CN105087663A - 一种酵母生产(s)-三氟苯乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一种解脂假丝酵母细胞生物催化制备(S)-2,2,2-三氟苯乙醇的方法，反应罐中加入磷酸盐缓冲液，用解脂假丝酵母细胞进行生物催化反应，产品收率高，对映体过量率高，解决了现有方法生产的困难。
Description
技术领域
本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到解脂假丝酵母细胞生物催化制备手性医药中间体(S)-2,2,2-三氟苯乙醇的技术。
背景技术
手性(S)-2,2,2-三氟苯乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性(S)-2,2,2-三氟苯乙醇具有很好的应用前景。
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。
生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。
(S)-2,2,2-三氟苯乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺陷，难于进行工业化生产。本发明将采用生物细胞催化制备(S)-2,2,2-三氟苯乙醇。
发明内容
本发明采用解脂假丝酵母细胞催化制备(S)-2,2,2-三氟苯乙醇，反应式如下：
2,2,2-三氟苯乙酮（1）经解脂假丝酵母催化反应，得到产物(S)-2,2,2-三氟苯乙醇（2）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用解脂假丝酵母作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。
许多解脂假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用解脂假丝酵母菌株为ATCC20688，其催化反应效果最佳。
由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型,而细胞本身所含有的辅酶量可能较少,因此,进行氧化还原反应时,为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同，效果差别很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳的辅助底物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为：葡萄糖26-30g/L、木糖20-24g/L、异丙醇7-9%V/V(体积浓度)。
由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。
培养介质：
1、 种子培养基成份为:葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2PO42g/L，MgSO47H2O0.5g/L，配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
2、培养液成份：：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黄豆粉16-20g/L,KH2PO44.4-5.5g/L，MgSO47H2O0.5-0.6g/L，pH6.7。
2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
解脂假丝酵母细胞制备。解脂假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至24-25℃，将解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8-8.5％，通气比为0.5-0.6V/（V分钟），24-25℃培养48-54小时，用过滤式离心机离心得到湿解脂假丝酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化。底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物2,2,2-三氟苯乙酮，使底物浓度为80-90g/L。其他成份：单硬脂酸甘油酯含量为15-16g/L，葡萄糖26-30g/L、木糖20-24g/L、异丙醇7-9%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至27-28℃时，加入湿解脂假丝酵母细胞使其浓度为82-85g/L，通气比为0.12-0.125V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为80-84小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-2,2,2-三氟苯乙醇，反应转化率98-99％，产品收率96-97％，对映体过量率98.5-99％。
本发明所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化（反应温度、通气量、pH）、反应介质选择和浓度优化，包括底物浓度、辅助底物组合、表面活性剂种类及浓度等。
实施例1
种子培养基成份为:葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2PO42g/L，MgSO47H2O0.5g/L，配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
培养液成份为：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黄豆粉16-20g/L,KH2PO44.4-5.5g/L，MgSO47H2O0.5-0.6g/L,pH6.7。
湿解脂假丝酵母细胞制备过程如下：解脂假丝酵母ATCC20688经斜面、摇瓶培养，得到种子液。1L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至24-25℃，将解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为接种比例为8-8.5％，通气比为0.5-0.6V/（V分钟），24-25℃培养48-54小时，用过滤式离心机离心得到湿解脂假丝酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：0.5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物2,2,2-三氟苯乙酮，使其浓度为80g/L，单硬脂酸甘油酯含量为15g/L，葡萄糖26g/L、木糖24g/L、异丙醇9%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至27-28℃时，加入湿解脂假丝酵母细胞使其浓度为82g/L，通气比为0.12V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为84小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-2,2,2-三氟苯乙醇，反应转化率99％，产品收率97％，对映体过量率98.5％。
实施例2
种子培养基成份为:葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2PO42g/L，MgSO47H2O0.5g/L，配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
