodzaje cukrów według Lechevalier i wsp., 1971. | |
| Rodzaje kwasów tłuszczowych według: | Kroppenstedt, 1985 i 1992 |
| 9/4 | MK-9 (H4) |
| 9/6 | MK-9 (He) |
| 9/8 | MK-9 (H8) |
PL 194 729 B1
MS
PE
OH-PE met PE PC NPG PI
PIM
PG
DPG
GL
Kwasy tłuszczowe izo-16
10-Me 18 2-OH-16
Identyfikacja GF270, GF376, GF473, kwas mykolowy
Fosfatydyloetanoloamina hydroksy-PE
Fosfatydimetyloetanoloamina
Fosfatydylcholina
Fosfatydylglukozoamina
Fosfatydylinositol
Fosfatydylinositolu mannozyd
Fosfatydylglicerol difosfatydylglicerol glikolipidy kwasy izoheksadekanowe lub kwasy 14-metylopentadekanowe kwas tuberkulostearynowy kwas 2-hydroksypalmitynowy
GF578 i GF674
Identyfikacja tych gatunków oparta jest na 5 charakterystykach, które są niezależne jedna od drugiej.
1. Morfo logia i barwa koloniii krótkie rozgałęzione niteczkii które ulegają dezinteg racji na elementy pałeczko-podobne i zarodniko-podobne. Kolonie GF270 i GF376 są barwy łososiowej (RAL 3022), zaś GF578 i GF674 są jasno czerwone (RAL 3012).
2. Kwasy diaminowe peptydoglikanu: kwas mezo-diaminopimelowy
3. Kwasy mykolowe: Kwasy mykolowe Oznaczeme kwasu mykdowego o długim łańcuchu prowadzono metodą wysokotemperaturowej chromatografii gazowej. Profile wymywania kwasów mykolowych z GR270 i GF376, a także GF473, GF578 i GF674 były takie same. Długość kwasu mykolowego z GF270 i GF376 wynosiła C38-46, a z GF473, GF578 i GF674 - C40-48. Modele kwasu mykolowego porównano z modelami kwasu mykolowego ze szczepów Rhodococcus. GF270 zidentyfikowano z bardzo niskim współczynnikiem korelacji (0,086) jako należący do Rhodococcus rhodochrous; niemożliwym okazało się zidentyfikowanie GF376 tą metodą. Inne trzy wyodrębnione gatunki GF473, GF578 i GF674 zidentyfikowano z bardzo niskim współczynnikiem korelacji jako przynależne do Rhodococcus ruber.
4. Model kwasu nierozgaaęzione, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe obejmujące kwas tuberkulostearynowy. Taki model kwasu tłuszczowego jest rozpoznawczy dla wszystkich rodzajów Rhodococcus i ściśle spokrewnionym gatunkom Mycobacterium, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella i niektórym gatunkom Corynebacteria. Identyfikację na poziomie gatunku osiągnięto na podstawie ilościowych i jakościowych różnic w modelu kwasu tłuszczowego z GF270, GF376, GF473, GF578 i GF674 z modelami kwasów tłuszczowych gatunków Rhodococcus.
5. Subsekwencce 16S rDNA występujące w GF270 i GF376 były idedyczne (100%), chociaż ich porównanie ze szczepami Rhodococcus wykazało podobieństwo jedynie w 99,1% do najbardziej podobnego Rhodococcus rhodochrous. GF473 i GF578 były identyczne pod względem sekwencji 16S rDNA (100%). GF674 różni się od GF578 tylko jedną parą zasad z pięciuset (99,8%). Wszystkie trzy izolaty wykazują tylko dalekie pokrewieństwo z Rhodococcus coprophilus (98,4%).
W oparciu o wyniki chemotaksyczne i biologii molekularnej można stwierdzić, że z jednej strony GF270 i GF376 oraz z drugiej strony GF473, GF578 i GF674 są szczepami 2 nowych gatunków Rhodococcus. GF270 i GF376 są ściśle związane z Rhodococcus rhodochrous pod względem ich 16S rDNA (99,1%), jednakże GF473, GF578 i GF674 są tylko dalece powiązane z Rhodococcus coprophilus (98,4%).
Enzymowy ekstrakt można wytwarzać przez zwykle w tym celu stosowane rozrywanie mikroorganizmów, jak przykładowo rozrywanie przy pomocy ultradźwięków, metodą z użyciem prasy francuskiej lub metodą lizozymową. Ten ekstrakt enzymowy i oczywiście także całe komórki mikroorganizmów mogą być immobilizowane na odpowiednim nośniku, zwyczajowo osadzone na polimerze, w celu przeprowadzeniu procesu, lub absorbowane na odpowiednim materiale nośnikowym.
PL 194 729 B1
Enzymy według wynalazku, mające aktywność hydratazy nitrylowej, mogą być otrzymywane z mikroorganizmów rodzaju Amycolatopsis i mają zdolność przekształcania nitrylu w amid. W szczególności mogą być otrzymywane z Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617).
Enzymy te w szczególności charakteryzują się następującymi właściwościami:
a) optimum pH w przedziale pH 6,5 ±1,0
b) optimum temperatury między 35 a 40°C przy pH = 7,0
c) wartość Km dla substratu 3-cyjanopirydyny równą 41,7 mM ± 7,7 mM (20°C, 45 mM bufor fosforanowy, pH=7,0);
a w szczególności enzymy mają
d) ciężar cząsteczkowy 106 kDa, jak - przykładowo - oznaczony metodą SDS- PAGE.
Generalnie, nitryle mogą być wykorzystywane jako substraty do biotransformacji. Dogodnie stosuje się albo alifatyczne nitryle o 1 do 10 atomach węgla, ewentualnie podstawione, przykładowo grupą hydroksylową, aminową, atomem chlorowca lub grupą karboksylową, bądź też podstawione lub niepodstawione aromatyczne nitryle o 4 do 10 atomach węgla w układzie pierścieni aromatycznych. Alifatycznymi nitrylami o 1 do 10 atomach węgla, które można stosować, są: dinitryle, hydroksynitryle, aminonitryle takie, jak przykładowo n-oktanonitryl, kwas cyjanooctowy, izokapronitryl, n-waleronitryl, adyponitryl, glutaronitryl, sukcynonitryl, sebacynitryl, propionitryl, krotononitryl, akrylonitryl, metakrylonitryl, n-butyronitryl lub azelanitryl. Aromatyczne nitryle o 4 do 10 atomach węgla nadające się do stosowania to nitryle o wzorze ogólnym 1 lub 2, w których każdy podstawnik R i R oznacza atom wodoru, atom chlorowca lub grupę C1-4-alkilową. Atomem chlorowca może być F, Cl, Br lub I. Grupą C1-4-alkilową może być grupa metylowa, etylowa, propylowa, izopropylowa, tert-propylowa, butylowa, izobutylowa lub tert-butylowa. Korzystnymi przedstawicielami aromatycznych nitryli o wzorze ogólnym 1 lub 2 są 2-, 3lub 4-cyjanopirydyna, benzonitryl, fluoro-, chloro- lub bromobenzonitryl taki, jak przykładowo o-, m-, lub p-chlorobenzonitryl lub 2-chloro-3-cyjanopirydyna. 3-cyjanopirydyna jest korzystnie stosowana jako nitryl aromatyczny o 4 do 10 atomach węgla.
