CZ2000153A3

CZ2000153A3 - Mikroorganismy rodu Amycolatopsis nebo Actinomadura, enzymy z nich získané a způsob výroby amidů

Info

Publication number: CZ2000153A3
Application number: CZ2000153A
Authority: CZ
Inventors: Karen Tracey Robins; Toru Nagasawa
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1997-07-22
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2000-05-17
Also published as: HU226274B1; US7105322B2; EA009075B1; IL133754A0; TR200000150T2; JP2001511355A; NO996401D0; US20030148478A1; HUP0003069A3; US7595178B2; DK1002122T3; WO1999005306A1; PT1002122E; CZ299166B6; US7556956B2; CN1108372C; CA2294621C; JP4302876B2; ES2190098T3; US20080057550A1

Description

Mikroorganismy rodu Amycolatopsis nebo Actinomadura, enzymy z nich získané a způsob výroby amidů

Oblast techniky

Vynález se týká nových mikroorganismů rodu Actinomadura, Amycolatopsis a Rhodococcus. Dále se vynález týká způsobu výroby amidů za použití těchto mikrorganismů, popř. za použití enzymových extraktů těchto mikroorganismů.

Dosavadní stav techniky

Pro amidy jako je například nikotinamid, který je pro člověka a zvířata esenciálním vitaminem vitaminů B-komplexu, je známo více biotechnologických způsobů. Obecně se ví, že mikroorganismy obsahující nitrilhydratázu přeměňují nitrily na odpovdající amidy. EP-A-0 188 316 popisuje způsob výroby nikotinamidu z

3-kyanpyridinu za použití mikroorganismů rodu, Rhodococcus, Arthrobacter nebo Mikrobacterium.

Nevýhodou při tomto způsobu je to, že mají mikroorganismy pro přeměnu 3-kyanpyridinu na nikotinamid jen malou aktivitu.

EP-A-0 307 926 popisuje přeměnu 3-kyapyridinu na nikotinamid pomocí mikroorganismů druhu Rhodococcus rhodochrous JI. Aby tyto mikroorganismy katalyzovaly potřebnou reakci, musejí se indukovat. Další nevýhodou tohoto způsobu je to, že je Rhodococcus rhodochrous JI červeně zbarven a tím dochází k zabarvení produktu. Dále má tento mikroorganismus malou teplotní stabilitu a je -např. substrátem 3-kyanpyrimidinera inhibován. Další způsob výroby nikotinamidu z 3-kyanpyridinu pomocí mikroorganismů druhu Rhodococcus rhodochrous JI je popsán v EP-A-0 362 829. Pro zvýšení specifické aktivity mikroorganismů obsahujících nitrilhydratázu se ke kultivačnímu mediu přidala močovina, popř. derivát močoviny jako induktor. Stejně jako u předešlého způsobu, také při tomto dochází k zabarvení produktu. Dále popisuje WO 95/17 505 způsob výroby aromatických amidů z odpovídajících nitrilů pomocí mikroorganismů druhu Rhodococcus rhodochrous M33. Nevýhodou tohoto způsobu je červené zbarvení • · · · · · • · • · • · t · · · ···· • · * ·· ···· ·· 9 ·

- 2 Rhodococcus rhodochrous M33 a vysoká hodnota K_M pro substrát 3-kyanpyridin.

Úkolem předloženého vynálezu tedy bylo odstranit tyto nedostatky a poskytnout způsob výroby amidů, při kterém se mohou izolovat odpovídající amidy v dobrém výtěžku a čistotě.

Podstata vynálezu

Tento úkol se řeší pomocí nových mikroorganismů podle nároku 1 a 3 a způsobem podle nároku 6.

Způsob se podle vynálezu provádí tak, že se nitril jako substrát přemění na odpovídající amid pomocí mikroorganismů rodu Actinomadura, Amycolatopsis nebo Rhodococcus, pomocí enzymového extraktu z těchto mikroorganismů nebo pomocí čištěné nitrilhydra tázy mikroorganismů rodu Amycolatopsis nebo Actinomadura.

Nitrily použité pro biotransformaci, jako např. 3-kyapyridin, jsou komerčně dostupné sloučeniny.

Mikroorganismy podle vynálezu mají schopnost přeměnit nitrily jako substráty na odpovídající amidy. Výhodně mají tyto mikroorganismy schopnost růst na nitrilech nebo amidech jako jediném zdroji uhlíku a/nebo dusíku.

Mikroorganismy podle vynálezu se získají vhodnou selekcí například ze vzorků půdy, kalu nebo odpadních vod za pomoci obvyklých mikrobiologických technik. Účelně se mikroorganismy podrobí selekci pěstováním s nitrily nebo amidy jako výhodně jediný zdroj uhlíku nebo dusíku v přítomnosti iontů kobaltu. Nitrily a amidy vhodné pro selekci jsou zejména ty nitrily, které se také používají při pozdější biotransformaci jako substráty a z toho vzniklé odpovídající amidy. Vhodná růstová media jsou pro odborníka rovněž známá, například se může použít medium popsané v Tabulce 1.

• · • · · · • ·

- 3 Obvykle se mikroorganismy také stejným způsobem kultivují před vlastní biotransformací, přičemž se používají shora uvedená media

Jak je v oboru známo, nitrilhydratáza se tvoří pouze tehdy, jestliže kultivační medium obsahuje ionty kobaltu jako kofaktor. Vhodné sloučeniny kobaltu, které poskytují ionty kobaltu, jsou soli Co²⁺ nebo Co³⁺. Příklady solí Co²⁺ a Co³⁺ chloridy, sulfáty a acetáty kobaltu.

Účelně se jako sloučenina kobaltu použije sůl Co²⁺, jako např. CoCl₂· Kultivace se může také provádět v přítomnosti vitaminu B12 spolu s kovovým kobaltem nebo jinými sloučeninami kobaltu, které vytvářejí iont kobaltu in šitu. Účelně se použije sloučenina kobaltu v množství od 1 do 10 mg/1, výhodně od 1 do 3 mg/1.

Obvykle se kultivace provádí při teplotě od 20 do 50 °C a při hodnotě pH mezi 5 a 8,výhodně od 30 do 45 °C a mezi pH 5,5 a 7,5.

