CN105039436A - 一种细胞生产(s)-氯苯丙酸甲酯的方法 - Google Patents
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Abstract
一种近平滑假丝酵母细胞生物催化制备？(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯的方法，反应罐中加入磷酸盐缓冲液，用近平滑假丝酵母细胞进行生物催化反应，产品收率高，对映体过量率高，解决了现有方法生产的困难。
Description
技术领域
本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到近平滑假丝酵母细胞生物催化制备手性医药中间体(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯的技术。
背景技术
手性(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯具有很好的应用前景。
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。
生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。
(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺陷，难于进行工业化生产。本发明将采用生物细胞催化制备(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯。
发明内容
本发明采用近平滑假丝酵母细胞催化制备(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应式如下：
底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯（1）经近平滑假丝酵母催化反应，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯（2）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用近平滑假丝酵母作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。
许多近平滑假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用近平滑假丝酵母菌株为ATCC20008，其催化反应效果最佳。
由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型,而细胞本身所含有的辅酶量可能较少,因此,进行氧化还原反应时,为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同，效果差别很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳的辅助底物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为：木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、异丙醇5-6%V/V(体积浓度)。
由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。
培养介质：
1、 种子培养基成份为:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6.8;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
2、培养液成份：葡萄糖37-44g/L,木糖7-8g/L，玉米胚芽粉10-12g/L，酵母提取物4-5g/L,(NH4)2HPO412-15g/L,KH2PO46.5-7.5g/L.MgSO4.7H2O 0.7-0.8g/L,NaCl 0.08-0.1g/L;pH6.8。
2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
酵母细胞制备。近平滑假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至29-30℃，将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为0.5-0.7V/（V分钟），29-30℃培养44-48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化。底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.6，加入底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯，使底物浓度为80-90g/L。其他成份：麦芽浸膏22-26g，平平加O（PerogolO,15个单位的氧乙烯与油醇的缩合物)19-20g/L，木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、异丙醇5-6%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至24-25℃时，加入湿酵母细胞使浓度为89-92g/L，通气比为0.15-0.16V/（V分钟），即每分钟通气量为0.15-0.16倍反应液体积，进行生物催化反应，反应时间为78-82小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率98-99％，产品收率96-97％，对映体过量率98.5-99％。
本发明所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化（反应温度、通气量、pH）、反应介质选择和浓度优化，包括底物浓度、麦芽浸膏含量、辅助底物组合、表面活性剂种类及浓度等。
实施例1
种子培养基成份为:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6.8;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：葡萄糖37g/L,木糖78g/L，玉米胚芽粉10g/L，酵母提取物4g/L,(NH4)2HPO412g/L,KH2PO46.5g/L.MgSO4.7H2O 0.7g/L,NaCl 0.08g/L;pH6.8。
湿酵母细胞制备过程如下：近平滑假丝酵母ATCC20008经斜面、摇瓶培养，得到种子液。1L发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至29℃，将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6％，通气比为0.5V/（V分钟），29℃培养44小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：0.5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.6，加入底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯，使浓度为80g/L，麦芽浸膏22g，平平加O（PerogolO,15个单位的氧乙烯与油醇的缩合物)19g/L，木糖45g/L、蔗糖28g/L、异丙醇6%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至29℃时，加入湿酵母细胞使浓度为89g/L，通气比为0.15V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为78小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率99％，产品收率97％，对映体过量率98.5％。
实施例2
种子培养基成份为:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6.8;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：葡萄糖44g/L,木糖8g/L，玉米胚芽粉12g/L，酵母提取物5g/L,(NH4)2HPO415g/L,KH2PO47.5g/L.MgSO4.7H2O 0.8g/L,NaCl 0.1g/L;pH6.8。
湿酵母细胞制备过程如下：近平滑假丝酵母ATCC20008经斜面、摇瓶培养，得到种子液。5L发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至30℃，将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6.5％，通气比为0.7V/（V分钟），30℃培养47小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.6，加入底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯，使浓度为90g/L，麦芽浸膏22g，平平加O（PerogolO,15个单位的氧乙烯与油醇的缩合物)20g/L，木糖50g/L、蔗糖25g/L、异丙醇5%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30℃时，加入湿酵母细胞使浓度为92g/L，通气比为0.16V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为82小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率98％，产品收率96％，对映体过量率99％。
实施例3
种子培养基成份为:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6.8;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：葡萄糖40g/L,木糖7.5g/L，玉米胚芽粉11g/L，酵母提取物4.5g/L,(NH4)2HPO413g/L,KH2PO47g/L.MgSO4.7H2O 0.75g/L,NaCl 0.09g/L;pH6.8。
湿酵母细胞制备过程如下：近平滑假丝酵母ATCC20008经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至30℃，将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6.3％，通气比为0.6V/（V分钟），30℃培养48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：10L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.6，加入底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯，使浓度为85g/L，麦芽浸膏22g，平平加O（PerogolO,15个单位的氧乙烯与油醇的缩合物)19.5g/L，木糖48g/L、蔗糖27g/L、异丙醇5.5%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30℃时，加入湿酵母细胞使浓度为91g/L，通气比为0.16V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为80小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率98.5％，产品收率96.5％，对映体过量率99％。
实施例4
种子培养基成份为:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH6.8;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：葡萄糖42g/L,木糖8g/L，玉米胚芽粉12g/L，酵母提取物5g/L,(NH4)2HPO415g/L,KH2PO47.5g/L.MgSO4.7H2O 0.75g/L,NaCl 0.1g/L;pH6.8。
湿酵母细胞制备过程如下：近平滑假丝酵母ATCC20008经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至29℃，将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6.5％，通气比为0.7V/（V分钟），29℃培养45小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：20L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.6，加入底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯，使浓度为86g/L，麦芽浸膏22g，平平加O（PerogolO,15个单位的氧乙烯与油醇的缩合物)20g/L，木糖49g/L、蔗糖26g/L、异丙醇6%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至29℃时，加入湿酵母细胞使浓度为91g/L，通气比为0.15V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为81小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率99％，产品收率96.5％，对映体过量率99％。
Claims (2)
1.一种近平滑假丝酵母细胞生物催化制备(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.6，加入底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯，使底物4-氯苯甲酰乙酸甲酯添加量为80-90g/L，麦芽浸膏22-26g，平平加O19-20g/L，木糖45-50g/L、蔗糖25-28g/L、异丙醇5-6%V/V，121℃高压灭菌30分钟；冷却至29-30℃时，加入湿酵母细胞使浓度为89-92g/L，通气比为0.15-0.16V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为78-82小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-3-(4-氯苯基)-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率98-99％，产品收率96-97％，对映体过量率98.5-99％。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于湿酵母细胞制备过程如下：近平滑假丝酵母ATCC20008，经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至29-30℃，将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为0.5-0.7V/（V分钟），29-30℃培养44-48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂；发酵罐中培养液成份为：葡萄糖37-44g/L,木糖7-8g/L，玉米胚芽粉10-12g/L，酵母提取物4-5g/L,(NH4)2HPO412-15g/L,KH2PO46.5-7.5g/L.MgSO4.7H2O 0.7-0.8g/L,NaCl 0.08-0.1g/L;pH6.8。
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