KR20010022073A

KR20010022073A - 아미드의 제조 방법

Info

Publication number: KR20010022073A
Application number: KR1020007000642A
Authority: KR
Inventors: 로빈스카렌트라씨; 나가사와도루
Original assignee: 토마스 케플러, 자비네 루츠; 론자 아게
Priority date: 1997-07-22
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2001-03-15
Also published as: US20080050798A1; US7666635B2; AU8978398A; CA2294621A1; DK1002122T3; PL338249A1; US6444451B1; CZ299166B6; JP4302876B2; CN1265154A; HU226274B1; EA200000135A1; CZ2000153A3; KR100517776B1; PL194729B1; US7741097B2; US20070031949A1; JP2001511355A; US20080057550A1; UA83654C2

Abstract

아미콜라톱시스(Amycolatopsis), 악티노마두라(Actinomadura) 또는 로도코쿠스(Rhodococcus) 속의 미생물을 이용하여 니트릴로부터 아미드를 제조하는 신규 생물공학적 방법을 밝힌다.

Description

아미드의 제조 방법 {PROCESS FOR PREPARING AMIDES}

본 발명은 악티노마두라(Actinomadura), 아미콜라톱시스(Amycolatopsis) 또는 로도코쿠스(Rhodococcus) 속의 신규 미생물, 및 이 미생물 또는 이 미생물의 효소 추출물을 이용한 아미드의 신규 제조 방법에 관한 것이다.

예를 들어, 동물 및 인간에게 필수적인 비타민 B 복합체의 비타민 중 하나인 니코틴아미드와 같은 아미드에 있어서, 다수의 생명공학적 제조 방법이 이미 알려져 있다. 일반적으로, 니트릴 히드라타제를 함유한 미생물은 니트릴을 해당하는 아미드로 전환시킨다고 알려져 있다. 한 예로서, EP-A-0 188 316 호에는 로도코쿠스, 아트로박터(Arthrobacter) 또는 마이크로박테리움(Microbacterium) 속의 미생물을 이용하여, 3-시아노피리딘으로부터 출발하는 니코틴아미드의 제조 방법이 기재되어 있다.

상기 방법의 단점은 상기 미생물이 3-시아노피리딘을 니코틴아미드로 전환시키는 활성이 낮다는 점이다.

EP-A-0 307 926 호에는 로도코쿠스 로도크러스(Rhodococcus rhodochrous) J1 종의 미생물에 의해 3-시아노피리딘을 니코틴아미드로 전환시키는 것이 기재되어 있다. 상기 미생물이 목적하는 전환을 촉매하기 위해서는 유도과정이 있어야만 한다.

상기 방법의 또 다른 단점은 로도코쿠스 로도크러스 J1 이 붉은 색이므로, 생성물의 변색이 일어난다는 점이다. 또한, 상기 미생물은 열안정성이 낮고, 예를 들어, 기질인 3-시아노피리딘에 의해 저해된다.

로도코쿠스 로도크러스 J1 종의 미생물에 의해 3-시아노피리딘으로부터 출발하여 니코틴아미드를 제조하는 또 다른 방법이 EP-A-0 362 829 호에 기재되어 있다. 니트릴 히드라타제를 함유한 미생물의 비활성(specific activity)을 증가시키기 위해, 우레아 또는 우레아 유도체가 유도물질로서 배양 배지에 첨가된다. 앞서 설명한 방법에서와 같이, 이 방법에서도 생성물의 변색이 일어난다.

또한, WO 95/17 505 호에는 로도코쿠스 로도크러스 M33 종의 미생물에 의해, 해당하는 니트릴로부터 출발하여 방향족 아미드를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법의 단점은 로도코쿠스 로도크러스 M33 의 붉은 착색 및, 기질인 3-시아노피리딘에 대한 높은 K_M값이다.

본 발명의 목적은 상기 단점들을 제거하고, 해당하는 아미드를 우수한 수율 및 순도로 단리할 수 있는 아미드의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적은 청구항 1 및 3 에 따른 신규 미생물 및 청구항 6 에 따른 방법에 의해 달성된다.

본 발명에서는, 악티노마두라, 아미콜라톱시스 또는 로도코쿠스 속의 미생물에 의해 이들 미생물의 효소 추출물을 이용하거나, 아미콜라톱시스 또는 악티노마두라 속의 미생물의 정제된 니트릴 히드라타제에 의해, 기질인 니트릴을 해당하는 아미드로 전환시킴으로써 방법을 수행한다.

예를 들어 3-시아노피리딘과 같은, 생체내 변환에 사용되는 니트릴은 상업적으로 구입할 수 있는 화합물이다.

본 발명에 따른 미생물은 기질인 니트릴을 해당하는 아미드로 전환시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 미생물은 니트릴 또는 아미드를 유일한 탄소원 및/또는 질소원으로 하여 증식할 수 있다.

본 발명에 따른 미생물은 예를 들면, 토양 시료, 진흙 또는 폐수로부터, 통상적인 미생물학 기술을 이용하여 적당한 선별에 의해 얻을 수 있다. 편리하게는, 니트릴 또는 아미드를, 바람직하게는 유일한 탄소 및 질소원으로 하여 코발트 이온의 존재하에 미생물을 증식시킴으로써 선별한다. 선별에 적당한 니트릴 및 아미드는 특히, 이후의 생체내 변환에서 기질로서 또한 사용되는 니트릴, 및 이로부터 수득되는 해당 아미드이다. 적당한 증식 배지는 마찬가지로, 당 분야의 숙련된 자에게 알려져 있으며, 예를 들면, 표 1 에 기재된 배지가 사용될 수 있다.

일반적으로, 상기 미생물은 실제의 생체내 변환 이전에도 상기 배지를 사용하여 동일한 방법으로 배양(증식)된다.