Vlastní biotransformace se může uskutečnit pomocí mikroorganismů rodu Actinomadura, Amycolatopsis, pomocí enzymového extraktu z těchto mikroorganismů nebo pomocí čištěné nitrilhydratázy z těchto mikroorganismů. Účelně se biotransformace provádí s mikroorganismy druhu Actinomadura spadix, například s izoláty Actinomadura spadix E3733, Actinomadura spadix E3736, Actinomadura spadix 45A32, Actinomadura spadix 4501 nebo Actinomadura spadix C15. Výhodně se biotransformace uskutečňuje s mikroorganismy druhu Amycolatopsis NE 31 a Amycolatopsis NA40 nebo jejich funkčně ekvivalentními variantami nebo mutanty. Obvzláště výhodně se používají* mikroorganismy druhu Amycolatopsis NA40. Mikroorganismy uvedených druhů byly uloženy podle Budapešťské úmluvy 03.06.1997 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig pod označením Amycolatopsis NE 31 a Amycolatopsis NA40 a dostaly číslo uložení DSMZ 11616, popř. DSMZ 11617. Oba tyto mikroorganismy byly přesněji identifikovány a jsou zařaditelné jako druhy rodu Amycolatopsis, které nejsou v literatuře ještě popsány.

• · • · · ·

Vynález se tedy také týká mikroorganismů rodu Amycolatopsis nebo Aetinomadura, které jsou schopné přeměnit nitril na amid, zejména mikroorganismy s označením Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) a Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616).

Dále bylo zjištěno, že speciální mikroorganismy rodu Rhodococcus mají lepší vlastnosti pro přeměnu nitrilů na amidy než mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous JI popsaný v EP-A- 0 362 829. Tyto mikroorganismy jsou Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF270 (DSMZ 12211) a Rhodococcus GF376 (DSMZ 12175) nebo jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty. Mikroorganismus DSMZ 12175 byl uložen 15.5.1998 a mikroorganismus DSMZ 12211 dne 8.6.1998 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH podle Budapešťské smlouvy. Kmeny Rhodococcus GF270, GF376, GF473, GF578 a GF674 byly přiřazeny rodu Rhodococcus na základě identifikace v literatuře dosud nepopsaných druhů. Vynález se tedy také týká mikroorganismů Rhodococcus GF270, Rhodococcus GF376, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF578 a Rhodococcus GF674.

Oproti mikroorganismům rodu Aetinomadura, popř. Amycolatopsis se mikroorganismy rodu Rhodococcus účelně před vlastní reakcí indukují. Jako induktory jsou vhodné induktory popsané v EP-A-0 307 926, jako například acetamid, amid kyseliny máselné, methakrylamid, amid kyseliny propionové, krotonamid a amid kyseliny valerové.

Pod pojmem funkčně ekvivalentní varianty a mutanty se rozumějí mikroorganismy,' které se odvozují od shora uvedených původních organismů a mají v podstatě stejné vlastnosti a funkce. Takové varianty a mutanty mohou vzniknout náhodně, např. UV ozářením nebo vlivem mutagenních chemikálií.

• · · · · ·

Identifikace Amycolatopsis NA40 barva vzduch-mycela barva substrát-mycela barva difund. pigment cukerné spektrum ARA GAL MAD XYL GLU RIB typ DAP menachinony (v %)

8/4 9/0 9/2 9/4 9/6 9/8 homologie 16S rDNA fosfolipidy jako

PE,OH-PE,lyso PE,met PE, PC,NPG,PI,PIM,PG,DPG,GL mastné kyseliny iso 16 iso 15 iso 17 anteiso 15 anteiso 17 10-me 16 10-me 17 2-OH 15 2-OH 16 typ

MS bílá oranžová tr +

A

DL ( + ) +

+++

96,9 % nezjištovány +++ +

( + ) ( + ) ( + ) +

+ +

3f

- 6 Identifikace Amycolatopsis NE31 barva vzduch-mycela bílá barva substrát-mycela oranžová barva difund. pigment cukerné spektrum

ARA +

GAL +

MAD

XYL

GLU tr

RIB + typ A

DAP DL menachinony (v %) 8/4 9/0 9/2 9/4 9/6 9/8 ( + ) +

+++ homologie 16S rDNA 96,1 % fosfolipidy jako

PE,OH-PE,lyso PE,met PE, PC,NPG,PI,PIM,PG,DPG,GL nezjišťovány mastné kyseliny iso 16 +++ iso 15 + iso 17 (+) anteiso 15 (+) anteíso 17 (+)

10-me 16

10-me 17 +

2-OH 15 +

2-OH 16 · + typ

MS • · · · • ♦ · · • · · * • · · · ·· ·· • · · ·

- 7 • · · A · · · · • A · · · · · · · • · · · · A · ·

A A A · A «

AA AAAA «Α AA

Zkratky a vysvětlení pro identifikaci

( + )	1-5 %
+	5-15 %
++	15-30 %
+++	>30 %
DAP	kyselina diaminopimelová
ARA	arabinosa
GAL	galaktosa
MAD	madurosa
XYL	xylosa
GLU	glukosa
RIB	ribosa
cukerné typy podle	Lechevalier a spol. 1971
mastně kyselinové	typy podle Kroppenstedt 1985 a 1992
9/4	MK-9 (H₄)
9/6	MK-9 (Ηθ)
9/8	MK-9 (Hg)
MS	kyselina mykolová
PE	fosfátidylethanolamin
OH-PE	hydroxy-PE
met PE	fosfatidimethylethanolamin
PC	fosfatidylcholin
NPG	fosfatidylglukosamin
PI	fosfatidylinositol
PIM	fosfatidylinositolmannosid
PG	fosfatidylglycerol
DPG	difosfatídylglycerol
GL	glykolipidy
mastné kyseliny
iso-16	kyseliny iso-hexadekanové nebo 14methyl-pentadekanové
10-me-18	kyselina tuberkulostearová
2-OH-16	kyselina 2-hydroxypalmitová

- 8 • · « · • · · · · · · ····, • · · · · « ···· • · · ··· · · · « • · * · · ···· β · · ·

Identifikace GF270, GF376, GF473, GF578 a GF674

Identifikace těchto kmenů spočívá na 5 na sobě nezávislých vlastnostech

1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které dezintegrují do částic podobných tyčinkám a sporům. Kolonie GF270 a GF376 jsou lososově růžové barvy (RAL 3022) a GF578 a GF674 světle červené (RAL 3012).