Biotransformację prowadzi się dogodnie przez dodanie substratu w jednej porcji lub w sposób ciągły tak, aby stężenie substratu nie przekraczało 40% wagowych, korzystnie 30% wagowych.
Sposób dogodnie prowadzi się z komórkami nie podlegającymi wzrostowi.
Odpowiednimi pożywkami dla prowadzenia biotransformacji są pożywki zwyczajowo stosowane przez specjalistów w tej dziedzinie takie, jak bufory fosforanowe o niskiej masie cząsteczkowej, bufory HEPES, bufory cytrynianowe, bufory boranowe, pożywki wymienione w tabelach od 1 do 3 lub ich zmodyfikowane postacie takie, jak przykładowo opisane w przykładzie VIII (1) lub bufory TRIS/HCl.
Biotransformację dogodnie prowadzi się w temperaturze od 0 do 50°C i przy pH między 4,5 a 10,0, korzystnie w temperaturze między 20 a 40°C i przy pH między 4,5 a 10.
W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania, biotransformację prowadzi się w obecności C1-4-alkoholi. Stosowanymi C1-4-alkoholami mogą być: metanol, etanol, propanol lub butanol. Korzystnie stosuje się metanol.
Po reakcji odpowiednie amidy można następnie wyizolować w znany sposób, zgodnie ze zwyczajowymi metodami obróbki takimi, jak przykładowo krystalizacja.
P r z y k ł a d y:
P r z y k ł a d 1. Wzrost mikroorganizmów rodzaju Actinomadura lub Amycolatopsis a. Różne próbki gleby zaszczepiono różnymi nitrylami lub amidami jako źródłami C i N we wzbogaconej pożywce według tabeli 1 i inkubowano w temperaturze 37°C lub 45°C przez 7-10 dni. Następnie hodowle przeniesiono do takiej samej pożywki i ponownie prowadzono hodowle w temperaturze 37°C przez 7-10 dni. Cały proces powtórzono trzykrotnie. Hodowle następnie rozcieńczono i umieszczono na płytkach w celu otrzymania osobnych kolonii. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 dni. Następnie odmienne kolonie badano pod kątem pożądanej aktywności.
Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) i Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) wyizolowano w podany sposób, a następnie prowadzono hodowle w pożywce optymalnej (tabela 3) przez 90-100 godzin, ze wstrząsaniem, w temperaturze 37°C.
Jako źródło C i N dla Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616), Actinomadura spadix E3733 i Actinomadura spadix E3736 służył adyponitryl, jako źródło C i N dla Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) i Actinomadura spadix 45A32 wykorzystano azelanitryl, jako źródło C i N dla Actinomadura spadix 4501 stosowano n-oktanonitryl, a kwas cyjanooctowy używano jako źródło C i N dla Actinomadura spadix C15.
PL 194 729 B1
b. Hodowlę Amycolatopsis NA40 prowadzono w pożywce według tabeli 3 przez 2 lub 3 do 4 dni w temperaturze 37°C w warunkach aerobowych, w podhodowlach (4 ml/tubę) i w „głównej hodowli (500 ml/kolbę). Wzrost komórek mierzono turbidymetrycznie przy 610 nm i suchą masę komórek obliczano w następujący sposób: masa suchych komórek wyrażona w mg/ml =OD610 nm x 0.277.
T a b e l a 1
| Pożywka wzbogacona | |
| Nitryl | 2,0 g |
| KH2PO4 | 7,0 g |
| MgSO4 x 7H2O | 0,1 g |
| Mieszanina witamin | 1,0 ml |
| CoCl2 x 6H2O | 2,0 mg |
| FeSO4 x 7H2O | 2,0 mg |
Woda do objętości 1 litra (pH = 6,7 - 7,3)
T ab ela 2
| Pożywka podstawowa | |
| Maltoza | 2,0 g |
| NaNO3 | 1,0 g |
| K2HPO4 | 0,1 g |
| MgSO4x 7H2O | 0,05 g |
Woda do objętości 100 ml (pH = 7,0)
T a b e l a 3
| Pożywka zoptymalizowana | |
| D-glukoza | 4,5 g |
| Ekstrakt mięsny | 0,5 g |
| K2HPO4 | 0,1 g |
| MgSO4 x 7H2O | 0,05 g |
| CoCl2 x 6H2O | 1,0 mg |
Woda do objętości 100 ml (pH = 7,0)
P r z y k ł a d 2. Biotransformacja z mikroorganizmami rodzaju Actinomadura lub Amycolatopsis
1) W celu oznaczenia aktywności hydrataay nitrylowej mieszaninę reakcyjną ((2 ml) zawierającą 3-cyjanopirydynę (1,0 M, 1,0 ml), bufor fosforanowo-potasowy (pH = 7,0, 0,1 M, 0,5 ml) i 0,5 ml zawiesiny komórek inkubowano w temperaturze 20° przez 30 minut z jednoczesnym mieszaniem. Reakcję zatrzymano przez dodanie 0,2 ml 3 N HCl. Po krótkim odwirowaniu wytworzony nikotynamid oznaczono metodą chromatografii HPLC (System Shimadzu SPD 6A z użyciem kolumny C18 (Develosil ODSHG-5, 4,6 x 250 cm); eluent: 10 mM KH2PO4/H3PO4 (pH = 2,8)/acetonitryl 9:1 (obj./obj.); szybkość przepływu: 1 ml/min.; pomiar absorpcji przy 230 nm). Aktywność właściwą wyrażono jako: mmole wytworzonego nikotynamidu/ml/min./OD610 nm.
Szybkości reakcji alifatycznych nitryli we wzbogaconej pożywce (tabela 1) z wyodrębnioną bakterią przedstawiono w tabeli 5, wpływy induktorów i kofaktorów w pożywce podstawowej (tabela 2) przedstawiono w tabeli 4, zaś porównanie aktywności Amycolatopsis i Rhodococcus w pożywce podstawowej (tabela 2) podsumowano w tabeli 6. Wyniki zebrane w tabeli 4 świadczą, że hydrataza nitryPL 194 729 B1 lowa z Amycolatopsis NA40 ujawnia się konstytutywnie, lecz kofaktor kobaltowy jest niezbędny dla aktywności.
