CN101735961B - 一种放线菌菌株及其在制备芳香羟胺中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株放线菌(Streptomyces thioluteus)菌株：CGMCC No.2725及其在制备芳香羟胺中的应用。菌株CGMCC No.2725易得且容易培养，菌株细胞体内存在完整的辅酶再生系统，只需加入适量的辅底物(如葡萄糖或乙醇等)，即可进行辅酶的自发循环再生，无须额外添加价格昂贵的还原型辅酶，并且整细胞的使用可以免去酶的提取纯化过程，更适合于规模化商业应用。
Description
技术领域
本发明涉及一株放线菌(Streptomyces thioluteus)菌株及其用途。
背景技术
芳香羟胺是一类重要的化合物，它们是许多精细化学品的关键性合成中间体(TetrahedronLett，2003，44：849-851)及生命活性化合物(Bioorg.Med.Chem.，2000，8：405-412)。此外，芳香羟胺本身也具有很高的药理及生理活性(Biochem.Pharmacol，1991，42：1691-1697)。
迄今，已知的制备芳香羟胺的方法包括如下几种：
(1)化学制备法
“传统”的化学还原方法主要是通过催化转移加氢或金属还原相应的硝基化合物达到制备芳香羟胺的目的(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1986，1655-1656.)。但这些“传统”的还原方法的选择性比较差，即在这些硝基还原条件下，生成的羟胺能被迅速地再被还原为胺，并且容易生成偶氮、氢化偶氮和氧化偶氮等副产物。而且，这些制备反应条件也比较苛刻，需要使用危险的高压装置、易燃的氢气、有毒的重金属或有害的化学试剂等。
中国专利(ZL 200410094645.2)提供一种还原取代硝基苯类化合物的改进方法，即以硒为催化剂，在水或有机溶剂中还原取代硝基苯类化合物。该改进改进方法虽改善了反应条件(使其更温和)，但其在操作安全性方面尚有改进余地(使用的催化剂毒性较大)。
Stephane Ung等报道了一种采用微波还原硝基来制备芳香羟胺类化合物的方法(Tetrabedron Letters.2005，46(2005)：5913-5917)，此方法以锌粉和氯化铵以水和乙醇为溶剂制成混悬液，在有微波存在及室温条件下完成制备。该方法一个显著的特点是：制备周期短。但其不适用于规模化制备。
(2)生物制备法
Feng Li，Jingnan Cui，Xuhong Qian，and Rong Zhang揭示了一种用面包酵母和植物细胞来催化制备芳香羟胺的方法(Chem.Common.，2004，2338-2339)。尽管面包酵母和植物细具有较高的催化活性和选择性，但是面包酵母和植物细胞在工业大规模生产上还存在较大问题，重现性较差。
鉴于此，探索一种制备条件温和、制备步骤简单，且选择性高和适合规模化商业制备的制备芳香羟胺类化合物的方法，成为本发明需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的发明人从土壤中经初筛、复筛，获得一株能够高效还原由硝基取代的芳香类化合物(简称：硝基芳香类化合物)的放线菌菌株——Streptomyces thioluteus 511199。将所筛得的菌株还原硝基芳香类化合物能获得相应的芳香羟胺类化合物，底物(硝基芳香类化合物)转化率和选择性均较高，整个制备过程操作简单、安全且易于商业化规模制备。
本发明的发明人所筛得的放线菌菌株(Streptomyces thioluteus 511199)于2008年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCCNo.2725。
CGMCC No.2725菌株的特性如下：
1、形态：在高氏培养基上，菌落整齐，基内菌丝体无横隔，不断裂，气生菌丝体分支，生长丰盛。孢子丝微波曲，孢子呈长柱型，表面有凹陷。属于链霉菌Streptomyces thioluteus属。