2. Diaminokyseliny peptidoglykanu: kys. meso-diaminopimelová

3. Kyseliny mykolové: mykolové kyseliny mikroorganismu

Rhodococcus: Stanovení mykolových kyselin s dlouhým řetězcem se uskutečnila pomocí vysokoteplotní plynové ehromatografie. Eluční profily mykolových kyselin od GF270 a GF376, stejně jako GF473, GF578 a GF674 byly identické. Délka mykolových kyselin pro GF270 a GF376 byla C₃₈~C₄₆ a pro GF473, GF578 a GF674 byla C_4Q-C₄₈. Vzorky mykolových kyselin byly srovnány se vzorky mykolových kyselin kmenu Rhodococcus. GF270 byl identifikován jako patřící k Rhodococcus rhodochrous s velmi nízkým korelačním faktorem (0,086). GF376 nemohl být touto metodou identifikován.

Ostatní tři isoláty GF473, GF578 a GF674 byly identifikovány jako náležející k Rhodococcus ruber s velmi malým koleračním faktorem.

4. Vzorek mastných kyselin: mastné kyseliny včetně mastných kyselin je Rhodococcus a blízké Dietzia, Tsukamurella Identifikace na úrovni kvantitativními rozdíly GF376, GF473, GF578 a druhů Rhodococcus.

nerozvětvené nasycené a nenasycené kyseliny tuberkulostearové. Vzorek diagnostický pro všechny rody příbuzné Mycobacterium, Nocardia, a některé druhy Corynebakterií.

druhu se získala kvalitativními a ve vzorku mastných kyselin z GF270, GF674 a vzorku mastných kyselin z

5. Částečné sekvence 16S r DNA GF270 a GF376 byly identické (100 %), přestože jejich srovnání se kmeny Rhodococcus mělo jen 99,1 %ní podobnost k nejblíže příbuznému Rhodococcus rhodochrous. GF473 a GF578 byly identické ve své sekvenci 16S r DNA (100 %). GF674 je rozdílný od GF578 pouze v jednom páru baží z 500 (99,8 %). Všechny tři isoláty ukázaly jen vzdálenou příbuznost k Rhodococcus coprophilus (98,4 %).

Na základě chemotaxických a molekulárněbiologických výsledků lze vyvodit, že GF270, GF376 na jedné straně a GF473, GF578, GF674 na druhé straně jsou kmeny 2 nových druhů Rhodococcus. GF270 a GF376 jsou blízce příbuzní k Rhodococcus rhodochrous ve své 16S r DNA (99,1 %), naproti tomu jsou GF473, GF578, GF674 jen vzdáleně příbuzní k

Rhodococcus coprophilus (98,4 %).

Enzymový extrakt lze získat pomocí v oboru běžně používaného otevření mikroorganismů, jako například otevřením pomocí ultrazvuku, pomocí Frenchovy tlakové metody nebo lysozymové metody. Tento enzymový extrakt jako i samozřejmě celé buňky mikroorganismu mohou být pro provedení způsobu imobilizovány na vhodném nosiči, obvykle uloženém na polymeru, nebo mohou být absorbovány na vhodném nosiči.

Enzymy s nitrilhydratázovou aktivitou podle vynálezu je možné získat z mikroorganismů rodu Amycolatopsis a jsou schopné přeměňovat nitril na amid. Zejména je lze získat z Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617).

Tyto enzymy vykazují zejména následující vlastnosti:

a) pH-optimum pH 6,5±l,0

b) teplotní optimum mezi 35 a 40 °C při pH 7,0

c) hodnotu K_M pro substrát 3-kyanpyridin 41,7±7,7 mM (20 °C, 45 mM fosfátového pufru, pH 7,0) zejména mají enzymy

d) molekulovou hmotnost 106 kDa, jak například stanoveno pomocí SDS-PAGE.

- 10 Jako substráty pro biotransformaci lze použít obecně nitrily. Účelně se používají bud' alifatické nitrily s 1 až 10 atomy uhlíku, popř. substituované například skupinami hydroxy, amino, halogen nebo karboxy, nebo subsitutované nebo nesubstituované aromatické nitrily se 4 až 10 atomy uhlíku v aromatickém kruhu. Jako alifatické nitrily s 1 až 10 atomy uhlíku se mohou použít dinitrily, hydroxynitrily, aminonitrily jako např. oktannitril, kyselina kyanoctová, isokapronitril, n-valeronitril, adiponitril, glutaronitril, sukcinontril, sebakonitril, propionitril, krotonitril, akrylnitril, methakrylnitril, nitril kyseliny n-máselné nebo acelanitril. Jako aromatické nitrily se 4 až 10 atomy uhlíku se mohou použít nitrily obecného vzorce I nebo II

Γ&)-CN

ve kterém R¹ a R² znamená atom vodíku, atom halogenu nebo C₁_₄alkyl. Jako atom halogenu se může použít F, Cl, Br nebo J.

Jako C₁_₄-alkyl se může použít methyl, ethyl, propyl, isopropyl, ter. propyl, butyl, isobutyl nebo terč. butyl. Účelnými zástupci aromatických nitrilů obecných vzorců I nebo II jsou 2-, 3- nebo

4-kyanpyridin, benzonitril, fluor-, chlor-, brombenzonitril, jako např. o-, m-, p-chlorbenzonitril nebo 2-chlor-3-kyanpyridin. Výhodně se jako aromatický nitril se 4 až 10 atomy uhlíku používá 3-kyanpyridin.

Účelně se biotransformace provádí při jednorázovém nebo kontinuálním přidávání substrátu tak, aby koncentrace substrátu nepřesáhla 40 % hmotn., výhodně 30 % hmotn.

Účelně se způsob provádí s buňkami v klidu (které nerostou).

Jako media pro biotransformaci jsou vhodná obvykle používaná v oboru, jako například nízkomolární fosfátový pufr, HEPES-pufr, citrátový pufr, borátový pufr, media uvedená v tabulce 1 až 3, * * 9 9 9 · « · « • · · « · 9 9 9 • · ♦ · ♦ · ·*·« <· 9 99 9999 99 99

- 11 popř. jejich odvozená forma, jako např. media popsaná v příkladu 8 (1) nebo TRIS/HC1 pufr.

Účelně se biotransformace provádí při teplotě od 0 do 50 °C a při hodnotě pH mezi pH 4,5 a pH 10, výhodně při teplotě od 20 do 40 °C a při hodnotě pH mezi pH 4,5 a pH 10,0.