培养液成份为：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黄豆粉16-20g/L,KH2PO44.4-5.5g/L，MgSO47H2O0.5-0.6g/L,pH6.7。
湿解脂假丝酵母细胞制备过程如下：解脂假丝酵母ATCC20688经斜面、摇瓶培养，得到种子液。5L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至24-25℃，将解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8-8.5％，通气比为0.5-0.6V/（V分钟），24-25℃培养48-54小时，用过滤式离心机离心得到湿解脂假丝酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物2,2,2-三氟苯乙酮，使其浓度为90g/L，单硬脂酸甘油酯含量为16g/L，葡萄糖30g/L、木糖20g/L、异丙醇7%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至28℃时，加入湿解脂假丝酵母细胞使其浓度为85g/L，通气比为0.125V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为80小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-2,2,2-三氟苯乙醇，反应转化率98％，产品收率96％，对映体过量率99％。
实施例3
种子培养基成份为:葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2PO42g/L，MgSO47H2O0.5g/L，配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
培养液成份为：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黄豆粉16-20g/L,KH2PO44.4-5.5g/L，MgSO47H2O0.5-0.6g/L,pH6.7。
湿解脂假丝酵母细胞制备过程如下：解脂假丝酵母ATCC20688经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至24-25℃，将解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8-8.5％，通气比为0.5-0.6V/（V分钟），24-25℃培养48-54小时，用过滤式离心机离心得到湿解脂假丝酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：10L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物2,2,2-三氟苯乙酮，使其浓度为84g/L，单硬脂酸甘油酯含量为15.5g/L，葡萄糖28g/L、木糖22g/L、异丙醇8%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至27.5℃时，加入湿解脂假丝酵母细胞使其浓度为83g/L，通气比为0.12V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为82小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-2,2,2-三氟苯乙醇，反应转化率98.5％，产品收率96.5％，对映体过量率99％。
实施例4
种子培养基成份为:葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2PO42g/L，MgSO47H2O0.5g/L，配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
培养液成份为：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黄豆粉16-20g/L,KH2PO44.4-5.5g/L，MgSO47H2O0.5-0.6g/L,pH6.7。
湿解脂假丝酵母细胞制备过程如下：解脂假丝酵母ATCC20688经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至24-25℃，将解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8-8.5％，通气比为0.5-0.6V/（V分钟），24-25℃培养48-54小时，用过滤式离心机离心得到湿解脂假丝酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
生物催化转化：20L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物2,2,2-三氟苯乙酮，使其浓度为86g/L，单硬脂酸甘油酯含量为16g/L，葡萄糖29g/L、木糖23g/L、异丙醇8.5%V/V(体积浓度)，121℃高压灭菌30分钟；冷却至28℃时，加入湿解脂假丝酵母细胞使其浓度为84g/L，通气比为0.125V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为83小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-2,2,2-三氟苯乙醇，反应转化率99％，产品收率96.5％，对映体过量率99％。
Claims (2)
1. 一种解脂假丝酵母细胞生物催化制备(S)-2,2,2-三氟苯乙醇的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.3，加入底物2,2,2-三氟苯乙酮，使底物2,2,2-三氟苯乙酮添加量为80-90g/L，单硬脂酸甘油酯含量为15-16g/L，葡萄糖26-30g/L、木糖20-24g/L、异丙醇7-9%V/V，121℃高压灭菌30分钟；冷却至27-28℃时，加入湿解脂假丝酵母细胞使其浓度为82-85g/L，通气比为0.12-0.125V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为80-84小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-2,2,2-三氟苯乙醇，反应转化率98-99％，产品收率96-97％，对映体过量率98.5-99％。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于湿解脂假丝酵母细胞制备过程如下：解脂假丝酵母ATCC20688，经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至24-25℃，将解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8-8.5％，通气比为0.5-0.6V/（V分钟），24-25℃培养48-54小时，用过滤式离心机离心得到湿解脂假丝酵母细胞，用作生物催化反应催化剂；发酵罐中培养液成份为：葡萄糖20-25g/L，酵母浸膏10-15g/L，玉米油5-7g/L，黄豆粉16-20g/L,KH2PO44.4-5.5g/L，MgSO47H2O0.5-0.6g/L，pH6.7。
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