2、生理生化特性：明胶液化完全，脱脂牛奶中脱脂牛奶中不凝固不胨化，淀粉水解完全，H2S产生阳性，能利用的碳源为D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、L-肌醇、L-鼠李糖、棉子糖、L-鼠李糖、蔗糖、纤维素。不能利用D-果糖、L-阿拉伯糖。
本发明所筛得的菌株CGMCC No.2725可用于制备芳香羟胺类化合物。即以芳香类硝基化合物为原料，经所述的菌株CGMCC No.2725进行选择性还原后得相应的芳香羟胺类化合物。
在本发明中，所说的芳香类硝基化合物，其结构如式I或式II所示：
其中：R1，R2分别选自H、卤素(F、Cl、Br或I)、-NO2、-CN、-OH、C1～C6烷基、-CHO、-COOH或-COCH3中一种；
i)R3，R4，和R5分别选自H、卤素(F、Cl、Br或I)、-NO2、-CN、-OH、C1～C6烷基、-CHO、-COOH或-COCH3中一种；或
ii)R3为H、卤素(F、Cl、Br或I)、-NO2、-CN、-OH、C1～C6烷基、-CHO、-COOH或-COCH3，R4与R5的结合(即R4+R5)为式III所示基团(曲线表示取代位)；或
iii)R3，R4，和R5的结合(即R3+R4+R5)为式IV所示基团(曲线表示取代位)：
在本发明中一个优选技术方案中，所说的芳香类硝基化合物具有式I所示结构，其中：R1，R2分别选自H、卤素(F、Cl、Br或I)、-NO2、-CN或-COCH3中一种；更优选的技术方案是：R1，R2分别选自H或卤素(F、Cl、Br或I)中一种，且R1和R2中至少有一个不为H。
在本发明中另一个优选技术方案中，所说的芳香类硝基化合物具有式II所示结构，其中：R3，R4，和R5分别选自H、卤素(F、Cl、Br或I)、-NO2、-CN或-COCH3中一种，且R3，R4，和R5中至少有一个不为H。
具体实施方式
1、CGMCC No.2725菌株的培养，包括如下步骤：
(1)斜面培养：
斜面培养基：可溶性淀粉2wt％，KNO3 0.1wt％，NaCl 0.05wt％，K2HPO4·3H2O 0.05wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0.001wt％，琼脂1.8％，余量为水；斜面培养基pH值为7.2；
将菌株接种到上述斜面培养基上，28℃恒温培养7天。
(2)摇瓶培养：
摇瓶培养基：可溶性淀粉1wt％，葡萄糖2wt％，黄豆粉2.5wt％，酵母粉0.4wt％，牛肉膏0.1wt％，NaCl 0.2wt％，K2HPO4 0.005wt％，余量为水；摇瓶培养基pH值为7.0～7.2；
将经斜面培养基的菌株接种到上述摇瓶培养基上，摇瓶装液量为所用摇瓶总体积的10％～30％，培养温度20℃～40℃，摇床转速150rpm～250rpm，摇瓶培养时间2天至5天。
2、还原芳香类硝基化合物制备相应的芳香羟胺类化合物(目标物)，包括如下步骤：
(A)将上述培养的含CGMCC No.2725菌株的发酵液进行离心分离，取其上清液(菌丝体)为酶源。将由酶源、芳香类硝基化合物(式I或式II所示化合物，以下简称为“底物”)和有机溶剂组成的反应液置于反应器中，在20℃～50℃条件下反应0.25小时至6小时，得含目标物的混合液。
其中：“底物”在反应液中的浓度为10mg/l～900mg/l(1为反应液总体积)；所说的有机溶剂选自乙醇、二甲基亚砜、四氢呋喃、1，4-二氧杂环己烷、1，2-二甲氧基乙烷或N，N-二甲基甲酰胺等中一种、二种或二种以上混合物。
(B)在由步骤(A)所得的混合液中加入硅藻土，搅拌、过滤。所得滤液用乙酸乙酯萃取，得萃取液(有机相)；滤饼用乙酸乙酯数洗涤数次。合并洗涤液和萃取液得含目标物的混合液，将所得的含目标物的混合液依次经干燥、蒸除有机溶剂和柱层析后得目标物。
本发明所述的放线菌菌株(CGMCC No.2725)易得且容易培养，菌株细胞体内存在完整的辅酶再生系统，只需加入适量的辅底物(如葡萄糖或乙醇等)，即可进行辅酶的自发循环再生，无须额外添加价格昂贵的还原型辅酶，并且整细胞的使用可以免去酶的提取纯化过程，更适合于规模化商业应用。