V obzvláště výhodném provedení se může biotransformace uskutečnit v přítomnosti C₁_₄-alkoholu. Jako C'₁_₄-alkoholy se mohou použít methanol, ethanol, propanol nebo butanol. Výhodně se používá methanol.

Po reakci se pak mohou odpovídající amidy isolovat obvyklými metodami zpracování, jako například krystalizací.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kultivace mikroorganismů rodu Actinomadura a Amycolatopsis

a) Různé vzorky půdy byly v obohacovacím mediu podle tabulky 1 naočkovány různými nitrily nebo amidy jako zdroje uhlíku a dusíku a nechaly se 7-10 dnů při 37 nebo 45 °C. Pak se kultury přeočkovaly ve stejném mediu a ještě jednou kultivovaly 7-10 dnů při 37 °C. To celé se třikrát opakovalo. Pak se kultury zředily a rozprostřely, aby se získaly jednotlivé kolonie. Desky se nechaly 5 dnů při 37 °C. Pak se rozdílné kolonie testovaly na požadovanou aktivitu.

Takto se isolovaly Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) a Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) a pak se pěstovaly v optimalizovaném mediu (tabulak 3) 90-100 hod. za třepání při 37 °C.

Pro Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616), Actinomadura spadix E3733 a Actinomadura spadix E3736 sloužil adiponitril jako zdroj uhlíku a dusíku, pro Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617),

- 12 • 9 9 9 9 · 99 «· • 9 9 9 9 9 9 «<• 9 9 9 « • 99 9 9 9 9 « 9 9 9 9 «

9 9 · 99··

99 « 9 9 ·

9 9 »

9 9 9

9 9 *

9 9 9

Actinomadura spadix 45A32 sloužil acelanitril jako zdroj uhlíku a dusíku, pro Actinomadura spadix 4501 sloužil n-oktanitril jako zdroj uhlíku a dusíku a pro Actinomadura spadix C15 sloužil kyanoctan jako zdroj uhlíku a dusíku.

b) Amycolatopsis NA40 se pěstoval v mediu podle tabulky 3. Kultivovalo se v subkulturách (4 ml/trubičku) a v hlavní kultuře (500 ml/baňku) za aerobních podmínek při teplotě 37 °C 2 popř. 3 až 4 dny. Buněčný růst se měřil turbimetricky při 610 nm a suchá váha buněk se spočítala následovně: hmotnost suchých buněk v mg/ml=OD_610nm x 0,277.

Tabulka l

Obohacovací medium
nitril	2,0	g
kh₂po₄	7,0	g
MgSO₄.7H₂O	0,1	g
směs vitaminů	1,0	ml
CoC1₂.6H₂0	2,0	mg
FeSO₄.7H₂O	2,0	mg
doplnit vodou na 1 1	(pH 6,	7-7,3)
Tabulka 2

Základní medium

maltosa	2,0	g
NaN0₃	1,0	g
k₂hpo₄	0,1	g
MgSO₄.7H₂O	0,05	¹ g

doplnit vodou na 100 ml (pH 7,0)

- 13 ·· ·«·· ·» ·· « · · · « · · · ♦ · · ♦

Tabulka 3

Optimalizované medium

D-glukosa	4,5 g
masový extrakt	0,5 g
k₂hpo₄	o,i g
MgSO₄.7H₂O	0,05 g
CoCl₂.6H₂O	1,0 mg

doplnit vodou na 100 ml (pH 7,0)

Příklad 2

Biotransformace pomocí mikroorganismů rodu Actinomadura a Amycolatopsis (1) Pro stanovení aktivity nitrilhydratázy se inkubovala reakční směs (2 ml) 3-kyanpyridin (1,0 M, 1,0 ml), kaliumfosfátový pufr (pH 7,0, 0,1 M, 0,5 ml) a 0,5 ml buněčné suspenze za míchání při 20 °C po dobu 30 min. Reakce se ukončila přidáním 0,2 ml 3 N HCl. Po krátkém odstředění se vytvořený nikotinamid stanovil pomocí HPLC (systém Schimadzu SPD 6A se sloupcem C18 (Develosil ODS-HG-5,4,6x250 cm); průtokový prostředek: 10 mM KH₂PO₄/H₃PO₄ (pH 2,8)/acetonitril 9:1 (objem/objem); průtoková rychlost: 1 ml/min; absorpce se měřila při 230 nm). Specifická aktivita se vyjádřila jako μιηοΐ vytvořeného nikotinamidu/ml/min/OD_610nm.

Poměry přeměny alifatických nitrilů v obohacovacím mediu (tabulka 1) s izolovanými bakteriemi je shrnuto v tabulce 5, vliv induktorů a kofaktorů v základním mediu (tabulak 2) je shrnut v tabulce 4 a srovnání aktivity Amycolatopsis ku Rhodococcus v základním mediu (tabulka 2) je shrnuto v tabulce 6. Výsledky z tabulky 4 ukazují, že nitrilhydratáza z Amycolatopsis NA40 je konstitutivně exprimována, ale pro aktivitu je nutný kofaktor kobalt.

Φ Φ φ φ φ · • * · φφ φ φφ ΦΦΦΦ φφ φφ • φ · · • » · φφφ «φ ΦΦΦΦ • φ φφ φ ♦ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ (2) Vliv teploty na růst NA40

Subkultury (2 ml) byly inkubovány v mediu podle tabulky 3 po dobu 2 dny při 37 °C, ty se pak přeočkovaly do baněk třepačky s 20 ml media podle tabulky 3. Kultivovalo se při 37, 40, 45, 50 a 55 °C po dobu 3 až 4 dnů za třepání. Měřil se buněčný růst a aktivita nitrilhydratázy

Tabulka 7 ukazuje vliv teploty na a na buněčný růst.

se zjišťovala při 20 ^UC. aktivitu nitrilhydratázy

Tabulka 4

Vliv induktorů a kofaktorů na specifickou aktivitu v základním mediu

lnduktor	Růst (OD610 nm)	Celková aktivita (μπιοί/ιηΐ/πιΐη)	Specifická aktivita (μιηοΐ/ml/min/OD)
-	1,26	20,9	16,6
ť-kaprolaktam	0,66	9,52	14,5
krotonamid	3,41	22,9	6,72
methakrylamid	3,33	2,46	0,74
butyramid	2,19	0,19	0,88
propionamid	1,91	0,92	0,48
močovina	1,72	2,97	1,73