당 분야에 알려진 바와 같이, 니트릴 히드라타제는 증식 배지가 보인자로서 코발트 이온을 함유할 때에만 형성된다. 적당한 "코발트 이온을 발생하는 코발트 화합물"은 C_O ²⁺또는 C_O ³⁺염이다. C_O ²⁺또는 C_O ³⁺염의 예로는 염화코발트, 황산코발트 및 아세트산코발트가 있다.

편리하게는, 사용되는 코발트 화합물은 예를 들어 CoCl₂와 같은 C_O ²⁺염이다. 그러나, 금속 코발트 또는, 그 자리에서(in situ) 코발트 이온을 발생하는 다른 코발트 화합물과 함께, 비타민 B12 의 존재하에 증식시킬 수도 있다. 편리하게는, 코발트 화합물은 1 내지 10 ㎎/ℓ, 바람직하게는 1 내지 3 ㎎/ℓ로 사용된다.

일반적으로, 증식은 온도 20 내지 50 ℃, pH 5 내지 8 에서, 바람직하게는 온도 30 내지 45 ℃, pH 5.5 내지 7.5 에서 수행된다.

실제의 생체내 변환은 악티노마두라, 아미콜라톱시스 속의 미생물을 이용하여, 상기 미생물의 효소 추출물을 이용하거나, 상기 미생물로부터의 정제된 니트릴 히드라타제에 의해 수행될 수 있다. 편리하게는, 악티노마두라 스파딕스 (Actinomadura spadix) 종의 미생물, 예를 들면, 악티노마두라 스파딕스 E3733, 악티노마두라 스파딕스 E3736, 악티노마두라 스파딕스 45A32, 악티노마두라 스파딕스 4501 또는 악티노마두라 스파딕스 C15 를 이용하여 생체내 변환을 수행한다. 생체내 변환은 바람직하게는, 아미콜라톱시스 NE31 및 아미콜라톱시스 NA40 종에 해당하는 미생물 또는 기능적으로 동등한 이들의 변종 및 변이체를 이용하여 수행한다. 특히 바람직하게는, 아미콜라톱시스 NA40 종에 속하는 미생물을 사용한다. 상기 종의 미생물은 부다페스트 조약에 따라, 1997년 6월 3일자로 "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (브룬스빅 데-38124, 마셔로더벡 1b) 에, 아미콜라톱시스 NE31 및 아미콜라톱시스 NA40 로 지정되어 수탁되었으며, 각각 수탁번호 DSMZ 11616 및 DSMZ 11617 을 부여받았다. 상기 두 가지 미생물은 그 동안 더욱 정확하게 동정되었으며, 문헌에 기재된 적 없는 아미콜라톱시스 속으로 지정될 것이다.

따라서, 본 발명은 또한, 아미드를 니트릴로 전환시킬 수 있는, 아미콜라톱시스 또는 악티노마두라 속의 미생물, 특히, 아미콜라톱시스 NA40 (DSMZ 11617) 및 아미콜라톱시스 NE31 (DSMZ 11616)으로 지정된 미생물에 관한 것이다.

또한, 로도코쿠스 속의 특정 미생물은 EP-A-0 362 829 호에 기재된 로도코쿠스 로도크러스 J1 보다, 니트릴을 아미드로 전환시키는 특성이 더 우수한 것으로 밝혀졌다. 이들 미생물은 로도코쿠스 GF674, 로도코쿠스 GF578, 로도코쿠스 GF473, 로도코쿠스 GF270 (DSMZ 12211) 및 로도코쿠스 GF376 (DSMZ 12175), 또는 기능적으로 동등한 이들의 변종 및 변이체이다. 미생물 DSMZ 12175 는 부다페스트 조약에 따라, 1998년 5월 15일자로, 미생물 DSMZ 12211 은 1998년 6월 8일자로 "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (브룬스빅 데-38124, 마셔로더벡 1b) 에 수탁되었다.

로도코쿠스 균주 GF270, GF376, GF473, GF578 및 GF674 는 동정에 의해, 문헌에 기재된 적 없는 로도코쿠스 속의 종으로 지정되었다. 따라서, 본 발명은 또한, 로도코쿠스 GF270, 로도코쿠스 GF376, 로도코쿠스 GF473, 로도코쿠스 GF578 및 로도코쿠스 GF674 미생물에 관한 것이다.

악티노마두라 또는 아미콜라톱시스 속의 미생물과는 달리, 로도코쿠스 속의 미생물은 실제 전환 이전에 편리하게 유도된다. 적당한 유도물질로는 EP-A-0 307 926 호에 기재된 것들, 예를 들면, 아세트아미드, 부티르아미드, 메타크릴아미드, 프로피온아미드, 크로톤아미드 및 발레르아미드가 있다.

"기능적으로 동등한 변종 및 변이체"는 상기 원 미생물로부터 유래하여, 실질적으로 이와 동일한 특성 및 기능을 갖는 미생물을 의미하는 것으로 해석된다. 이러한 종류의 변종 및 변이체는, 예를 들면, UV 조사 또는 변이유발 화학물질에 의해 우발적으로 형성될 수 있다.