本发明所说的制备芳香羟胺类化合物的方法，通过下面实施例详述本发明，其目的是为了更好理解本发明的内容，但所举的实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1
4-硝基苯羟胺的合成
将CGMCC No.2725菌株经斜面培养所得的发酵液以转述8000rpm离心15分钟，取其上清液(菌丝体)用pH值为7.5的缓冲液(磷酸盐缓冲液)重悬，再加入5g/L(此处的“L”是指缓冲液的体积)的葡萄糖，得菌悬液。
其中：斜面培养基：可溶性淀粉2％，KNO3 0.1wt％，NaCl 0.05wt％，K2HPO4·3H2O 0.05wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0.001wt％，琼脂1.8wt％，余量为水；斜面培养基pH值为7.2。
斜面培养温度为28℃，培养时间为7天。
取上述菌悬液6ml与14ml的缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH值为7.5)及含10mg 1，4-二硝基苯的二甲基亚砜(DMSO)溶液组成反应液，且使1，4-硝基苯在反应液中的溶度为10mg/l(1为反应液总体积)。并在20℃～50℃条件下进行反应，通过高效液相色谱(HPLC)进行跟踪反应，每隔一小时检测反应液。
取1ml的反应液，再加入3ml的乙酸乙酯，剧烈震荡5分钟，静置10分钟，取上清液，用HPLC进行检测(Agilent XDB-C18，5μ，4.6×250mm)，结果见表1。
HPLC的检测条件：流动相：水(含1g/L柠檬酸)和甲醇(含1g/L柠檬酸)，甲醇从30％到60％进行梯度洗脱26min，紫外检测波长254nm，流速0.8ml.min-1，
对照羟胺标准物，保留时间：1a，19.9分钟；1c，11.3分钟；1d，12.4分钟。
实施例2
2-硝基苯羟胺的合成
除以1，2-二硝基苯替代实施例1中的1，4-二硝基苯，及“底物”在反应液中的溶度控制在900mg/l(1为反应液总体积)外，其它条件(包括测试条件)均与实施例1中所述相同。所得结果见结果见表1。
对照羟胺标准物，保留时间：2a，20.0分钟；2c，15.9分钟；2d，19.0分钟。
实施例3
3-硝基苯羟胺的合成
除以1，3-二硝基苯替代实施例1中的1，4-二硝基苯外，其它条件(包括测试条件)均与实施例1中所述相同。所得结果见结果见表1。
对照羟胺标准物，保留时间：3a，22.3分钟；3c，13.1分钟；3d，14.2分钟。
实施例4
4-羟胺苯乙酮的合成
除以4-硝基苯乙酮替代实施例1中的1，4-二硝基苯外，其它条件(包括测试条件)均与实施例1中所述相同。所得结果见结果见表1。
对照羟胺标准物，保留时间：4a，21.8分钟；4c，8.2分钟；4d，9.5分钟；4-硝基苯基乙醇，20.2分钟。
实施例5
4-氰基苯羟胺的合成
除以4-氰基硝基苯替代实施例1中的1，4-二硝基苯外，其它条件(包括测试条件)均与实施例1中所述相同。所得结果见结果见表1。
对照羟胺标准物，保留时间：5a，15.7分钟；5c，8.2分钟；5d，9.7分钟。
实施例6
2-氯4-羟胺基吡啶的合成
除以2-氯，4-硝基吡啶替代实施例1中的1，4-二硝基苯外，其它条件(包括测试条件)均与实施例1中所述相同。所得结果见结果见表1。
对照羟胺标准物，保留时间：6a，17.1分钟；6c，13.9分钟；6d，10.2分钟。
实施例7
4-羟胺基邻苯二甲腈的合成
除以4-硝基邻苯二甲腈替代实施例1中的1，4-二硝基苯外，其它条件(包括测试条件)均与实施例1中所述相同。所得结果见结果见表1。
对照羟胺标准物，保留时间：7a，12.5分钟；7c，10.2分钟；7d，11.7分钟。
实施例8
4-羟胺基邻苯二甲酰亚胺的合成
除以4-硝基邻苯二甲酰亚胺替代实施例1中的1，4-二硝基苯外，其它条件(包括测试条件)均与实施例1中所述相同。所得结果见结果见表1。
对照羟胺标准物，保留时间：8a，14.3分钟；8c，6.5分钟；8d，7.7分钟。