2) Wpływ temperatury na wzrost NA40
Podhodowle (2 ml) inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 dni w pożywce według tabeli 3, a następnie przeniesiono do kolb wytrząsarki zawierających 20 ml pożywki według tabeli 3. Hodowanie prowadzono w temperaturach 37, 40, 45, 50 i 55°C przez 3 do 4 dni, z wytrząsaniem. Zmierzono wzrost komórek i określono aktywność hydratazy nitrylowej w 20°C. Tabela 7 przedstawia wpływ temperatury na aktywność hydratazy nitrylowej i na wzrost komórek.
Tabe l a 4. Wpływ induktorów i kofaktorów na aktywność właściwą w pożywce podstawowej
| Induktor | Wzrost (OD610 nm) | Aktywność całkowita (mmol/ml/min) | Aktywność właściwa (mmol/ml/min OD) |
| - | 1,26 | 20,9 | 16,6 |
| ε-kaprolaktam | 0,66 | 9,52 | 14,5 |
| krotonamid | 3,41 | 22,9 | 6,72 |
| meta-akryloamid | 3,33 | 2,46 | 0,74 |
| butyramid | 2,19 | 0,19 | 0,88 |
| propionamid | 1,91 | 0,92 | 0,48 |
| mocznik | 1,72 | 2,97 | 1,73 |
| Kofaktor | Wzrost (OD610 nm) | Aktywność całkowita (pmol/ml/min) | Aktywność właściwa (pmol/ml/min/OD) |
| - | 7,97 | 0,10 | 0,01 |
| FeSO4X7H2O | 8,32 | 3,36 | 0,40 |
| CoCl3X 6H2O | 8,41 | 47,8 | 5,68 |
Tabe l a 5. Szybkość konwersji alifatycznych nitryli przy użyciu wyodrębnionych bakterii
| Gatunki | Substraty | Wzrost (OD610 nm) | Aktywność całkowita [mol/ml/min] | Aktywność właściwa [pmol/ml/min /OD] | |
| Amycolatopsis | NE31 (DSMZ 11616) | Adyponitryl | 2,68 | 0,377 | 0,141 |
| Actinomadura spadix | E3733 | Adyponitryl | 1,62 | 0,347 | 0,214 |
| E3736 | Adyponitryl | 1,36 | 3,00 | 2,21 | |
| 45A32 | Azelanitryl | 5,81 | 18,8 | 3,23 | |
| 4501 | n-oktanonitryl | 7,24 | 32,2 | 4,45 | |
| C15 | Kwas cyjanooctowy | 2,04 | 7,01 | 3,43 | |
| Amycolatopsis | Na40 (DSMZ 11617) | Azelanitryl | 5,92 | 33,0 | 5,57 |
PL 194 729 B1
T a b e l a 6. Aktywność Amycolatopsis w porównaniu z Rhodococcusrhodochorus J1
| Mikroorganizm Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) (mmol/ml/min) | Mikroorganizm Rhodococcus rhodochrous J1 | |
| Aktywność dla 3 -cyjanopirydyny | 303 | 314 |
| Oczyszczony enzym z NA40 (mmol/min/mg proteiny) | Oczyszczony enzym z J1 (mmol/min/mg proteiny) | |
| Aktywność dla 3-cyjanopirydyny | 1110 | 371 |
3) W celuoznaczeniaaktywności NA40 względem szeregu substratów, komórki o suchej masie równej 0,0388 mg inkubowano w buforze opisanym wyżej. Reakcję zapoczątkowano przez dodanie właściwego substratu i inkubowano w temperaturze 20°C z wstrząsaniem przez 10 minut. Reakcję zatrzymano przez dodanie 0,2 ml 2 N HCl i mieszaninę reakcyjną krótko odwirowano. Ciecz nadosadową poddano analizie metodą HPLC lub metodą chromatografii gazowej. W tabeli 8 przedstawiono warunki prób na specyficzność względem substratu, a w tabeli 9 przedstawiono specyficzność nierosnących komórek NA40 względem różnych substratów.
Odnośne warunki prób zebrano w tabeli 8, a wyniki podsumowano w tabeli 9.
T a b e l a 7. Wpływ temperatury wzrostu na aktywność hydratazy nitrylowej i na wzrost komórek
| Temperatura | Wzrost (mg/ml) | Aktywność całkowita (mmol/ml/min) | Aktywność właściwa (mmol/ml/min/mg) | Aktywność względna (%) |
| 37°C | 6,16 | 4,69 | 0,761 | 100 |
| 40°C | 5,79 | 9,89 | 1,71 | 225 |
| 45°C | 4,83 | 4,83 | 0,736 | 97 |
| 50°C | 1,16 | 1,16 | 0,195 | 26 |
T a b e l a 8. Warunki prób ze względu na specyficzność substratu
| Substrat | Substrat (mM) | Metoda analizy | Wytworzony amid |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 3-cyjanopirydyna | 1,0 | HPLC | nikotynamid |
| 2-cyjanopirydyna | 0,25 | HPLC | 2-pikolinamid |
| 4-cyjanopirydyna | 0,25 | HPLC | pirydyno-4-karboksyamid |
| krotononitryl | 0,4 | HPLC | krotonamid |
| benzonitryl | 0,03 | HPLC | benzamid |
| akrylonitryl | 0,4 | HPLC | akryloamid |
| o-chlorobenzonitryl | 0,15 | HPLC | o-chlorobenzamid |
| m-chlorobenzonitryl | 0,15 | HPLC | m-chlorobenzamid |
| p-chlorobenzonitryl | 0,15 | HPLC | p-chlorobenzamid |
| 2-chloro-3-cyjanopirydyna | 0,15 | HPLC | 2-chloronikotynamid |
| acetonitryl | 0,4 | GC | acetamid |
| propionitryl | 0,4 | GC | propionamid |
PL 194 729 B1 cd. tabeli 8
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| metakrylonitryl | 0,4 | GC | metakrylamid |
| n-butyronitryl | 0,4 | GC | n-butyramid |
o-, m-, p-chlorobenzonitryl i 2-chloro-3-cyjanopirydynę dodano do mieszaniny reakcyjnej rozpuszczonej w metanolu
T ab e l a 9. Specyficzność hydratazy nitrylowej NA40 względem substratu
| Substrat | Aktywność względna (%) | Substrat | Aktywność względna (%) |
| 3-cyjanopirydyna | 100 | m-chlorobenzonitryl | 75 |
| 4-cyjanopirydyna | 168 | p-chlorobenzonitryl | 16 |
| 2-cyjanopirydyna | 128 | 2-chloro-3-cyjanopirydyna | 126 |
| benzonitryl | 51 | acetonitryl | - |
| krotononitryl | 52 | propionitryl | 105 |
| akrylonitryl | 115 | metakrylonitryl | 130 |
| o-chlorobenzonitryl | 96 | n-butyronitryl | 194 |
4. Optimum temperatury i termiczna stabilność w nierosnących komórkach
Reakcję prowadzono w standardowej mieszaninie reakcyjnej przez 10 minut. Optimum temperatury stwierdzono między 35 i 40°C (rys. 5). Następnie komórki inkubowano w różnych temperaturach przez 30 minut i badano aktywność w standardowych warunkach reakcji. Jak wynika z fig. 4, stabilność termiczna wynosiła 40°C.