Kofaktor	Růst (OD610 nm)	Celková aktivita (μιηοΐ/ml/inin)	Specifická aktivita (μπιοΐ/ml/min/OD)
-	7,97	0,10	0,01
FeSO₄.7H₂O	8,32	3,36	0,40
CoC1₂.6H₂O	8,41	47,8	5,68

Tabulka 5

Reakční poměry alifatických nitrilů s izolovanými bakteriemi

Kmeny	Substráty (01	Růst 3610 nm)	Celková aktivita (μπιοί/ml/min)	Specifická aktivita (μπιοί/ml/ min/OD)
Amycolatopsis NE31 (DSMZ11616)	adiponitril	2,68	0,377	0,141
Actinomadura spadix E3733	adiponitril	1,62	0,347	0,214
E3736	adiponitril	1,36	3,00	2,21
45A32	acelanitril	5,81	18,8	3,23
4501	n-oktannitril	7,24	32,2	4,45
C15	kys. kyan- octová	2,04	7,01	3,43
Amycolatopsis NA40 (DSMZ11617)	acelanitril	5,92	33,0	5,57

·· »«·· • «

• · · * · · • · · · · • · · · · · • 9 9 9 9

9999 99 99

- 16 Tabulka 6

Aktivita Amycolatopsis ve srovnání s Rhodococcus rhodochrous JI

	mikroorganismus Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) (μmol/ml/min)	mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous JI
aktivita pro 3-kyanpyridin	303	314
	vyčištěný enzym z NA40 (μιηοΐ/min/mg proteinu)	vyčištěný enzym z JI (μιηοΐ/min/mg proteinu)
aktivita pro 3-kyanpyridin	1110	371

(3) Ke stanovení aktivity NA40 vůči více substrátům se buňky o hmotnosti sušiny 0,0388 mg inkubovaly ve shora uvedeném pufru. Reakce byla zahájena přidáním odpovídajícího substrátu a 10 min. se inkubovalo za třepání při 20 °C. Reakce byla ukončena přidáním 0,2 ml 2N HCl a reakční směs se krátce odstředila. Supernatant se analyzoval pomocí HPLC nebo plynové chromatografie. Tabulka 8 ukazuje podmínky testu vzhledem ke substrátové specifitě a tabulka 9 ukazuje substrátovou specifitu buněk NA40 v klidu pro různé substráty.

Jednotlivé podmínky testu jsou shrnuty v tabulce 8 a výsledky jsou v tabulce 9.

·· ····

Tabulka 7

Vliv teploty při růstu na aktivitu nitrilhydratázy a na růst buněk

Teplota	Růst (mg/ml)	Celková aktivita (μπιοί/ιηΐ/ΐϊΐίη)	Specifická aktivita (μπιοί/ιτιΐ/ min/mg)	Relativní aktivita (%)
3 7 °C	6,16	4,96	0,761	100
40 °C	5,79	9,89	1,71	225
45 °C	6,56	4,83	0,736	97
50 °C	5,96	1,16	0,195	26

Tabulka 8

Podmínky testu vůči substrátové specifitě

Substrát.	Substrát (mM)	Metoda analýzy	Vytvořený amid
3-kyanpyridin	1,0	HPLC	nikotinamid
2-kyanpyridin	0,25	HPLC	2-pikolinamid
4-kyanpyridin	0,25	HPLC	pyridin-4-karboxamid
krotonitril	0,4	HPLC	krotonamid
benzonitril	0,03	HPLC	benzamid
akrylonitril	0,4	HPLC	akrylamid
o-chlorbenzonibril	0,15	HPLC	' o-chlorbenzamid
m-chlorbenzonitril	0,15	HPLC	m-chlorbenzamid
p-chlorbenzonitril	0,15	HPLC	p-chlorbenzamid
2-chlor-3-kyanpyridin	0,15	HPLC	2-chlornikotinamid
acetonitril	0,4	GC	acetamid
propionitril	0,4	GC	propionamid
methakrylnitril	0,4	GC	methakrylamid
n-butyronitril	0,4	GC	n-butyramid

o-,m-,p-chlorbenzonitril a 2-chlor-3-kyanpyridin se rozpustil v ·· 44 • «4 4

• 4

- 18 • · · · 4 · 4

4· 44·· 44 44 methanolu a přidal k reakční směsi

Tabulka 9

Substrátová specifita NA40 nitrilhydratázy

Substrát	rr Relativní \|\| aktivita \|\| (%) 11 1 1	Substrát	Relativní aktivita (%)
3-kyanpyridin	1 1 íoo \| \|	m-chlorbenzonitril	75
4-kyanpyridin	168 I I	p-chlorbenzonitril	16
2-kyanpyridin	128 I I	2-chlor-3-kyanpyridin	126
benzonitril	51 1 1	aeetonitril	-
krotonitril	52 \| \|	propionitril	105
akrylnitril	115 11	methakrylnitrii	130
o-chlorbenznitrii	96 \| \| 1 1	butyronitril	194

(4) Teplotní optimum a teplotní stabilita v buňkách v klidu

Reakce se prováděla 10 min. ve standardní reakční směsi. Teplotní optimum bylo mezi 35 a 40 °C (Obr. 5). Pak se buňky 30 min. inkubovaly při různých teplotách a testovala se aktivita při standardních reakčních podmínkách. Jak je patrno z Obr. 4 je teplotní stabilita ca při 40 °C.

(5) pH optimum á pH stabilita v buňkách v klidu

Pro toto se reakce prováděla 10 min. ve standardní reakční směsi, ve které byl kaliumfosfátový pufr vyměněn různými 0,1 M pufry. Jak je patrné z Obr. 6 je pH optimum mezi 4,5 a 10. Potom, co byla buněčná suspenze inkubována 30 min. při různých hodnotách pH při 20 °C, se buňky odstředily. Pak se buňky promyly a resuspendovaly v 0,1 M kaliumfosfátovém pufru pH 7,0. Reakce se prováděla 10 min přidáním 3-kyanpyridinu za standardních podmínek. Enzym byl stabilní

999 ·

- 19 mezi pH 4,5 a pH 10,0 (Obr. 7).

(6) Akumulace nikotinamidu z 3-kyanpyridinu pomocí NA40

Reakce se prováděla v reakční směsi (30 ml), která obsahovala 500 mM 3-kyanpyridinu, 40 mM kaliumfosfátového pufru (pH 7,0) a buňky v klidu (hmotnost sušiny 2,3 mg). Během reakce se 7krát přidal 3-kyanpyridin (500 mM), když byl spotřebován. Během 15 hod. se takto přidalo 4,0 M 3-kyan pyridinu, vytvořilo se 3,89 M (475 g/1) nikotinamidu, což odpovídá výtěžku 97,3 %. Nevytvořila se kyselina nikotinová.