아미콜라톱시스 NA40 의 동정

기중균사(氣中菌絲)의 색 백색

기질균사의 색 오렌지색

확산된 안료의 색 -

당 스펙트럼

ARA +

GAL +

MAD -

XYL -

GLU tr

RIB +

타입 A

DAP DL

메나퀴논 (%)

8/4 -

9/0 (+)

9/2 +

9/4 +++

9/6 -

9/8 -

16S rDNA 상동성 96.9 %

인지질 조사되지 않음

(PE, OH-PE, lyso PE, met PE, PC, NPG, PI, PIM, PG, DPG, GL)

지방산

iso 16 +++

iso 15 +

iso 17 (+)

anteiso 15 (+)

anteiso 17 (+)

10-Me 16 -

10-Me 17 +

2-OH 15 +

2-OH 16 +

타입 3f

MS -

아미콜라톱시스 NE31 의 동정

기중균사의 색 백색

기질균사의 색 오렌지색

확산된 안료의 색 -

당 스펙트럼

ARA +

GAL +

MAD -

XYL -

GLU tr

RIB +

타입 A

DAP DL

메나퀴논 (%)

8/4 -

9/0 (+)

9/2 +

9/4 +++

9/6 -

9/8 -

16S rDNA 상동성 96.1 %

인지질 조사되지 않음

(PE, OH-PE, lyso PE, met PE, PC, NPG, PI, PIM, PG, DPG, GL)

지방산

iso 16 +++

iso 15 +

iso 17 (+)

anteiso 15 (+)

anteiso 17 (+)

10-Me 16 -

10-Me 17 +

2-OH 15 +

2-OH 16 +

타입 3f

MS -

동정에 대한 약어 및 설명

(+) 1-5 %

+ 5-15 %

++ 15-30 %

+++ > 30 %

DAP 디아미노피멜산

ARA 아라비노스

GAL 갈락토스

MAD 마두로스

XYL 자일로스

GLU 글루코스

RIB 리보스

"Lechevalier" 등 (1971년) 에 따른 당 타입

"Kroppenstedt" (1985년 및 1992년) 에 따른 지방산 타입

9/4 MK-9 (H₄)

9/6 MK-9 (H₆)

9/8 MK-9 (H₈)

MS 미콜산

PE 포스파티딜에탄올아민

OH-PE 히드록시-PE

met PE 포스파티딜메틸에탄올아민

PC 포스파티딜콜린

NPG 포스파티딜글루코사민

PI 포스파티딜이노시톨

PIM 포스파티딜이노시톨만노시드

PG 포스파티딜글리세롤

DPG 디포스파티딜글리세롤

GL 글리코리피드

지방산

iso-16 이소헥사데칸산 또는 14-메틸펜타데칸산

10-Me-18 투베르쿨로스테아르산

2-OH-16 2-히드록시팔미트산

GF270, GF376, GF473, GF578 및 GF674의 동정

상기 균주에 대한 동정은 서로 독립적인 5 가지 특성을 토대로 한다.

1. 콜로니의 형태 및 색깔: 막대형 및 포자형 부분으로 분리되는 단쇄 균사. GF270 및 GF376의 콜로니는 살색(RAL 3022)이고, GF578 및 GF674의 콜로니는 연한 적색(RAL 3012)이다.

2. 펩티도글리칸의 디아미노산: 메소-디아미노-피멜산

3. 미콜산: 로도코쿠스 미콜산: 장쇄 미콜산의 분석은 고온 가스 크로마토그래피에 의해 수행한다. GF270 및 GF376 의 미콜산과 GF473, GF578 및 GF674 의 미콜산의 용리 프로파일은 동일하다. GF270 및 GF376 에 대한 미콜산 길이는 C₃₈-C₄₆이고, GF473, GF578 및 GF674 에 대한 미콜산 길이는 C₄₀-C₄₈이다. 미콜산 패턴을 로도코쿠스 균주의 미콜산 패턴과 비교한다. GF270 은 매우 낮은 상관계수 (0.086) 로 로도코쿠스 로도크러스에 속하는 것으로 동정되었고; 이 방법에 의해 GF376 을 동정할 수는 없었다. 다른 세 가지 분리주 GF473, GF578 및 GF674 는 매우 낮은 상관계수로 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber)에 속하는 것으로 동정되었다.

4. 지방산 패턴: 투베르쿨로스테아르산을 포함하는, 분지 없는 포화 및 불포화 지방산. 지방산 패턴은 미코박테리움(Mycobacterium), 노카르디아(Nocardia), 디에트지아(Dietzia), 츠카무렐라(Tsukamurella) 및 일부 코리네박테리아 (Corynebacteria) 종과 밀접하게 관련된 모든 로도코쿠스 속의 감별 지표이다. GF270, GF376, GF473, GF578 및 GF674 의 지방산 패턴과 로도코쿠스 종의 지방산 패턴 사이의 정성 및 정량적 차이에 의해 종 수준에서의 동정이 수득된다.

5. GF270 및 GF376 의 16S rDNA 서브시퀀스는 동일하지만(100 %), 이들을 로도코쿠스 균주와 비교하면, 가장 근접하게 관련된 로도코쿠스 로도크러스에 대해 단지 99.1 % 유사성을 나타낸다. GF473 및 GF578 은 16S rDNA 시퀀스가 동일하다(100 %). GF674 는 GF578 과 500 개의 염기쌍중 단지 한 쌍이 다르다 (99.8 %). 모든 세 가지 분리주는 로도코쿠스 코프로필루스(Rhodococcus coprophilus)와 단지 먼 상관관계를 갖는다 (98.4 %).

화학주성 및 분자생물학적 결과에 근거하여, 한편으로 GF270 및 GF376 과, 다른 한편으로 GF473, GF578 및 GF674 는 두 가지 신규 로도코쿠스 종이라고 결론지을 수 있다. GF270 및 GF376 은 로도코쿠스 로도크러스와 16S rDNA 에 있어 근접한 상관성이 있지만 (99.1 %), GF473, GF578 및 GF674 는 로도코쿠스 코프로필루스와 단지 먼 상관성이 있다 (98.4 %).

효소 추출물은 당분야의 통상적인 미생물 파괴에 의해, 예를 들면, 초음파, 프랑스 프레스 법 또는 리소자임 법에 의한 파괴에 의해 수득할 수 있다. 방법을 수행하기 위해, 상기 효소 추출물 뿐만 아니라 완전한 미생물 세포를 적당한 지지체 물질 상에 고정화, 즉 일반적으로 중합체 내에 포매시키거나, 적당한 지지체 물질 상에 흡수시킬 수 있다.