4) Optimum pH i stabilność względem pH w nierosnących komórkach
Aby określić te parametry, reakcję prowadzono przez 10 minut w standardowej mieszaninie reakcyjnej, w której bufor fosforanowo-potasowy zastąpiono różnymi buforami w stężeniu 0,1 M. Jak wynika z rysunku Fig. 6 optimum pH zawiera się między 4,5 a 10. Po inkubowaniu zawiesiny komórek w temperaturze 20°C przez 30 minut przy różnych wartościach pH, komórki odwirowano. Następnie komórki przemyto i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 0,1 M buforze fosforanowo-potasowym o pH = 7,0. Reakcję prowadzono przez 10 minut dodając 3-cyjanopirydynę w standardowych warunkach. Enzym był stabilny pomiędzy pH = 4,5 i pH = 10,0 (Fig. 7).
5) Akumulowanie amidu nikotynowego z 3-cyjanopirydyny przez NA40
Reakcję prowadzono w mieszaninie reakcyjnej (30 ml) zawierającej 500 mM 3-cyjanopirydyny, 40 mM bufor fosforano-potasowy (pH = 7,0) i nierosnące komórki (o suchej masie 2,3 mg). Podczas reakcji dodano kolejno 7 porcji 3-cyjanopirydyny (500 mM) każdorazowo po przereagowaniu poprzedniej porcji. W ten sposób dodano 4,0 M 3-cyjanopirydyny w czasie 15 godzin i otrzymano 3,89 M (475 g/l) nikotynamidu, co odpowiada wydajności 97,3%. Nie wytworzył się kwas nikotynowy.
P r z y k ł a d 3. Identyfikacja mikroorganizmów rodzaju Amycolatopsis
Następujących pięć znaczników chemotaksonomicznych potwierdziło identyfikację:
Diagnostyczny aminokwas peptydoglikanu: kwas mezodiaminopimelowy
Diagnostyczne cukry: arabinoza i galaktoza
Kwasy mykolowe: kwasy mykolowe nieobecne
Menachinony: MK-9 (H4)
Moodl kwasu tłuszzczweeg: kwasy tłuszzczwe roozgłęęione izo/antefco oraa 2-hyyrokkslowe: dddatkowo wykryto niewielkie ilości rozgałęzionych kwasów tłuszczowych 10-metylowych. Ten model kwasu tłuszczowego stwierdzono u wszystkich przedstawicieli rodzaju Amycolatopsis (model 3f kwasu tłuszczowego).
Połączenie tych cech chemicznych jest właściwe dla wszystkich gatunków rodzaju Amycolatopsis.
PL 194 729 B1
Dane o kwasach tłuszczowych dotyczące dwóch hodowli porównano posługując się metodą analizy głównego komponenta przy użyciu danych wprowadzonych do bazy danych o kwasach tłuszczowych. Przy użyciu tej metody możliwe było zaklasyfikowanie przypisanie zarówno NE31, jak i NA40 do rodzaju Amycolatopsis, jednakże identyfikacja gatunku nie była możliwa, ponieważ współczynnik korelacji był zbyt niski. Jednakże z porównania modeli kwasu tłuszczowego obu szczepów wynika, że są one szczepami odmiennych typów.
Wynik ten został potwierdzony przez rezultaty analizy sekwencji 16S rDNA. I na tej podstawie nastąpiło zaklasyfikowanie do rodzaju Amycolatopsis, jednak nie do któregokolwiek z opisanych gatunków Amycolatopsis. W tej metodzie określono sekwencję 16S rDNA przez bezpośrednie sekwencjonowanie amplifikowanego PCR genu 16S rDNA. Porównano diagnostyczną część sekwencji 16S rDNA z sekwencjami typowych gatunków rodzaju Amycolatopsis i odpowiednimi danymi. Wyniki wykazały, że szczep przynależy do rodzaju Amycolatopsis. Najwyższą zbieżność stwierdzono z Amycolatopsis metanolica, na poziomie 96,9% (NA40) i 96,1% (NE31). Między sobą oba izolaty wykazały podobieństwo sekwencji na poziomie 99,0%. Nasze badania nad przedstawicielami rodzaju Amycolatopsis wykazały, że dla dobrej identyfikacji gatunków współczynnik korelacji musi być wyższy niż 99,5%. Ponieważ wartość 96,9% jest oczywiście poniżej 99,5%, można założyć na tej podstawie, że oba izolaty nie są przedstawicielami znanych gatunków Amycolatopsis.
Na podstawie obecnych wyników nie było możliwe zaklasyfikowanie izolatów do któregokolwiek ze znanych gatunków Amycolatopsis. Dlatego założyliśmy, że NA40 i NE31 są szczepami dwóch nowych, uprzednio nieopisanych gatunków rodzaju Amycolatopsis.
Charakterystyka identyfikacyjna mikroorganizmów rodzaju Amycolatopsis
Barwa grzybni napowietrzonej
Barwa grzybni wyjściowej
Barwa zdyfundowanego pigmentu
Profil cukrów
ARA +
GAL +
MAD XYL GLU V
| RIB | + |
| Typ | A |
| DAP | DL |
| Menachinony (w %) | |
| 8/4 | - |
| 9/0 | (+) |
| 9/2 | + |
| 9/4 | +++ |
| 9/6 | - |
| 9/8 | - |
| Homologia z 16S rDNA | > 99,5% |
| Fosfolipidy | |
| PE | + |
| OH-PE | + |
| lizo PE | - |
| met PE | - |
| PC | - |
| NPG | - |
| PI | + |
| PIM | V |
| PG | + |
| DPG | + |
| GL | - |
| Typ | II+OH-PE |
| Kwasy tłuszczowe | |
| Izo 16 | +++ |
PL 194 729 B1
Izo 15 +
Izo 17 (+)
Anteizo 15 +
Anteizo 17 (+)
10-Me 16 +
10-Me 17 +
2-OH 15 +
2-OH 16 +
Typ 3f
MS P r z y k ł a d 4. Oczyszczanie hydratazy nitrylowej z mikroorganizmowego szczepu NA40
Prowadzono hodowlę szczepu w temperaturze 37°C przez 3 dni w pożywce według tabeli 3. Komórki z 2 litrowej hodowli zebrano przez odwirowanie a następnie ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w roztworze NaCl o stężeniu 0,85%. Następnie komórki przeniesiono do 0,1 M buforu 3os3oranowo-potasowego (pH = 7,0) zawierającego 44 mM kwasu n-butyrowego i poddano działaniu ultradźwięków. Ekstrakt komórkowy odwirowano i usunięto fragmenty komórek. Ekstrakt ten podano oczyszczaniu enzymu.