实施例9
将CGMCC No.2725菌株于28℃条件下，在摇瓶中培养2天至5天，8000rpm离心15分钟，菌丝体(上清液)用pH值为7.5的缓冲液(磷酸盐缓冲液)重悬，得菌悬液。
在250ml的三角烧瓶中，加入上述60毫升的菌悬液，再加入40ml的pH7.5值为缓冲液(磷酸盐缓冲液)，把100mg的1，4-二硝基苯溶解在少量的DMSO中加入，于20℃条件下，反应一个小时。反应结束后，加硅藻土(20g)，再搅拌10分钟，减压抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液用3×200ml乙酸乙酯萃取。合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析提纯，得到产物，产率达到85％，高效液相转化率达到95％，羟胺与胺的比例为95：5。硅胶柱层析(展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝10/1，v/v)，熔点(mp)：106-107℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ 9.67(s，-NH)，9.13(S，-OH)，8.08(d，J＝7.59Hz，2H)，6.8 5(d，J＝7.59，Hz，2H)。
其中摇瓶培养基：可溶性淀粉1wt％，葡萄糖2wt％，黄豆粉2.5wt％，酵母粉0.4wt％，牛肉膏0.1wt％，NaCl 0.2wt％，K2HPO4 0.005wt％，余量为水；摇瓶培养基pH值为7.0～7.2；
实施例10
将CGMCC No.2725菌株于28℃条件下，在摇瓶中培养2天至5天，8000rpm离心15分钟，菌丝体(上清液)用pH值为7.5的缓冲液(磷酸盐缓冲液)重悬，得菌悬液。
在带有机械搅拌和恒温水浴(50℃)的三颈烧瓶中，加入600毫升的上述菌悬液，再加入400ml的pH7.5缓冲液(磷酸盐缓冲液)，把1g的1，4-二硝基苯溶解在少量的DMSO中加入，反应一个小时。反应结束后，加硅藻土(200g)，再搅拌10分钟，减压抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液用10×200ml乙酸乙酯萃取。合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析提纯，得到产物，高效液相转化率达到95％，羟胺与胺的比例为(质量比)90:10。
表1
注：序号4中的4-硝基苯基乙醇的含量为20％。
Claims (4)
1.一株放线菌菌株(Streptomyces thioluteus)511199，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年10月27日，保藏号为：CGMCC No.2725。
2.如权利要求1所述的菌株在制备芳香羟胺类化合物中的应用，其特征在于，以芳香类硝基化合物为原料，经CGMCC No.2725菌株，在20℃～50℃条件下进行选择性还原后得到相应的芳香羟胺类化合物；
其中所述的芳香类硝基化合物的结构如式I或式II所示：
式中：R1和R2分别独立选自：H或卤素中一种；
i)R3，R4，和R5分别独立选自：H、卤素、-NO2、-CN或-COCH3中一种；或
ii)R3为H，R4+R5为式Ⅲ所示基团，曲线表示取代位：
所述芳香类硝基化合物在反应液中的浓度为10mg/l～900mg/l。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，其中R1，R2分别选自H或卤素中一种，且R1和R2中至少有一个不为H。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，其中R3，R4，和R5分别选自：H、卤素、-NO2、-CN或-COCH3中一种，且R3，R4，和R5中至少有一个不为H。
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