니트릴 히드라타제 활성을 갖는 본 발명에 따른 효소는 아미콜라톱시스 속의 미생물로부터 수득될 수 있고, 니트릴을 아미드로 전환시킬 수 있으며, 특히 아미콜라톱시스 NA40 (DSMZ 11617)로부터 수득될 수 있다.

이 효소는 특히, 하기와 같은 특징을 갖는다:

a) 최적 pH 는 pH 6.5 ±1.0 이고,

b) pH 7.0 에서 최적 온도는 35 내지 40 ℃ 이고,

c) 기질인 3-시아노피리딘에 대한 K_M값은 41.7 mM ±7.7 mM (20 ℃, 45 mM 인산염 완충액, pH 7.0) 이고,

특히,

d) 분자량은 106 kDa (예를 들어, SDS-PAGE 에 의해 측정) 이다.

니트릴은 일반적으로 생체내 변환을 위한 기질로 사용될 수 있다. 편리하게는, 1 내지 10 개의 탄소 원자를 가지며, 예를 들어 히드록실, 아미노, 할로겐 또는 카르복실로 경우에 따라 치환된 지방족 니트릴, 또는 방향족 고리계 내에 4 내지 10 개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 방향족 니트릴이 사용된다. 사용될 수 있는 탄소수 1 내지 10 의 지방족 니트릴은 디니트릴, 히드록시니트릴, 아미노니트릴, 예를 들면, n-옥탄니트릴, 시아노아세트산, 이소카프로니트릴, n-발레로니트릴, 아디포니트릴, 글루타로니트릴, 숙시노니트릴, 세바코니트릴, 프로피오니트릴, 크로토노니트릴, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, n-부티로니트릴 또는 아젤라니트릴이다. 사용될 수 있는 탄소수 4 내지 10 의 방향족 니트릴은 하기 화학식 I 또는 II 의 니트릴이다:

[상기 식에서, R¹및 R²는 수소 원자, 할로겐 원자 또는 C_1-4알킬이다.]

할로겐 원자로는 F, Cl, Br 또는 I 가 사용될 수 있다. C_1-4알킬로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, t-프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸이 사용될 수 있다. 화학식 I 또는 II 의 방향족 니트릴의 편리한 대표예로는 2-, 3- 또는 4-시아노피리딘, 벤조니트릴, 플루오로-, 클로로- 또는 브로모벤조니트릴, 예를 들면, o-, m- 또는 p-클로로벤조니트릴 또는 2-클로로-3-시아노피리딘이 있다. 탄소수 4 내지 10 의 방향족 니트릴로서 바람직하게는 3-시아노피리딘이 사용된다.

생체내 변환은 편리하게는, 기질 농도가 40 중량%, 바람직하게는 30 중량% 를 초과하지 않도록, 기질을 한 번에, 또는 연속적으로 첨가함으로써 수행된다.

편리하게는, 휴지 (비증식) 세포를 이용하여 방법을 수행한다.

생체내 변환에 적당한 배지는 전문 분야에서 통상적인 것들, 예를 들면, 저분자량 인산염 완충액, HEPES 완충액, 시트르산염 완충액, 붕산염 완충액, 표 1 내지 3 에 따른 배지 또는 이의 변형 형태, 예를 들면, 실시예 8 (1)에 기재된 것 또는 트리스/HCl 완충액이다.

생체내 변환은 편리하게는, 0 내지 50 ℃의 온도 및 4.5 내지 10 의 pH 에서, 바람직하게는 20 내지 40 ℃의 온도 및 4.5 내지 10.0 의 pH 에서 수행된다.

특히 바람직한 구현예로서, 생체내 변환은 C_1-4알콜의 존재하에 수행할 수 있다. 사용되는 C_1-4알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올일 수 있다. 바람직하게는 메탄올이 사용된다.

반응 후, 이어서 해당 아미드를 통상적인 워크업 방법, 예를 들면 결정화에 의해 단리할 수 있다.

실시예 1

악티노마두라 또는 아미콜라톱시스 속의 미생물의 증식

a) 탄소 및 질소원으로서 각종 니트릴 및 아미드를 갖는 표 1 에 따른 강화 배지에 각종 토양 시료를 접종하고, 37 ℃ 또는 45 ℃ 에서 7-10 일간 배양한다. 그 다음, 배양물을 동일 배지에 옮긴 다음, 다시 37 ℃ 에서 7-10 일간 배양한다. 전체 과정을 3 회 반복한다. 그 다음, 배양물을 희석하고, 개별적인 콜로니를 얻기 위해 플레이트에 도말한다. 플레이트를 37 ℃ 에서 5 일간 배양한다. 그 다음, 목적하는 활성에 대해 상이한 콜로니들을 시험한다.

아미콜라톱시스 NA40 (DSMZ 11617) 및 아미콜라톱시스 NE31 (DSMZ 11616) 을 상기 방법으로 단리한 다음, 최적화된 배지 (표 3)내에 37 ℃에서 90-100 시간 동안 진탕하면서 증식시킨다.