Podczas całego oczyszczania stosowano bufor fosforanowo-potasowy (pH = 7,0) zawierający 44 mM kwasu n-butyrowego. Jak można stwierdzić na podstawie danych z tabeli 10 enzym oczyszczono do stanu homogeniczności w 3 etapach.
T ab e l a 10. Oczyszczanie hydratazy nitrylowej z NA40
| Aktywność całkowita (jednostki, U) | Cała ilość proteiny (mg) | Aktywność specyficzna (U/mg) | Wzbogacenie | |
| Ekstrakt wolny od komórek | 73300 | 1020 | 71,9 | 1 |
| DEAE-Sephacel | 68000 | 110 | 620 | 8,62 |
| Fenyl-TOYOPEARL | 64800 | 61,4 | 1105 | 15,4 |
U (1 jednostka): ilość enzymu, która katalizuje wytwarzanie 1 mmola nikotynamidu/min. w temperaturze 20°C.
P r z y k ł a d 5. Charakterystyka hydratazy nitrylowej (1) Oznaczenie ciężaru cząsteczkowego, budowy podjednostek i zawartości jonów kobaltu Ciężar cząsteczkowy oznaczono jako 106 kDa metodą chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem TSK G3000 SW (0,75 x 60 cm) przy użyciu 0,1 M buforu fosforanowo-potasowego (pH = 7,0) zawierającego 0,2 M KCl i 44 mM kwasu n-butyrowego. Stwierdzono, że enzym zawiera 2 różne podjednostki a i b, których ciężar cząsteczkowy określono odpowiednio na 30.000 i 26.000.
Figura 1 przedstawia oznaczanie ciężaru cząsteczkowego metodą chromatograficzną na kolumnie wypełnionej żelem TSK G3000 SW.
Figura 2 przedstawia oznaczanie ciężaru cząsteczkowego metodą SDS-PAG.
Figura 3 przedstawia widmo absorpcyjne oczyszczonego enzymu. Zaobserwowano szerokie pasmo absorpcyjne w przedziale 300-400 nm.
(2) Specyficzność oczyszczonego enzymu względem substratów
Specyficzność względem substratów oznaczono analogicznie jak w przykładzie 2(1). Wyniki zebrano w tabeli 11.
T ab e l a 11. Specyficzność oczyszczonej hydratazy nitrylowej względem substratów
| Substrat | (M) | Aktywność całkowita | Aktywność względna, (%) | |
| (pmol/ml/min) | reakcja enzymatyczna | Reakcja z komórkami nierosnącymi | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 3-cyjnopirydyna | 1,0 | 17,7 | 100 | 100 |
| 2-cyjanopirydyna | 0,25 | 39,1 | 221 | 128 |
PL 194 729 B1 cd. tabeli 11
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 4-cyjanopirydyna | 0,25 | 31,6 | 179 | 168 |
| krotononitryl | 0,4 | 11,9 | 67 | 52 |
| benzonitryl | 0,03 | 11,3 | 64 | 51 |
| akrylonitryl | 0,4 | 16,6 | 94 | 115 |
| o-chlorobenzonitryl | 0,15 | 22,4 | 127 | 96 |
| m-chlorobenzonitryl | 0,15 | 15,9 | 90 | 75 |
| p-chlorobenzonitryl | 0,15 | 2,30 | 13 | 16 |
| 2-chloro-3-cyjano- pirydyna | 0,15 | 16,0 | 90 | 126 |
| acetonitryl | 0,4 | - | - | - |
| propionitryl | 0,4 | 39,3 | 222 | 105 |
| metakrylonitryl | 0,4 | 22,1 | 125 | 130 |
| n-butyronitryl | 0,4 | 17,9 | 101 | 194 |
1,7 U (jednostek) enzymu dodano do mieszaniny reakcyjnej (2,0 ml). Mieszanina reakcyjna zawierała odpowiedni substrat w 45 mM buforze fosforanowym (pH 7,0).
(3) Oznaczenie wartości Km
Ustalono, że wartość Km wynosi 41,7 mM dla 3-cyjanopirydyny i 3,7 mM dla akrylonitrylu posługując się diagramem Lineweaver-Burk'a. W porównaniu z Rhodococcus rhocochrous J1, w przypadku którego wartość Km dla 3-cyjanopirydyny wynosiła 200 mM, wynik dla NA40 jest znacząco niższy.
(4) Stabilność cieplna i optimun temperatury
Oczyszczony enzym inkubowano przez 30 minut przy pH = 7,0 w różnych temperaturach, po czym mierzono stopień konwersji 3-cyjanopirydyny do nikotynamidu w temperaturze 20°C przez 1 minutę. Enzym uległ dezaktywacji w temperaturze wyższej niż 40°C. Stabilność cieplna wynosiła około 40°C jak w przypadku nierosnących komórek, a optimum temperatury było między 35 a 40°C (Fig. 5).
(5) Optimum pH i stabilność względem pH
W tym celu prowadzono konwersję 3-cyjanopirydyny do nikotynamidu w temperaturze 20°C w mieszaninie reakcyjnej (2,0 ml) zawierającej różne bufory (42,5 mM), 1,71 U (jednostki) oczyszczonego enzymu i 500 mM 3-cyjanopirydyny. Ustalono optimum pH około pH = 6,5 ± 1,0 (Fig. 8).
W celu oznaczenia stabilności względem pH, inkubowaniu poddawano 4,2 U (jednostki) oczyszczonego enzymu w temperaturze 20°C przez 1 godzinę w różnych buforach (45 mM). Część poddanego inkubowaniu roztworu - 1,71 U (jednostek) - dodawano do standardowej mieszaniny reakcyjnej (jak w przykładzie 2 (1)). Oznaczano pozostałą aktywność. Enzym wykazywał stabilność w obszarze pH 5 - 9. Wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 9.
(6) Inhibitory
Oznaczono wpływ różnych inhibitorów. Wyniki zebrano w tabeli 12.
T ab e l a 12. Wpływ różnych inhibitorów na oczyszczony enzym
| Inhibitor | MM | Aktywność względna (%) |
| 1 | 2 | 3 |
| - | 100 | |
| N-etylmaleimid | 1 | 97 |
| Kwas jodooctowy | 1 | 39 |
PL 194 729 B1 cd. tabeli 12
| 1 | 2 | 3 |
| kwas 4-chloromerkurobenzoesowy | 0,1 | 69 |
| azydek sodu | 1 | 59 |
| Hydroksyloamina | 1 | 37 |
| Fenylohydrazyna | 1 | 8 |
| Semikarbazyd | 1 | 82 |
| Tiron (dwusodowa sól kwasu 4,5-dihydroksy-1,3-benzenodisulfonowego) | 1 | 110 |
| o-fenantrolina | 1 | 89 |
| a,a'-dipirydyl | 1 | 100 |
| 8-hydroksychinolina | 1 | 110 |
| EDTA (kwas etylenodiaminoczterooctowy) | 1 | 115 |
| ditiokarbaminian dietylu | 1 | 89 |
P r z y k ł a d 6. Wpływ metanolu na komórki nierosnące NA40
Reakcję prowadzono w ciągu 10 minut w obecności 0-20% (objętość/objętość) metanolu według danych z tabeli 13. Jak wynika z tabeli 14, aktywność ulegała podwyższeniu w wyniku dodania metanolu w ilości 5-15% objętościowych.
