CN105039430A - 一种假丝酵母生产(s)-氟苯乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一种近平滑假丝酵母细胞生物催化制备?(S)-2-氟苯乙醇的方法,反应罐中加入磷酸盐缓冲液,用近平滑假丝酵母细胞进行生物催化反应,产品收率高,对映体过量率高,解决了现有方法生产的困难。
Description
技术领域
本发明属于制药工程技术领域,特别涉及到近平滑假丝酵母细胞生物催化制备手性医药中间体(S)-2-氟苯乙醇的技术。
背景技术
手性(S)-2-氟苯乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性(S)-2-氟苯乙醇具有很好的应用前景。
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。
生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。
(S)-2-氟苯乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块,。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺陷,难于进行工业化生产。本发明将采用生物细胞催化制备(S)-2-氟苯乙醇。
发明内容
本发明采用近平滑假丝酵母细胞催化制备(S)-2-氟苯乙醇,反应式如下:
底物2-氟苯乙酮(1)经近平滑假丝酵母催化反应,得到产物(S)-2-氟苯乙醇(2)。有多种微生物可以催化此反应,经过大量实验筛选,最终确定采用近平滑假丝酵母作为催化剂,因为其催化反应的效果最好,反应收率、对映体过量率(ee%)均很高。
许多近平滑假丝酵母都可以进行生物催化此反应,然而,其效果不同,相差很大,经实验,本发明选用近平滑假丝酵母菌株为ATCC96142,其催化反应效果最佳。
由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型,而细胞本身所含有的辅酶量可能较少,因此,进行氧化还原反应时,为促进辅酶再生,提高反应效率,在反应体系中还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多,不同细胞所需的辅助底物不同,效果差别很大,采用几种辅助底物组合,可以取得较好效果,需进行大量实验才能确定最佳的辅助底物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为:葡萄糖20-23g/L、麦芽糖30-36g/L、异丙醇5-6%V/V(体积浓度)。
由于底物溶解度较低,所以,加入表面活性剂以增加底物的溶解度。
培养介质:
1、 种子培养基成份为:酵母提取物10g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,pH7.1;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
2、培养液成份:葡萄糖37-44g/L,木糖7-8g/L,玉米胚芽粉10-12g/L,酵母提取物4-5g/L,(NH4)2HPO412-15g/L,KH2PO46.5-7.5g/L.MgSO4.7H2O 0.7-0.8g/L,NaCl 0.08-0.1g/L;pH7.1。
2、固体培养基成份:在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
酵母细胞制备。近平滑假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵罐加入培养液,121℃高压灭菌30分钟,冷却至27-28℃,将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐,接种比例为6-6.5%,通气比为0.5-1V/(V分钟),27-28℃培养42-45小时,用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞,用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化
底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,pH为7.4,加入底物2-氟苯乙酮,使底物浓度为80-90g/L。其他成份:麦芽浸膏22-26g,支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚15-16g/L,葡萄糖20-23g/L、麦芽糖30-36g/L、异丙醇5-6%V/V(体积浓度),121℃高压灭菌30分钟;冷却至27-28℃时,加入湿酵母细胞使浓度为78-82g/L,通气比为0.15-0.16V/(V分钟),即每分钟通气量为0.15-0.16倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为59-64小时;反应结束后,滤出细胞,用乙酸乙酯萃取反应液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-2-氟苯乙醇,反应转化率98-99%,产品收率96-97%,对映体过量率98.5-99%。
本发明所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化(反应温度、通气量、pH)、反应介质选择和浓度优化,包括底物浓度、麦芽浸膏含量、辅助底物组合、表面活性剂种类及浓度等。
实施例1
种子培养基成份为:酵母提取物10g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,pH7.1;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为:葡萄糖37g/L,木糖78g/L,玉米胚芽粉10g/L,酵母提取物4g/L,(NH4)2HPO412g/L,KH2PO46.5g/L.MgSO4.7H2O 0.7g/L,NaCl 0.08g/L;pH7.1。
湿酵母细胞制备过程如下:近平滑假丝酵母ATCC96142经斜面、摇瓶培养,得到种子液。1L发酵罐加入培养液,121℃高压灭菌30分钟,冷却至27℃,将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐,接种比例为6%,通气比为0.5V/(V分钟),27℃培养42小时,用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞,用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化:0.5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液,pH为7.4,加入底物2-氟苯乙酮,使浓度为80g/L,麦芽浸膏22g,支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚16g/L,葡萄糖22g/L、麦芽糖35g/L、异丙醇5%V/V(体积浓度),121℃高压灭菌30分钟;冷却至27℃时,加入湿酵母细胞使浓度为78g/L,通气比为0.15V/(V分钟),进行生物催化反应,反应时间为59小时;反应结束后,滤出细胞,用乙酸乙酯萃取反应液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-2-氟苯乙醇,反应转化率99%,产品收率97%,对映体过量率98.5%。
实施例2
种子培养基成份为:酵母提取物10g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,pH7.1;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为:葡萄糖44g/L,木糖8g/L,玉米胚芽粉12g/L,酵母提取物5g/L,(NH4)2HPO415g/L,KH2PO47.5g/L.MgSO4.7H2O 0.8g/L,NaCl 0.1g/L;pH7.1。