아디포니트릴을 아미콜라톱시스 NE31 (DSMZ 11616), 악티노마두라 스파딕스 E3733 및 악티노마두라 스파딕스 E3736 에 대한 탄소 및 질소원으로서, 아젤라니트릴을 아미콜라톱시스 NA40 (DSMZ 11617) 및 악티노마두라 스파딕스 45A32 에 대한 탄소 및 질소원으로서, n-옥탄니트릴을 악티노마두라 스파딕스 4501 에 대한 탄소 및 질소원으로서, 그리고, 시아노아세트산을 악티노마두라 스파딕스 C15 에 대한 탄소 및 질소원으로서 사용한다.

b) 아미콜라톱시스 NA40 을 표 3 에 따른 배지에서 배양한다. 배양은 호기성 조건하에 37 ℃ 의 온도에서 2 또는 3 내지 4 일간, 계대배양(4 ㎖/튜브) 및 "주배양" (500 ㎖/플라스크)으로 수행한다. 세포 증식을 610 nm 에서 혼탁도 측정 방식으로 측정하고, 세포의 건조 중량을 하기 방법으로 계산한다:

세포의 건조 중량 (㎎/㎖) = OD_{610 nm}×0.277

실시예 2

악티노마두라 또는 아미콜라톱시스 속의 미생물을 이용한 생체내 변환

(1) 니트릴 히드라타제 활성의 측정을 위해, 3-시아노피리딘 (1.0 M, 1.0 ㎖), 인산칼륨 완충액 (pH 7.0, 0.1 M, 0.5 ㎖) 및 0.5 ㎖ 의 세포 서스펜션을 함유한 반응 혼합물 (2 ㎖)을 20 ℃에서 30 분간 교반하면서 배양한다. 3 N HCl 0.2 ㎖ 를 첨가하여 반응을 중단시킨다. 간단히 원심분리한 후, 형성된 니코틴아미드를 HPLC (Shimadzu SPD 6A 시스템, C18 칼럼 (Develosil ODS-HG-5, 4.6 ×250 cm); 용리액: 10 mM KH₂PO₄/H₃PO₄(pH 2.8)/아세토니트릴 9:1 (v/v); 유속: 1 ㎖/분; 230 nm 에서 흡광도 측정) 에 의해 측정한다. 비활성을 형성된 니코틴아미드의 μmol/㎖/분/OD_{610 nm}로 표현한다.

단리된 박테리아에 의한 강화 배지 (표 1) 에서의 지방족 니트릴의 반응율은 표 5 에 요약하고, 기초 배지 (표 2)에서의 유도물질 및 보인자의 영향은 표 4 에 요약하고, 기초 배지 (표 2)에서의 로도코쿠스에 대한 아미콜라톱시스의 활성 비교는 표 6 에 요약하였다. 표 4 의 결과에서, 아미콜라톱시스 NA40 으로부터의 니트릴 히드라타제가 구성요소로서 표현되었으나, 보인자인 코발트가 활성에 필수적임을 알 수 있다.

(2) NA40 의 증식에 대한 온도의 영향

계대배양물 (2 ㎖)을 표 3 에 따른 배지에서 37 ℃ 에서 2 일간 배양한 후, 표 3 에 따른 배지 20 ㎖ 를 함유한 진탕 플라스크에 옮긴다. 37, 40, 45, 50 및 55 ℃에서 3 내지 4 일간 진탕하면서 배양한다. 세포 증식을 측정하고, 니트릴 히드라타제의 활성을 20 ℃에서 측정한다. 표 7 은 니트릴 히드라타제 활성 및 세포 증식에 대한 온도의 영향을 나타낸다.

(3) 여러 가지 기질에 대한 NA40 의 활성 측정을 위해, 건조 중량 0.0388 ㎎의 세포를 상기에 기재된 완충액에 배양한다. 정당한 기질을 첨가함으로써 반응을 시작하고 20 ℃에서 10 분간 진탕하면서 배양한다. 2 N HCl 0.2 ㎖를 첨가함으로써 반응을 중단시키고, 반응 혼합물을 간단히 원심분리한다. 상청액을 HPLC 또는 가스 크로마토그래피에 의해 분석한다. 표 8 은 기질 특이성에 대한 시험 조건을 나타내고, 표 9 는 각종 기질에 대한 휴지 NA40 세포의 기질 특이성을 나타낸다.

각 시험 조건은 표 8 에, 그 결과는 표 9 에 요약하였다.

o-, m-, p-클로로벤조니트릴 및 2-클로로-3-시아노피리딘을 메탄올에 용해된 반응 혼합물에 첨가하였다.

(4) 휴지 세포에서의 최적 온도 및 열적 안정성

표준 반응 혼합물 중에서 반응을 10 분간 수행한다. 최적 온도는 35 내지 40 ℃ (도 5) 이다. 그 다음, 세포를 여러 가지 온도에서 30 분간 배양하고, 표준 반응 조건하에서 활성을 시험한다. 도 4 에 나타난 바와 같이, 열 안정성은 40 ℃ 이다.

(5) 휴지 세포에서의 최적 pH 및 pH 안정성

이 목적을 위해, 인산칼륨 완충액 대신 여러 가지 0.1 M 완충액을 사용한 표준 반응 혼합물 중에서 반응을 10 분간 수행한다. 도 6 에 나타난 바와 같이, 최적 pH 는 4.5 내지 10 이다. 세포 현탁액을 여러 가지 pH 에서 20 ℃ 에서 30 분간 배양하고, 세포를 원심분리한다. 그 다음, 세포를 세척하고, 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7.0 에 재현탁시킨다. 3-시아노피리딘을 첨가하여 표준 조건하에서 반응을 10 분간 수행한다. 효소는 pH 4.5 내지 pH 10.0 에서 안정하다 (도 7).

(6) NA40 을 이용한 3-시아노피리딘으로부터 니코틴아미드의 축적

500 mM 3-시아노피리딘, 40 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.0) 및 휴지 세포 (건조 중량 2.3 ㎎) 를 함유한 반응 혼합물 (30 ㎖) 중에서 반응을 수행한다. 반응 도중, 3-시아노피리딘 (500 mM) 이 소비되자 마자 이를 7 회 첨가한다. 이런 식으로, 15 시간 동안 4.0 M 3-시아노피리딘이 첨가되고, 97.3 %의 수율에 해당하는 3.89 M (475 g/ℓ) 니코틴아미드가 형성되었다. 니코틴산은 형성되지 않았다.