T a b e l a 13. Reakcja z komórkami nierosnącymi
| Sposoby | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 1,0 M 3-cyjanopirydyna | 1,0 ml | 1,0 ml | 1,0 ml | 1,0 ml | 1,0 ml |
| 0,1 m KPB* (pH = 7,0) | 0,9 ml | 0,8 ml | 0,7 ml | 0,6 ml | 0,5 ml |
| metanol | 0,1 ml | 0,2 ml | 0,3 ml | 0,4 ml | |
| zawiesina komórkowa (0,388 mg/ml) | 0,1 ml | 0,1 ml | 0,1 ml | 0,1 ml | 0,1 ml |
| Całkowita objętość | 2,0 ml | 2,0 ml | 2,0 ml | 2,0 ml | 2,0 ml |
*KPB = bufor potasowo-fosforanowy
T a b e l a 14. Wpływ metanolu na Amycolatopsis NA40
| Sposoby | Metanol [% (v/v)] | Aktywność względna [%] |
| 1 | 0 | 100 |
| 2 | 5 | 123 |
| 3 | 10 | 128 |
| 4 | 15 | 130 |
| 5 | 20 | 105 |
P r z y k ł a d 7. Wzbogacenie mikroorganizmów rodzaju Rhodococcus
Różne próbki gleby zaszczepiono kwasem cyjanooctowym jako źródłem C i N we wzbogaconej pożywce według tabeli 1 i wyodrębniono mikroorganizmy Rhodococcus GF270, GF578, GF473 i GF376 zgodnie z przykładem 1.
PL 194 729 B1
P r z y k ł a d 8. Biotransformacja przy użyciu mikroorganizmów rodzaju Rhodococcus (1) Stabilność termiczna mikroorganizmów Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF270 i Rhodococcus GF376 w porównaniu z Rhodococcus J1
W celu określenia stabilności termicznej opisane powyżej mikroorganizmy poddano hodowli w następujących pożywkach.
Rhodococcus rhodochrous J1 poddaano hodowli przez 72 godziny w pożywce opisanej w EP-A 0 307 926. Mikroorganizmy Rhodococcus GF674, GF578, GF270 i GF376 poddano hodowli w następującej pożywce przy pH=7,0 w czasie do 96 godzin:
Rhodococcus GF674 w pożywce zawierającej: 1,0 g/l ekstraktu drożdży, 5,0 g/l fruktozy, 10,0 g/l ekstarktu słodowego, 5,0 g/l acetamidu, 2,0 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4 x 7H2O i 10,0 mg CoCl2 x 6H2O. Rhodococcus GF578 w pożywce zawierającej: 1,0 g/l ekstraktu drożdży, 15,0 g/l fruktozy, 10,0 g/l ekstraktu słodowego, 25,0 g/l acetamidu, 2,0 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4 x 7H2O, i 5,0 g/l CoCl2 x 6H2O. Rhodococcus GF270 w pożywce zawierającej: 12,5 g/l ekstraktu drożdży, 5,0 g/l cytrynianu sodu, 7,5 g/l metakrylamidu, 2,0 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4 x 7H2O, i 30,0 g/l CoCh x 6H2O. Rhodococcus GF376 w pożywce zawierającej: 1,0 g/l ekstraktu drożdży, 10,0 g/l cytrynianu sodu, 15,0 g/l ekstraktu słodowego, 7,5 g/l butyramidu, 2,0 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4 x 7H2O, i 15,0 g/l CoCh x 6H2O.
Nierosnące komórki następnie inkubowano przez 15 minut w różnych temperaturach i następnie określano pozostałą aktywność w standardowych warunkach reakcji zgodnie z przykładem 2 (1).
W trakcie powyższych badań stwierdzono, że Rhodococcus GF674 wykazywał aktywność względną bliską 100% w temperaturze 50°C i nadal w przybliżeniu aktywność 10% w temperaturze 60°C. Rhodococcus GF578 podobnie wykazał aktywność względną 100% w temperaturze 50°C i aktywność względną 20% w temperaturze 60°C. Rhodococcus GF376 wykazał aktywność względną 100% w temperaturze do 50°C, aktywność względną 70% w temperaturze 60°C i nadal aktywność względną bliską 5% w temperaturze 70°C. Rhodococcus GF270 wykazał aktywność względną bliską 100% w temperaturze do 60°C i podobnie aktywność względną niemal 5% w temperaturze 70°C. W porównaniu do tego, Rhodococcus rhodochrous J1 wykazał aktywność względną 100% relatywną aktywność w temperaturze do 50°C, aktywność względną 80% w temperaturze 60°C i już żadnej aktywności w temperaturze 70°C.
Podsumowując, należy podkreślić, że Rhodococcus GF270 i GF376 miały lepszą stabilność termiczną aniżeli J7, a najlepszą stabilność termiczną wykazał GF270.
(2) Optimum pH szczepów Rhodococcus
Wpływ pH na aktywność hydratazy nitrylowej gatunków Rhodococcus GF674, GF578, GF270 i GF376 określono w sposób opisany w przykładzie 2(5).
Optimum pH dla Rhodococcus GF674 zawierało się w przedziale pH = 7,5 - 9,5; dla GF578 w przedziale pH = 8-8,5; dla GF270 w przedziale pH = 6-7,0; a dla GF376 w przedziale pH - 6-8.
(3) Specyficzność szczepów Rhodococcus względem substratów
Specyficzność względem substratów przedstawiono jako aktywność względną w tabeli 15.
Ta b e la 15
| Rhodococcus | |||||
| rhodochrous J1 | GF674 | GF578 | GF270 | GF376 | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 3-cyjanopirydyna | 100(%) | 100(%) | 100(%) | 100(%) | 100(%) |
| 2-cyjanopirydyna | 45 | 308 | 200 | 15,7 | 54,3 |
| 4-cyjanopirydyna | 70 | 231 | 167 | 55,6 | 79,8 |
| Benzonitryl | 27 | 138 | 85,1 | 13,4 | 57,2 |
| 2-chlorobenzonitryl | 2,8 | 64,8 | 49,0 | 0 | 0 |
| 3-chlorobenzonitryl | 43 | 27,8 | 28,9 | 8,41 | 8,63 |
| 4-chlorobenzonitryl | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 |
PL 194 729 B1 cd. tabeli 15
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| acetonitryl | 608 | 1,49 | 347 | 659 | 806 |
| propionitryl | 434 | 274 | 274 | 37,3 | 245 |
| n-butyronitryl | 352 | 491 | 493 | 181 | 195 |
| akrylonitryl | 478 | 147 | 110 | 192 | 257 |
| krotononitryl | 78,2 | 98,0 | 124 | 37,1 | 110 |
| metakrylonitryl | 86,9 | 176 | 122 | 0 | 0 |
(4) Akumulowanie nikotynamidu szczepów Rhodococcus
Analogicznie jak w Przykładzie 2 (6) prowadzono hodowle szczepów Rhodococcus GF674, GF578, GF270 i GF376 z dodatkiem 3-cyjanopirydyny (około 500 mM). W tej próbie Rhodococcus GF674 wytworzył 6 M nikotynamidu w przeciągu 25 godzin, GF578 wytworzył 5,5 M nikotynamidu w przeciągu 10 godzin, GF270 - około 8,5 M nikotynamidu w przeciągu 20 godzin, a GF376 - 7,5 M nikotynamidu w przeciągu 20 godzin.