Příklad 3

Identifikace mikroorganismů rodu Amycolatopsis

Následujících 5 chemotaxonomických znaků podpořilo identifikaci:

1. Diagnostická aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelová

2. Diagnostické cukry: arabinosa a galaktosa

3. Kyseliny mykolové: chybí kyseliny mykolové

4. Menachinony: MK-9(H₄)

5. Vzorek mastných kyselin: iso/anteiso-rozvětvené a 2-hydroxymastné kyseliny, malá množství 10-methylrozvětvených mastných kyselin byla dodatečně prokázána. Tento vzorek mastných kyselin byl nalezen u všech zástupců rodu Amycolatopsis (vzorek mastných kyselin 3f).

Kombinace těchto chemických znaků je diagnostický pro všechny druhy rodu Amycolatopsis.

Údaje pro mastné kyseliny obou kultur se pomocí analýzy hlavních složek srovnávaly s údaji databanky mastných kyselin. Touto metodou byl NE31 a také NA40 přiřazen rodu Amycolatopsis, avšak idetifikace druhu nabyla možná, protože byl kolerační faktor příliš nízký. Srovnání vzorku mastných kyselin obou kmenů ale také ukázalo, že se jedná o dva kmeny různých druhů.

····

* · · · · ···· «« »»

- 20 Výsledek byl potvrzen výsledky sekvenční analýzy 16S rDNA. Také zde došlo k přižazení k rodu Amycolatopsis, avšak k žádnému popsanému druhu Amycolatopsis. Při této metodě se sekvence 16S rDNA určovala přímým sekvenováním PCR amplifikovaného genu 16S rDNA. Diagnostická část sekvence 16S rDNA byla srovnávána se sekvencemi typových druhů rodu Amycolatopsis a taxa příbuznými. Výsledek ukázal, že kmen náleží rodu Amycolatopsis. Největší souhlas 96,9 % (NA40) a 96,1 % (NE31) byl nalezen k Amycolatopsis methanolica. Mezi sebou prokazovaly oba isoláty 99,0 %ní souhlas v sekvencích. Naše studie týkající se zástupců rodu Amycolatopsis ukázaly, že pro dobrou identifikaci druhu by musel být kolerační faktor vyšší než 99,5 %. Protože hodnota 96,9 % leží zřetelně pod 99,5 %, je z toho možné vyvozovat, že se u obou izolátu nejedná o zástupce známých druhů Amycolatopsis.

Na základě předložených výsledků, nebylo možné izoláty přiřadit známým druhům Amycolatopsis. Vycházeli jsme z toho, že se u NA40 a NE31 jedná o kmeny dvou nových dosud nepopsaných druhů rodu Amycolatopsis.

Identifikační charakteristika mikroorganismů rodu Amycolatopsis barva vzduch-mycela barva substrát-mycela barva difund. pigment cukerné spektrum

ARA +

GAL ' +

MAD

XYL

GLU v

RIB + typ A

DAP DL menachinony (v %)

8/4

9/0 (+)

9/2 +

9/4 +++

- 21 ·· ···· • · • * » · • · ·« • « • · ♦ · r* ·»»· ·· ·· • < · « • · · · * · « · · • · « · ·»

9/6	-
9/8	—
homologie 16S rDNA	>99,5	%
fosfolipidy
PE	+
OH-PE	+
lyso PE	-
met PE	-
PC	-
NPG	-
PI	+
PIM	V
PG	+
DPG	+
GL	—
typ	II+OH-	•PE
mastné kyseliny
iso 16	+++
iso 15	+
iso 17	( + )
anteiso 15	+
anteiso 17	( + )
10-me 16	( + )
10-me 17	+
2-OH 15	+
2-OH 16	+
typ	3f
MS	-

Příklad 4

Čištění nitrilhydratázy z mikroorganismů NA40

Kmen se kultivoval 3 dny v mediu podle tabulky 3 při 37 °C. Buňky 2 1 kultury se získaly odstředěním a pak se resuspendovaly v 0,85 % roztoku NaCl. Pak se buňky převedly do 0,1 M kaliumfosfátového pufru(pH 7,0), který obsahoval 44 mM kyseliny n-máselné, a působilo se ultrazvukem. Buněčný extrakt se odstředil a buněčné zbytky se odstranily. Tento extrakt se použil pro čištění enzymu. Během celého čištění se používal kaliumfosfáto- vý pufr (pH 7,0), který obsahoval 44 mM kyseliny n-máselné. Jak je vidět ·« ····

- 22 z tabulky 10, enzym se čistil ve třech krocích až k homogenitě.

Tabulka 10

Čištění nitrilhydratázy z NA40

	Celková aktivita (Units)	Protein celkem (mg)	Specifická aktivita (U/mg)	Obohacení
Bezbuněčný
extrakt	73300	1020	71,9	1
DEAE-Sephacel	68000	110	620	8,62
Fenyl-TOYOPEARL	64800	61,4	1105	15,4

Unit: množství enzymu, které katalýzu je tvorbu 1 μπιοί nikotinamidu/min při 20 °C

Příklad 5

Charakterizace nitrilhydratázy (1) Určeni molekulové hmotnosti, struktury podjednotek a obsahu iontů kobaltu

Molekulová hmotnost se stanovila 106 kDa pomocí chromatografie na TSK-gelovém sloupci G3000 SW (0,75x60 cm) za použiti 0,1 M kaliumfosfátového pufru (pH 7,0) s 0,2 M KC1 a 44 mM kyseliny n-máselné. Zjistilo se, že se enzym skládá ze 2 různých podjednotek a a β, jejichž molekolová hmotnost byla stanovena jako 30000 a 26000.

Obr. 1 ukazuje stanovení molekulové hmotnosti pomocí chromatografie na TSK-gelu G3000 SW.

Obr. 2 ukazuje stanovení molekulové hmotnosti pomocí SDSPAGE

Obr. 3 ukazuje absorpční spektrum čištěného enzymu. Byla • · • 9

- 23 pozorována široká absorpce 300-400 nm.

(2) Substrátová specifita čištěného enzymu

Stanovení substrátové specifity se provedlo analogickým způsobem jako v příkladu 2(1). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 11.