실시예 3

아미콜라톱시스 속의 미생물의 동정

동정을 위해 하기 5 가지 화학주성 마커(marker)를 사용한다:

1. 펩티도글리칸의 감별용 아미노산: 메소-디아미노피멜산

2. 감별용 당: 아라비노스 및 갈락토스

3. 미콜산: 미콜산 없음

4. 메나퀴논: MK-9 (H₄)

5. 지방산 패턴: iso/anteiso-분지 및 2-히드록시를 갖는 지방산, 소량의 10-메틸-분지 지방산이 추가로 검측된다. 이 지방산 패턴은 아미콜라톱시스 속의 모든 대표예에서 발견된다 (지방산 패턴 3f).

이러한 화학적 특징의 조합은 아미콜라톱시스 속의 모든 종의 감별 지표가 된다.

두 가지 배양물의 지방산 데이터를 지방산 데이터베이스의 목록을 사용한 주성분 분석을 이용하여 비교한다. 이 방법을 이용하여, NE31 과 NA40 모두를 아미콜라톱시스 속으로 지정할 수 있지만, 상관계수가 너무 낮아서 종의 동정은 불가능하다. 그러나, 두 균주의 지방산 패턴을 비교하면, 이들은 상이한 타입의 두 가지 균주이다.

이 결과는 16S rDNA 시퀀스 분석의 결과에 의해 다시 확인된다. 여기서도, 아미콜라톱시스 속에 지정되지만, 기재된 어떤 아미콜라톱시스 종에도 지정되지 않는다. 이 방법에서, 16S rDNA 의 시퀀스는 PCR-증폭된 16S rDNA 유전자의 직접적인 시퀀싱에 의해 분석된다. 16S rDNA 시퀀스의 감별 부분을 아미콜라톱시스 속의 종 타입의 시퀀스 및 관련된 분류군의 시퀀스와 비교한다. 그 결과, 균주는 아미콜라톱시스 속에 속하는 것으로 나타났다. 아미콜라톱시스 메타놀리카 (Amycolatopsis methanolica)에 대해 96.9 % (NA40) 및 96.1 % (NE31) 로 가장 높은 일치를 나타내었다. 이 중, 두 가지 분리종이 99.0 % 의 시퀀스 일치를 나타내었다. 아미콜라톱시스 속의 대표균에 대한 본 연구로부터, 우수한 종 동정을 위해서는 상관계수가 99.5 % 보다 높아야 함을 알 수 있다. 96.9 % 에서는, 그 값이 99.5 % 보다 훨씬 낮기 때문에, 이로부터 두 가지 분리종은 공지된 아미콜라톱시스 종의 대표예가 아니라고 할 수 있다.

본 결과를 토대로, 상기 분리종은 공지된 아미콜라톱시스 종의 어떤 것에도 지정될 수 없었다. 이로부터, NA40 및 NE31 은 아미콜라톱시스 속의, 이전에 기재된 바 없는 신규한 두 가지 종이라고 간주된다.

아미콜라톱시스 속의 미생물의 동정 특성

기중균사의 색

기질균사의 색

확산된 안료의 색

당 스펙트럼

ARA +

GAL +

MAD -

XYL -

GLU v

RIB +

타입 A

DAP DL

메나퀴논 (%)

8/4 -

9/0 (+)

9/2 +

9/4 +++

9/6 -

9/8 -

16S rDNA 상동성 >99.5 %

인지질

PE +

OH-PE +

lyso PE -

met PE -

PC -

NPG -

PI +

PIM v

PG +

DPG +

GL -

타입 II+OH-PE

지방산

iso 16 +++

iso 15 +

iso 17 (+)

anteiso 15 +

anteiso 17 (+)

10-Me 16 (+)

10-Me 17 +

2-OH 15 +

2-OH 16 +

타입 3f

MS -

실시예 4

NA40 미생물 균주로부터 니트릴 히드라타제의 정제

균주를 표 3에 따른 배지에서 37 ℃에서 3 일간 배양한다. 2 ℓ 배양액의 세포를 원심분리에 의해 회수한 다음, 0.85% 강도의 NaCl 용액에 재현탁시킨다. 그 다음, 세포를 44 mM n-부티르산을 함유한 0.1 M 인산칼륨 완충액 (pH 7.0) 에 옮기고 초음파 처리한다. 세포 추출물을 원심분리하고, 세포 분획을 분리한다. 이 추출물을 사용하여 효소 정제한다.

전체 정제 과정에서, 44 mM n-부티르산을 함유한 0.1 M 인산칼륨 완충액 (pH 7.0)을 사용한다. 표 10 으로부터 알 수 있듯이, 효소를 3 단계로 균일하게 정제되었다.

실시예 5

니트릴 히드라타제의 특성 확인

(1) 분자량, 서브유니트 구조 및 코발트 이온 함량의 측정

0.2 M KCl 및 44 mM n-부티르산을 함유한 0.1 M 인산칼륨 완충액 (pH 7.0)을 사용하여 TSK 겔 칼럼 G3000 SW (0.75 ×60 cm) 상의 크로마토그래피에 의해, 분자량이 106 kDa 으로 측정되었다. 효소는 2 가지 상이한 서브유니트 α 및 β로 이루어져 있고, 그 분자량은 각각 30,000 및 26,000 인 것으로 밝혀졌다.

도 1 은 TSK 겔 G3000 SW 상 크로마토그래피에 의한 분자량 측정을 나타낸다.

도 2 는 SDS-PAGE 에 의한 분자량 측정을 나타낸다.

도 3 은 정제된 효소의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 300-400 nm 의 넓은 흡수가 관찰된다.

(2) 정제된 효소의 기질 특이성

실시예 2 (1)과 유사하게 기질 특이성을 측정한다. 결과를 표 11 에 요약하였다.