(5) Tolerancja 3-cyjanopirydyny na aktywność szczepów Rhodococcus
W celu zbadania tolerancji 3-cyjanopirydyny, nierosnące komórki poddano inkubacji przez 15 minut w temperaturze 20°C w stężeniach 3-cyjanopirydyny między 1 i 10% (wagowo/objętościowych), po czym komórki usunięto przez odwirowanie. Po przemyciu komórek 0,85% NaCl, zmierzono pozostałą aktywność.
Tolerancję 3-cyjanopirydyny jako substratu badano przy różnych stężeniach substratu. Stwierdzono, że przy stężeniu substratu 2% (wagowo/objętościowych) aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus Rhodochrous J1 obniżyła się o współczynnik 1,4, aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus GF674 przy stężeniu substratu 4% (wagowo/objętościowych) obniżyła się o współczynnik 1,4, aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus GF578 utrzymywała się na niemal stałym poziomie aż do stężenia substratu 8%, aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus GF270 przy stężeniu substratu 4% (wagowo/objętościowych) obniżyła się o współczynnik 1,17, a aktywność hydratazy nitrylowej Rhodococcus GF674 przy stężeniu substratu 10% (wagowo/objętościowych) obniżyła się o współczynnik 1,25.
W porównaniu z innymi gatunkami Rhodococcus, Rhodococcus rhocochrous J1 przejawiał najgorszą tolerancję na 3-cyjanopirydynę.
Claims (11)
1. Mikroorganizmy rodzaju Amycolatopsis lub 4(^tii^(^i^^t^i^i^ć^, znamienne że mają zdolność konwersji nitrylu do amidu, a także ich enzymowe ekstrakty.
2. Mikkoorggnizmy weeług zzstrz. 1, ggaunku Αη^οοΜορδίδ NA40 i Αη^οοΜορδίδ NE31, zzdponowane pod numerami depozytowymi, odpowiednio - DSM 11617 i DSM 11616, oraz ich funkcjonalnie równoważne odmiany i mutanty.
3. Mikrzorzgsizmy gaaunku Rt^c^c^c^c^c^c^c^L^s GF220 i G/^ć^ż^ć^, zZoponkwesk ppd numerami doppzytowymi, odpowiednio - DSM 12211 i DSM 12175, oraz ich funkcjonalnie równoważne odmiany i mutanty, znamienne tym, że mają zdolność konwersji nitrylu do amidu, a także ich enzymowe ekstrakty.
4. Er^^z^m mający a^kt<v^r^c5^ć; hydraaaaz nittzlowe-j o-rzymywalnk z mikroorzanizmów żak zdefiniowano w zastrz. 1 i 2.
5. Enzym według zastrz. 4, znamienny tym, że
a) jego optimum pH zawiera się w granicach pH 6,5±1,0
b) jego optimum temperatury zawiera się w przedziale 35°C - 40°C przy pH=7,0
c) jego wartość Km dla wyjściowej 3-cyjanopirydyny wynosi 41,7 mM ± 7,7 mM.
6. Sposób wytwarzania amidów, znamienny tym, że nitryl - jako substrat, przekształca się w odpowiedni amid stosując mikroorganizmy jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo 3, stosując enzymowe ekstrakty tych mikroorganizmów, bądź stosując enzym jak zdefiniowano w zastrz. 4.
PL 194 729 B1
7. Sposóbwedług zastrz.6,znamiennytym, że jako nitrylstosujes ięewentualniepodstawiony slifstycany nitryl s 1 Ss 10 stsmsch węgls.
8. Sposóbwedług zastrz.6,znnmiiennntym, że j aSonitrylstosujesięewentualniepodstawiony aromatyczny nitryl s 4 Ss 10 stsmsch węgls w aOłsSain oinrścinni aromatycznych.
9. Spodóbwedługzaktrz.8, znnmlienaatym, że stodujesięaromatyycay nitryl\ΛwyrakysóośrbS awiązObw s wasran sgblnym 1 albs 2, gSain OaeSy a odSutawniObw R1 i R2 sanacaa atsm wsSsra, atsm chlsrswca lab grapę C1-4-al0ilswą.