Tabulka 11

Substrátová specifita čištěné nitrilhydratázy

Substrát	(M) Celk. aktivita	Relativní aktivita (%)
	(μπιοί/ml/min)	Reakce enzymu	Reakce s buň· kami v klidu
3-kyanpyridin	1,0	17,7	100	100
2-kyanpyridin	0,25	39,1	221	128
4-kyanpyridin	0,25	31,6	179	168
krotonitril	0,4	11,9	67	52
benzonitril	0,03	11,3	64	51
akrylonitril	0,4	16,6	94	115
o-chlorbenzonitril	0,15	22,4	127	96
m-chlorbenzonitril	0,15	15,9	90	75
p-chlorbenzonitril	0,15	2,30	13	16
2-chlor-3-kyan-
-pyridin	0,15	16,0	90	126
acetonitril	0,4	-	-	-
propionitril	0,4	39,3	222	105
methakrylnitrii	0,4	22,1	125	130
n-butyronitril	0,4	17,9	101	194

1,7 jednotek (U) enzymu se přidalo k reakční směsi (2,0 ml). Reakční směs obsahovala určitý substrát v 45 mM fosfátovém pufru (pH 7,0).

• ·

- 24 (3) Určování hodnoty K_M

Hodnota K_M se podle diagramu Lineweaver-Burk určila pro 3-kyanopyridin 41,7 mM a pro akrylonitril 3,7 mM. Srovnáním s Rhodococcus rhodochrous JI, který má hodnotu K_M u 3-kyanpyridinu 200 mM, je tato hodnota u NA40 podstatně menší. To je jedna z hlavních výhod NA40.

(4) Teplotní stabilita a teplotní optimum

Čištěný enzym se 30 min. inkuboval při pH 7,0 při různých teplotách a pak se měřila přeměna 3-kyanpyridinu na nikotinamid 1 min při 20 °C. Enzym byl inaktivován při teplotě větší než 40 °C. Teplotní stabilita byla jako u buněk v klidu při ca. 40 °C, teplotní optimum bylo mezi 35 a 40 °C (Obr. 5).

(5) pH optimum a pH stabilita

Pro tento účel se reakce 3-kyanpyridinu za vzniku nikotinamidu prováděla při 20 °C v reakční směsi (2,0 ml), která obsahovala různé pufry (42,5 mM), 1,71 Units čištěného enzymu a 500 mM 3-kyanpyridinu. pH optimum bylo ca při pH 6,5+1,0 (Obr.8).

Pro stanovení pH stability se inkubovalo 4,2 Units čištěného enzymu v různých pufrech (45 mM) při 20 °C 1 hodinu. Část inkubovaného roztoku 1,71 Units se přidala ke standardní reakční směsi (srovnej Příklad 2(1)). Stanovila se zbylá aktivita. Enzym byl stabilní v rozsahu pH 5-9. Výsledek je vyznačen na Obr. 9.

(6) Inhibitory

Byl zjišťován účinek různých inhibitorů. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 12.

• · • ·

- 25 Tabulka 12

Vliv různých inhibitorů na čištěný enzym

Inhibitor	mM	Relativní aktivita (%)
N-ethylmaleinimid	1	100 97
kyselina jodoctová	1	39
kyselina 4-chlorměd'natobenzoová	0,1	69
natriumazid	1	59
hydroxylamin	1	37
fenylhydrazin	1	8
semikarbazin	1	82
tiron (dvojsodná sůl 4,5-dihydroxy- 1,3-benzendisulfonové kyseliny)	1	110
o-fenantrolin	1	89
a- , a ¹-dipyridyl	1	100
8-hydroxychinolin	1	110
EDTA (kys. ethylendiamintetraoctová)	1	115
diethyldithiokarbamát	1	89

Příklad 6

Vliv methanolu na buňky v klidu NA40

Reakce se prováděla 10 min. v přítomnosti 0-20 % (objem/objem) methanolu podle tabulky 13. Jak ukazuje tabulka 14, aktivita se zvyšuje přidáním 5-15 % methanolu.

• · · · · · • · • ·

- 26 Tabulka 13

Reakce s buňkami v klidu

Metody

	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)
1,0 M 3-kyanpyridin	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml
0,1 Μ KPB* (pH 7,0)	0,9 ml	0,8 ml	0,7 ml	0,6 ml	0,5 ml
methanol	-	0,1 ml	0,2 ml	0,3 ml	0,4 ml
buněčná suspenze	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml
celkový objem	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml

*KPB=kaliumfosfátový pufr

Tabulka 14

Vliv methanolu na Amycolatopsis NA40

Metody	Methanol [% (obj./obj.)]	Relativní aktivita [%]
(1)	0	100
(2)	5	123
(3)	10	128
(4)	15	130
(5)	20	105

• · · · • 9 • 9

9

9* • 9 ·

9 9

- 27 Příklad 7

Obohacení mikroorganismů rodu Rhodococcus

Různé vzorky půdy se v obohacovacím mediu podle tabulky 1 naočkovaly kyselinou kyanoctovou jako zdrojem uhlíku a dusíku a podle příkladu 1 se izolovaly mikroorganismy Rhodococcus GF270, GF578, GF473 a GF376.

Příklad 8

Biotransformace s mikroorganismy rodu Rhodococcus (1) Tepelná stabilita mikroorganismů Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF270 a Rhodococcus GF376 ve srovnání s Rhodococcus rhodochrous JI.

Pro určení tepelné stability se shora uvedené mikroorganismy kultivovaly v následujících mediích.

Rhodococcus rhodochrous JI se kultivoval 72 hod. v mediu popsaném v EP-A-0 307 926. Mikroorganismy Rhodococcus GF674 GF578, GF270 a GF376 se kultivovaly v následujících mediích při pH 7,0 až 96 hod.

Rhodococcus GF674 v mediu obsahujícím extrakt kvasnic 1,0 g/1, fruktosu 5,0 g/1, extrakt sladu 10,0 g/1, acetamid 5,0 g/l,KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a CoCl₂.6H₂0 10,0 mg Rhodococcus GF578 v mediu obsahujícím extrakt kvasnic 1,0 g/1, fruktosu 15,0 g/1, extrakt sladu 10,0 g/1, acetamid 25,0 g/1, KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a CoCl₂.6H₂0 5,0 mg.

Rhodococcus GF270 v mediu obsahujícím extrakt kvasnic 12,5 g/1, natriumcitrát 5,0 g/1, methakrylamid 7,5 g/1, KH₂P0₄2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a CoCl₂.6H₂0 30,0 mg.