1.7 단위의 효소를 반응 혼합물 (2.0 ㎖)에 첨가한다. 반응 혼합물은 45 mM 인산 칼륨 (pH 7.0) 중에 각 기질을 함유한다.

(3) K_M값의 측정

K_M값을 "Lineweaver-Burk" 다이아그램으로 측정한 결과, 3-시아노피리딘에 대해 41.7 mM, 아크릴로니트릴에 대해 3.7 mM 이었다. K_M값이 3-시아노피리딘에 대해 200 mM인 로도코쿠스 로도크러스 J1 과 비교하였을 때, NA40 의 K_M값은 상당히 낮다. 이는 NA40 의 주요 이점중 하나이다.

(4) 열 안정성 및 최적 온도

정제된 효소를 상이한 온도에서 pH 7.0에서 30분간 배양한 다음, 3-시아노피리딘의 니코틴아미드로의 전환율을 20 ℃에서 1 분간 측정한다. 효소를 40 ℃ 초과의 온도에서 불활성화한다. 휴지 세포에서 열 안정성은 약 40 ℃ 이고, 최적 온도는 35 내지 40 ℃ 이었다 (도 5).

(5) 최적 pH 및 pH 안정성

이 목적을 위해, 3-시아노피리딘의 니코틴아미드로의 전환을, 각종 완충액 (42.5 mM), 정제된 효소 1.71 단위 및 500 mM 3-시아노피리딘을 함유한 반응 혼합물 (2.0 ㎖) 중 20 ℃에서 수행한다. 최적 pH 는 약 pH 6.5 ±1.0 (도 8)이었다.

pH 안정성을 측정하기 위해, 4.2 단위의 정제 효소를 각종 완충액 (45 mM) 중 20 ℃에서 1 시간 배양한다. 배양액의 일부, 1.71 단위를 표준 반응 혼합물에 첨가한다 (실시예 2 (1) 참조). 잔류 활성을 측정한다. 효소는 pH 5-9 의 pH 에서 안정하였다. 결과를 도 9 에 나타낸다.

(6) 저해제

각종 저해제의 영향을 측정한다. 결과를 표 12 에 요약하였다.

실시예 6

NA40 의 휴지 세포에 대한 메탄올의 영향

표 13 에 따른 0-20 % (v/v) 메탄올의 존재하에 반응을 10 분간 수행한다. 표 14 에 나타낸 바와 같이, 5-15 % 메탄올을 첨가함으로써 활성이 증가된다.

실시예 7

로도코쿠스 속의 미생물의 강화

각종 토양 시료를 표 1 에 따른 강화 배지 중에 탄소 및 질소원인 시아노아세트산과 함께 접종하고, 실시예 1 에 따라 로도코쿠스 GF270, GF578, GF473 및 GF376 미생물을 단리한다.

실시예 8

로도코쿠스 속의 미생물을 이용한 생체내 변환

(1) 로도코쿠스 로도크러스 J1과 비교한, 로도코쿠스 GF674, 로도코쿠스 GF578, 로도코쿠스 GF270 및 로도코쿠스 GF376 미생물의 열 안정성

열 안정성의 측정을 위해, 상기에 기재된 미생물을 하기 배지에 배양한다.

로도코쿠스 로도크러스 J1 을 EP-A 0 307 926 호에 기재된 배지에서 72 시간 배양한다. 로도코쿠스 GF674, GF578, GF270 및 GF376 미생물을 하기 배지에서 pH 7.0 에서 96 이하의 시간 동안 배양한다:

로도코쿠스 GF674 의 배지: 효모 추출물 1.0 g/ℓ, 프룩토스 5.0 g/ℓ, 맥아 추출물 10.0 g/ℓ, 아세트아미드 5.0 g/ℓ, KH₂PO₄2.0 g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.5 g/ℓ 및 CoCl₂·6H₂O 10.0 ㎎ 을 함유한 배지

로도코쿠스 GF578 의 배지: 효모 추출물 1.0 g/ℓ, 프룩토스 15.0 g/ℓ, 맥아 추출물 10.0 g/ℓ, 아세트아미드 25.0 g/ℓ, KH₂PO₄2.0 g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.5 g/ℓ 및 CoCl₂·6H₂O 5.0 ㎎ 을 함유한 배지

로도코쿠스 GF270 의 배지: 효모 추출물 12.5 g/ℓ, 시트르산나트륨 5.0 g/ℓ, 메타크릴아미드 7.5 g/ℓ, KH₂PO₄2.0 g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.5 g/ℓ 및 CoCl₂·6H₂O 30.0 ㎎ 을 함유한 배지

로도코쿠스 GF376 의 배지: 효모 추출물 1.0 g/ℓ, 시트르산나트륨 10.0 g/ℓ, 맥아 추출물 15.0 g/ℓ, 부티르아미드 7.5 g/ℓ, KH₂PO₄2.0 g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.5 g/ℓ 및 CoCl₂·6H₂O 15.0 ㎎ 함유한 배지

그 다음, 휴지 세포를 여러 온도에서 15 분간 배양한 다음, 잔류 활성을 실시예 2 (1)에 따른 표준 조건하에서 측정한다.

이러한 과정 중에, 로도코쿠스 GF674 는 50 ℃의 온도에서 거의 100 %, 60 ℃에서도 약 10 % 의 상대 활성을 나타내었다. 마찬가지로, 로도코쿠스 GF578 은 50 ℃에서 100 %, 60 ℃에서 20 % 의 상대 활성을 나타내었다. 로도코쿠스 GF376 은 50 ℃ 이하에서 100 %, 60 ℃ 에서 70 %, 그리고 70 ℃에서도 약 5 %의 상대 활성을 나타내었다. 로도코쿠스 GF270 은 60 ℃ 이하에서 거의 100 %의 상대 활성을 나타내었고, 마찬가지로 70 ℃에서도 5 % 의 상대 활성을 나타내었다. 이에 반해, 로도코쿠스 로도크러스 J1 은 50 ℃ 이하에서 100 %, 60 ℃에서 80 %의 상대 활성을 나타내었고, 70 ℃에서는 더 이상 활성을 나타내지 않았다.