湿酵母细胞制备过程如下:近平滑假丝酵母ATCC96142经斜面、摇瓶培养,得到种子液。5L发酵罐加入培养液,121℃高压灭菌30分钟,冷却至27℃,将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐,接种比例为6.5%,通气比为1V/(V分钟),27℃培养45小时,用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞,用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化:5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液,pH为7.4,加入底物2-氟苯乙酮,使浓度为90g/L,麦芽浸膏22g,支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚15.5g/L,葡萄糖21g/L、麦芽糖33g/L、异丙醇5.5%V/V(体积浓度),121℃高压灭菌30分钟;冷却至28℃时,加入湿酵母细胞使浓度为82g/L,通气比为0.16V/(V分钟),进行生物催化反应,反应时间为64小时;反应结束后,滤出细胞,用乙酸乙酯萃取反应液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-2-氟苯乙醇,反应转化率98%,产品收率96%,对映体过量率99%。
实施例3
种子培养基成份为:酵母提取物10g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,pH7.1;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为:葡萄糖40g/L,木糖7.5g/L,玉米胚芽粉11g/L,酵母提取物4.5g/L,(NH4)2HPO413g/L,KH2PO47g/L.MgSO4.7H2O 0.75g/L,NaCl 0.09g/L;pH7.1。
湿酵母细胞制备过程如下:近平滑假丝酵母ATCC96142经斜面、摇瓶培养,得到种子液。10L发酵罐加入培养液,121℃高压灭菌30分钟,冷却至28℃,将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐,接种比例为6.3%,通气比为0.8V/(V分钟),28℃培养41小时,用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞,用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化:10L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液,pH为7.4,加入底物2-氟苯乙酮,使浓度为85g/L,麦芽浸膏22g,支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚15g/L,葡萄糖20g/L、麦芽糖36g/L、异丙醇5%V/V(体积浓度),121℃高压灭菌30分钟;冷却至28℃时,加入湿酵母细胞使浓度为81g/L,通气比为0.16V/(V分钟),进行生物催化反应,反应时间为62小时;反应结束后,滤出细胞,用乙酸乙酯萃取反应液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-2-氟苯乙醇,反应转化率98.5%,产品收率96.5%,对映体过量率99%。
实施例4
种子培养基成份为:酵母提取物10g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,pH7.1;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为:葡萄糖42g/L,木糖8g/L,玉米胚芽粉12g/L,酵母提取物5g/L,(NH4)2HPO415g/L,KH2PO47.5g/L.MgSO4.7H2O 0.75g/L,NaCl 0.1g/L;pH7.1。
湿酵母细胞制备过程如下:近平滑假丝酵母ATCC96142经斜面、摇瓶培养,得到种子液。10L发酵罐加入培养液,121℃高压灭菌30分钟,冷却至27℃,将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐,接种比例为6.5%,通气比为0.9V/(V分钟),27℃培养44小时,用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞,用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化:20L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液,pH为7.4,加入底物2-氟苯乙酮,使浓度为88g/L,麦芽浸膏22g,支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚16g/L,葡萄糖23g/L、麦芽糖30g/L、异丙醇6%V/V(体积浓度),121℃高压灭菌30分钟;冷却至27℃时,加入湿酵母细胞使浓度为79g/L,通气比为0.15V/(V分钟),进行生物催化反应,反应时间为61小时;反应结束后,滤出细胞,用乙酸乙酯萃取反应液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-2-氟苯乙醇,反应转化率99%,产品收率96.5%,对映体过量率99%。
Claims (2)
1.一种近平滑假丝酵母细胞生物催化制备(S)-2-氟苯乙醇的方法,其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液,pH为7.4,加入底物2-氟苯乙酮,使底物2-氟苯乙酮添加量为80-90g/L,麦芽浸膏22-26g,支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚15-16g/L,葡萄糖20-23g/L、麦芽糖30-36g/L、异丙醇5-6%V/V,121℃高压灭菌30分钟;冷却至27-28℃时,加入湿酵母细胞使浓度为78-82g/L,通气比为0.15-0.16V/(V分钟),进行生物催化反应,反应时间为59-64小时;反应结束后,滤出细胞,用乙酸乙酯萃取反应液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-2-氟苯乙醇,反应转化率98-99%,产品收率96-97%,对映体过量率98.5-99%。
2.权利要求1所述的方法,其特征在于湿酵母细胞制备过程如下:近平滑假丝酵母ATCC96142,经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵罐加入培养液,121℃高压灭菌30分钟,冷却至27-28℃,将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐,接种比例为6-6.5%,通气比为0.5-1V/(V分钟),27-28℃培养42-45小时,用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞,用作生物催化反应催化剂;发酵罐中培养液成份为:葡萄糖37-44g/L,木糖7-8g/L,玉米胚芽粉10-12g/L,酵母提取物4-5g/L,(NH4)2HPO412-15g/L,KH2PO46.5-7.5g/L.MgSO4.7H2O 0.7-0.8g/L,NaCl 0.08-0.1g/L;pH7.1。
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