Rhodococcus GF376 v mediu obsahujícím extrakt kvasnic 1,0 g/1, natriumcitrát 10,0 g/1, extrakt sladu 15,0 g/1, butyramid 7,5 g/1, KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a

CoCl₂.6H₂0 15,0 mg.

··

- 28 Pak se nechaly buňky v klidu 15 min. při různých teplotách a pak se určila zůstatková aktivita za standardních reakčních podmínek podle příkladu 2(1).

Při tom se zjistilo, že má Rhodococcus GF674 při teplotě-50 °C relativní aktivitu téměř 100 % a při 60 °C má ještě aktivitu ca 10 %. Rhodococcus GF578 měl rovněž 100 % relativní aktivitu při 50 °C a relativní aktivitu 20 % při 60 °C. Rhodococcus GF376 měl 100 % relativní aktivitu až k 50 °C, při 60 °C měl relativní aktivitu 70 % a při 70 °C téměř 5 % relativní aktivitu. Rhodococcus GF270 měl až do 60 °C relativní aktivitu 100 % a rovněž při 70 °C ještě 5 % relativní aktivitu. Ve srovnání s tím měl Rhodococcus rhodochrous JI až k 50 °C relativní aktivitu 100 %, při 60 °C 80 % a při 70 °C již neměl žádnou aktivitu.

Lze shrnout, že Rhodococcus GF270 a GF376 mají lepší tepelnou stabilitu než JI a GF270 má nejlepší tepelnou stabilitu.

pH optimum kmenů Rhodococcus

Vliv hodnoty pH na aktivitu nitrilhydratázy kmenů Rhodococcus GF674, GF578, GF270, GF376 se zkoumal podle příkladu 2(5).

pH optimum Rhodococcus GF674 je při pH 7,5-9,5, GF578 při pH 8-8,5, GF270 při pH 6-7,0 a GF376 při pH 6-8.

(3) Subtsrátová specifita kmenů Rhodococcus

Substrátová specifita je shrnuté uvedena v tabulce 15 jako relativní aktivita.

(4) Akumulace nikotinamidu kmenů Rhodococcus

Jako v příkladu 2(6) se kmeny Rhodococcus GF674, GF578, GF270 a GF376 kultivovaly s 3-kyanpyridinem (ca 500 mM).

·· ···· ·· ·· ·· ·· « ···· ♦··· • · · ·· · ···· • a· · « · ······ • · · · * · «··· _tt · · · · · · · ·· ··

- 29 Přitom vytvořil Rhodococcus GF674 během 25 hod. 6 M nikotinamidu, Rhodococcus GF578 během 10 hod. 5,5 M nikotinamidu, Rhodococcus GF270 během 20 hod. ca 8,5 M nikotinamidu a Rhodococcus GF376 během 20 hod. 7,5 M nikotinamidu.

(5) Tolerance 3-kyanpyridinu na aktivitu kmenů Rhodococcus

Pro testování tolerance 3-kyanpyridinu, se buňky v klidu 15 min. inkubovaly při 20 °C při koncentraci 3-kyanpyridinu mezi 1 a 10 % (hmotn./obj.) a pak se buňky odstředily. Po promytí buněk 0,85 % NaCl se měřila zbylá aktivita.

Tolerence 3-kyanpyridinu jako substrátu se testovala při různých koncentracích substrátu. Bylo zjištěno, že při koncentraci substrátu 2 % (hmotn./obj.) aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus rhodochrous JI se snížila o faktor 1,4, aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF674 při koncentraci substrátu 4 % (hmotn./obj.) se snížila o faktor 1,4, aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF578 až po koncentraci substrátu 8 % zůstala téměř konstantní, aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF270 při koncentraci substrátu 4 % (hmotn./obj.) se snížila o faktor 1,17 a aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF376 při koncentraci substrátu 10 % (hmotn./obj.) se snížila o faktor 1,25.

Ve srovnání s jinými kmeny Rhodococcus měl Rhodococcus rhodochrous JI nejhorší toleranci vůči 3-kyanpyridinu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Mikroorganismy rodu Amycolatopsis nebo Aetinomadura, mající schopnost přeměňovat nitril na amid, stejně jako enzymové extrakty z nich.
2. Mikroorganismy podle nároku 1 druhu Amycolatopsis NA40 a Amycolatopsis NE31, jak jsou uloženy pod depozitním čísle DSM 11617 a DSM 11616, stejně jako jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.
3. Mikroorganismy druhu Rhodococcus GF270 a GF376, jak jsou uloženy pod depozitním čísle DSM 12211 a DSM 12175, stejně jako jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty, mající schopnost přeměňovat nitril na amid, stejně jako enzymové extrakty z nich.
4. Enzym s aktivitou nitrilhydratázy, získatelný z mikroorganismů podle nároků 1 a 2.
5. Enzym podle nároku 4, který má

a) pH optimum při pH 6,5±l,0

b) teplotní optimum mezi 35 a 40 °C při pH 7,0

c) hodnotu K_M pro substrát 3-kyanpyridin 41,7±7,7 mM.
6. Způsob výroby amidů, vyznačující se tím že se nitril jako substrát přemění na odpovídající amid pomocí mikroorganismů podle jednoho z nároků 1 až 3, enzymového extraktu z těchto mikroorganismů nebo pomocí enzymu podle nároku 4.
7. Způsob podle nároku 6, že se jako nitril alifatický nitril s 1 až vyznačující se tím použije popřípadě substituovaný

10 atomy uhlíku.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím že se jako nitril použije popřípadě substituovaný aromatický nitril se 4 až 10 atomy uhlíku v aromatickém kruhu.

Způsob podle nároku 8, v y z že se aromatický nitril zvolí I nebo II načující se tím ze sloučenin obecných vzorců kde R¹ a R² znamená atom vodíku, atom halogenu nebo ε_1-4alkyl.
10. Způsob podle jednoho z nároků 6 až 9, vyznačující se tím že se reakce provádí při teplotě od 0 do 50 °C a při pH 4,5 až 10.
11. Způsob podle jednoho z nároků 6 až 10, vyznačující se tím že se reakce provádí pomocí mikroorganismů rodu Amycolatopsis s označením NA40 (DSMZ 11617) nebo NE31 (DSMZ 11616) nebo s jejich funkčně ekvivalentními variantami nebo mutanty.