따라서, 요약하면, 로도코쿠스 GF270 및 GF376 은 J1 및 GF270 보다 열 안정성이 우수하고, 가장 우수한 열 안정성을 갖는다고 할 수 있다.

(2) 로도코쿠스 균주의 최적 pH

로도코쿠스 GF674, GF578, GF270 및 GF376 의 니트릴 히드라타제 활성에 대한 pH 의 영향을 실시예 2 (5) 에 기재된 바에 따라 측정한다.

로도코쿠스 GF674 의 최적 pH 는 pH 7.5-9.5, 로도코쿠스 GF578 은 pH 8-8.5, 로도코쿠스 GF270 은 pH 6-7.0, 로도코쿠스 GF376 은 pH 6-8 이었다.

(3) 로도코쿠스 균주의 기질 특이성

기질 특이성을 상대 활성으로서 표 15 에 요약하였다.

(4) 로도코쿠스 균주의 니코틴아미드 축적

실시예 2 (6) 과 유사하게, 로도코쿠스 균주 GF674, GF578, GF270 및 GF376 을 3-시아노피리딘 (약 500 mM) 으로 배양한다. 이 때, 로도코쿠스 GF674 는 6 M 니코틴 아미드를 25 시간 내에, GF578 은 5.5 M 니코틴아미드를 10 시간 내에, GF270 은 약 8.5 M 니코틴아미드를 20 시간 내에, 그리고 GF376 은 7.5 M 니코틴아미드를 20 시간 내에 형성하였다.

(5) 로도코쿠스 균주의 활성에 대한 3-시아노피리딘의 내성

3-시아노피리딘의 내성을 시험하기 위해, 휴지 세포를 1 내지 10 % (w/v) 의 3-시아노피리딘 농도로 20 ℃ 에서 15 분간 배양한 다음, 원심분리에 의해 세포를 분리한다. 세포를 0.85 % NaCl 로 세척한 후, 잔류 활성을 측정한다.

기질인 3-시아노피리딘의 내성을 각종 기질 농도에서 시험한다. 로도코쿠스 로도크러스 J1의 니트릴 히드라타제 활성은 기질 농도 2 % (w/v) 에서 1/1.4 로 감소하였고, 로도코쿠스 GF674 의 니트릴 히드라타제 활성은 기질 농도 4 % (w/v) 에서 1/1.4 로 감소하였으며, 로도코쿠스 GF578 의 니트릴 히드라타제 활성은 기질 농도 8 % (w/v) 이하에서 거의 일정하였고, 로도코쿠스 GF270 의 니트릴 히드라타제 활성은 기질 농도 4 % (w/v) 에서 1/1.7 로 감소하였으며, 로도코쿠스 GF376 의 니트릴 히드라타제 활성은 기질 농도 10 %(w/v) 에서 1/1.25 로 감소하였다.

다른 로도코쿠스 균주와 비교하여, 로도코쿠스 로도크러스 J1 은 3-시아노피리딘에 대해 가장 열등한 내성을 나타내었다.

Claims

니트릴을 아미드로 전환시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 아미콜라톱시스 (Amycolatopsis) 또는 악티노마두라 (Actinomadura) 속의 미생물, 및 이들의 효소 추출물.
제 1 항에 있어서, 예를 들어 수탁번호 DSM 11617 및 DSM 11616 으로 수탁된 것과 같은 아미콜라톱시스 NA40 및 아미콜라톱시스 NE31 종의 미생물, 및 기능적으로 동등한 이들의 변종 및 변이체.
니트릴을 아미드로 전환시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 예를 들어 수탁번호 DSM 12211 및 DSM 12175 로 수탁된 것과 같은 로도코쿠스 GF270 및 GF376 종의 미생물, 및 기능적으로 동등한 이들의 변종 및 변이체, 및 이들의 효소 추출물.
제 1 항 및 제 2 항에 따른 미생물로부터 수득될 수 있는 니트릴 히드라타제 활성을 가진 효소.
제 4 항에 있어서,

a) 최적 pH 가 pH 6.5 ±1.0 이고,

b) pH 7.0 에서의 최적 온도가 35 내지 40 ℃ 이고,

c) 기질인 3-시아노피리딘에 대한 K_M값이 41.7 mM ±7.7 mM 임을 특징으로 하는 효소.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 따른 미생물에 의해, 이들 미생물의 효소 추출물을 이용하거나, 또는 제 4 항에 따른 효소에 의해, 기질인 니트릴을 해당하는 아미드로 전환시키는 것을 특징으로 하는 아미드의 제조 방법.
제 6 항에 있어서, 사용된 니트릴이 1 내지 10 개의 탄소 원자를 가지며, 경우에 따라 치환된 지방족 니트릴인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 사용된 니트릴이 방향족 고리계 내에 4 내지 10 개의 탄소 원자를 가지며, 경우에 따라 치환된 방향족 니트릴인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 방향족 니트릴이 하기 화학식 I 또는 II 의 화합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:

[화학식 I, II]

[식에서, R¹및 R²는 수소 원자, 할로겐 원자 또는 C_1-4-알킬이다.]
제 6 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서, 0 내지 50 ℃ 의 온도 및 4.5 내지 10 의 pH 에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, NA40 (DSMZ 11617) 또는 NE31 (DSMZ 11616)으로 지정된 아미콜라톱시스 속의 미생물 또는 기능적으로 동등한 이들의 변종 및 변이체에 의해 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.