10. Spodóbwedługzaktrz.6,znnmlienaatym, żeredkojęproweSsisięw temporaturzaoso0C Ss 50°C i oray oH sS 4,5 Ss 10.
11. ;podóbwedłuazaktrz.6albb 7, albb8, albb 9, albb 1 0,znnmιienaatym, że redkojęprowet Sai tię Ostając miOrssrganiamy rsSaaja Amycolatopsis sanacasnn jaks NA40 (DSMZ 11617) lab NE31 (DSMZ 11616), bąSź Ostając ich fanOcjsnalnin rbwnswaend sSmiany i matanty.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH177697 | 1997-07-22 | ||
| CH262997 | 1997-11-17 | ||
| CH81598 | 1998-04-06 | ||
| PCT/EP1998/004587 WO1999005306A1 (de) | 1997-07-22 | 1998-07-22 | Verfahren zur herstellung von amiden |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL338249A1 PL338249A1 (en) | 2000-10-09 |
| PL194729B1 true PL194729B1 (pl) | 2007-06-29 |
Family
ID=27172439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL98338249A PL194729B1 (pl) | 1997-07-22 | 1998-07-22 | Nowe mikroorganizmy rodzaju Actinomadura i Amycolatopsis oraz gatunku Rhodococcus, nowy enzym o aktywności hydratazy nitrylowej oraz sposób wytwarzania amidów |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US6444451B1 (pl) |
| EP (1) | EP1002122B1 (pl) |
| JP (1) | JP4302876B2 (pl) |
| KR (1) | KR100517776B1 (pl) |
| CN (2) | CN1108372C (pl) |
| AT (1) | ATE234932T1 (pl) |
| AU (1) | AU8978398A (pl) |
| CA (1) | CA2294621C (pl) |
| CZ (1) | CZ299166B6 (pl) |
| DE (1) | DE59807569D1 (pl) |
| DK (1) | DK1002122T3 (pl) |
| EA (2) | EA006444B1 (pl) |
| ES (1) | ES2190098T3 (pl) |
| HU (1) | HU226274B1 (pl) |
| IL (1) | IL133754A0 (pl) |
| MX (1) | MX215285B (pl) |
| NO (1) | NO319663B1 (pl) |
| PL (1) | PL194729B1 (pl) |
| PT (1) | PT1002122E (pl) |
| SK (1) | SK283395B6 (pl) |
| TR (1) | TR200000150T2 (pl) |
| UA (1) | UA83654C2 (pl) |
| WO (1) | WO1999005306A1 (pl) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2190098T3 (es) | 1997-07-22 | 2003-07-16 | Lonza Ag | Procedimiento para la preparacion de amidas. |
| BR0109480B1 (pt) * | 2000-03-21 | 2014-03-18 | Mitsubishi Rayon Co | Método de cultivo de microorganismo |
| AU2002228036A1 (en) * | 2001-01-09 | 2002-07-24 | Lonza Ag | Microbiological method for producing amides |
| CN101735961B (zh) * | 2008-11-21 | 2012-06-06 | 华东理工大学 | 一种放线菌菌株及其在制备芳香羟胺中的应用 |
| IT1400395B1 (it) | 2010-06-08 | 2013-05-31 | Procos Spa | Processo one-pot per la sintesi di dalfampridine. |
| CN115044501B (zh) * | 2022-05-27 | 2023-08-25 | 湖南大学 | 促进植物生长的内生稀有放线菌及其用途 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5937951B2 (ja) | 1981-11-18 | 1984-09-12 | 秀明 山田 | アミドの生物学的製造法 |
| US4629700A (en) | 1983-11-30 | 1986-12-16 | Standard Oil Company (Indiana) | Selective conversion of cyano compounds to amides and carboxylic acids |
| US5179014A (en) * | 1985-01-08 | 1993-01-12 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Process for the preparation of amides using microorganisms |
| JPS61162193A (ja) * | 1985-01-08 | 1986-07-22 | Nitto Chem Ind Co Ltd | 微生物によるアミド類の製造法 |
| JPH0797482B2 (ja) * | 1985-03-29 | 1995-10-18 | 株式会社東芝 | カラ−受像管 |
| US5200331A (en) * | 1985-06-04 | 1993-04-06 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method of producing an amide utilizing a microorganism |
| JPS62259586A (ja) | 1986-05-02 | 1987-11-11 | Nitto Chem Ind Co Ltd | ニトリル水和活性の保持方法 |
| JPS62257386A (ja) | 1986-05-02 | 1987-11-09 | Nitto Chem Ind Co Ltd | ニトリル水和活性の保持方法 |
| US5206158A (en) * | 1986-07-02 | 1993-04-27 | Gist-Brocades N.V. | Process for the preparation of difluorobenzamide |
| US4800162A (en) | 1987-04-01 | 1989-01-24 | Sepracor, Inc. | Method for resolution of steroisomers in multiphase and extractive membrane reactors |
| MX169933B (es) * | 1987-09-18 | 1993-08-02 | Hideaki Yamada | Procedimiento para la produccion biologica de amidas |
| US5283193A (en) | 1988-06-27 | 1994-02-01 | Asahi Kasei Kogyo K.K. | Process for producing optically active α-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefor |
| CZ280901B6 (cs) | 1988-10-06 | 1996-05-15 | Hideaki Yamada | Způsob kultivace bakterií |
| US5648256A (en) * | 1990-02-28 | 1997-07-15 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant |
| US5618710A (en) | 1990-08-03 | 1997-04-08 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | Crosslinked enzyme crystals |
| US5593871A (en) * | 1990-09-20 | 1997-01-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for the preparation of enantiometric 2-alkanoic acid amides from nitriles |
| JPH05284982A (ja) * | 1992-04-08 | 1993-11-02 | Japan Energy Corp | 微生物によるラセミ化２−アミノニトリルの製造法 |
| AU3692593A (en) | 1992-04-28 | 1993-11-04 | Mitsubishi Kasei Corporation | Novel protein having nitrile hydratase activity and the gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene |
| RU2053300C1 (ru) * | 1993-12-17 | 1996-01-27 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы |
| EP0773297B2 (en) | 1995-11-10 | 2008-04-23 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Process for producing alpha-hydroxy acid or alpha-hydroxyamide by microorganism |
| ES2190098T3 (es) * | 1997-07-22 | 2003-07-16 | Lonza Ag | Procedimiento para la preparacion de amidas. |
-
1998
- 1998-07-22 ES ES98941398T patent/ES2190098T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-22 EA EA200000135A patent/EA006444B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 SK SK19-2000A patent/SK283395B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 AT AT98941398T patent/ATE234932T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 TR TR2000/00150T patent/TR200000150T2/xx unknown
- 1998-07-22 WO PCT/EP1998/004587 patent/WO1999005306A1/de active IP Right Grant
- 1998-07-22 IL IL13375498A patent/IL133754A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 US US09/463,203 patent/US6444451B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-22 DK DK98941398T patent/DK1002122T3/da active
- 1998-07-22 JP JP2000504275A patent/JP4302876B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-22 UA UAA200508810A patent/UA83654C2/ru unknown
- 1998-07-22 EP EP98941398A patent/EP1002122B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-22 AU AU89783/98A patent/AU8978398A/en not_active Abandoned
- 1998-07-22 CN CN98807505A patent/CN1108372C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-22 EA EA200500335A patent/EA009075B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 CA CA002294621A patent/CA2294621C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-22 CN CNB03120113XA patent/CN1269950C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-22 DE DE59807569T patent/DE59807569D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-22 KR KR10-2000-7000642A patent/KR100517776B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 CZ CZ20000153A patent/CZ299166B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 PT PT98941398T patent/PT1002122E/pt unknown
- 1998-07-22 HU HU0003069A patent/HU226274B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 PL PL98338249A patent/PL194729B1/pl unknown
-
1999
- 1999-12-22 NO NO19996401A patent/NO319663B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-01-11 MX MXPA/A/2000/000440 patent/MX215285B/es not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-09-03 US US10/234,088 patent/US7105322B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-07-28 US US11/495,035 patent/US7741097B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-10-31 US US11/931,500 patent/US7556956B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-31 US US11/931,639 patent/US7666635B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-31 US US11/931,719 patent/US7595178B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5334519A (en) | Process for biological production of amides with R. rhodochrous J-1 | |
| US5089411A (en) | Method of culturing a strain of rhodococcus rhodochrous having nitrile hydratase activity | |
| US5827699A (en) | Strain of Rhodococcus rhodochrous as a producer of nitrile hydratase | |
| US7556956B2 (en) | Enzymes for the preparation of amides | |
| US7838271B2 (en) | Microbiological method for producing amides | |
| MXPA00000440A (es) | Procedimiento para la preparacion de amidas |