SK283395B6

SK283395B6 - Mikroorganizmy rodu Amycolatopsis alebo Actinomadura, enzýmy z nich získané a spôsob výroby amidov

Info

Publication number: SK283395B6
Application number: SK19-2000A
Authority: SK
Inventors: Karen Tracey Robins; Toru Nagasawa
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1997-07-22
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2003-07-01
Also published as: HU226274B1; US7105322B2; EA009075B1; IL133754A0; TR200000150T2; JP2001511355A; NO996401D0; US20030148478A1; HUP0003069A3; US7595178B2; DK1002122T3; WO1999005306A1; PT1002122E; CZ299166B6; US7556956B2; CN1108372C; CA2294621C; JP4302876B2; ES2190098T3; US20080057550A1

Abstract

Opisuje sa nový biotechnologický spôsob výroby amidov z nitrilov. Na tento spôsob sa používajú mikroorganizmy rodu Amycolatopsis, Actinomadura alebo Rhodococcus.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových mikroorganizmov rodu Actinomadura, Amycolatopsis a Rhodococcus. Ďalej sa vynález týka spôsobu výroby amidov použitím týchto mikroorganizmov, prípadne použitím enzýmových extraktov týchto mikroorganizmov.

Doterajší stav techniky

Pre amidy, ako je napríklad nikotínamid, ktorý je pre človeka a zvieratá esenciálnym vitamínom vitamínov B-komplexu, je známych viacej biotechnologických spôsobov. Všeobecne sa vie, že mikroorganizmy obsahujúce nitrilhydratázu premieňajú nitrily na zodpovedajúce amidy. EP-A-0 188 316 opisuje spôsob výroby nikotínamidu z 3-kyanpyridínu použitím mikroorganizmov rodu Rhodococcus, Arthrobacter alebo Mikrobacterium.

Nevýhodou pri tomto spôsobe je to, že mikroorganizmy majú na premenu 3-kyánpyridínu na nikotínamid len malú aktivitu.

EP-A-0 307 926 opisuje premenu 3-kyánpyridinu na nikotínamid pomocou mikroorganizmov druhu Rhodococcus rhodochrous Jl. Aby tieto mikroorganizmy katalyzovali potrebnú reakciu, musia sa indukovať. Ďalšou nevýhodou tohto spôsobu je to, že Rhodococcus rhodochrous Jl má červené zafarbenie a tým dochádza k zafarbeniu produktu. Ďalej má tento mikroorganizmus malú tepelnú stabilitu a napríklad substrátom 3-kyánpyridínom sa inhibuje.

Ďalší spôsob výroby nikotínamidu z 3-kyánpyridínu pomocou mikroorganizmov druhu Rhodococcus rhodochrous Jl sa opisuje v EP-A-0 362 829. Na zvýšenie špecifickej aktivity mikroorganizmov obsahujúcich nitrilhydratázu sa ku kultivačnému médiu pridala močovina, prípadne derivát močoviny ako induktor. Rovnako ako pri predchádzajúcom spôsobe tak aj pri tomto dochádza k zafarbeniu produktu.

Ďalej opisuje WO 95/17 505 spôsob výroby aromatických amidov zo zodpovedajúcich nitrilov pomocou mikroorganizmov druhu Rhodococcus rhodochrous M33. Nevýhodou tohto spôsobu je červené zafarbenie Rhodococcus rhodochrous M33 a vysoká hodnota K_M pre substrát 3-kyánpyridín.

Úlohou predloženého vynálezu bolo teda odstrániť tieto nedostatky a poskytnúť spôsob výroby amidov, pri ktorom sa môžu izolovať zodpovedajúce amidy v dobrom výťažku a čistote.

Podstata vynálezu

Táto úloha sa rieši pomocou nových mikroorganizmov podľa nároku 1 a 3 a spôsobom podľa nároku 6.

Spôsob podľa vynálezu sa uskutočňuje tak, že sa nitril ako substrát premení na zodpovedajúci amid pomocou mikroorganizmov rodu Actinomadura, Amycolatopsis alebo Rhodococcus, pomocou enzýmového extraktu z týchto mikroorganizmov alebo pomocou čistenej nitrilhydratázy mikroorganizmov rodu Amycolatopsis alebo Actinomadura.

Nitrily použité na biotransformáciu, ako napríklad 3-kyanpyridín, sú komerčne dostupné zlúčeniny.

Mikroorganizmy podľa vynálezu majú schopnosť premeniť nitrily ako substráty na zodpovedajúce amidy. Výhodne majú tieto mikroorganizmy schopnosť rásť na nitriloch alebo amidoch ako jedinom zdroji uhlíka a/alebo dusíka.

Mikroorganizmy podľa vynálezu sa získajú vhodnou selekciou napríklad zo vzoriek pôdy, kalu alebo odpadových vôd pomocou zvyčajných mikrobiologických technik. Účelne sa mikroorganizmy podrobia selekcii pestovaním s nitrilmi alebo amidmi ako výhodne jediný zdroj uhlíka alebo dusíka v prítomnosti iónov kobaltu. Nitrily a amidy vhodné na selekciu sú najmä tie nitrily, ktoré sa tiež používajú pri neskoršej biotransformácii ako substráty a z toho vzniknuté zodpovedajúce amidy.

Vhodné rastové médiá sú pre odborníka taktiež známe, napríklad môže sa použiť médium opísané v tabuľke 1.

Zvyčajne sa mikroorganizmy taktiež rovnakým spôsobom kultivujú pred vlastnou biotransformáciou, pričom sa používajú uvedené médiá.

Ako je v odbore známe, nitrilhydratáza sa tvorí iba vtedy, ak kultivačné médium obsahuje ióny kobaltu ako kofaktor. Vhodné zlúčeniny kobaltu, ktoré poskytujú ióny kobaltu, sú soli Co²⁺ alebo Co³⁺. Príklady solí Co²⁺ a Co³⁺ sú chloridy, sulfáty a acetáty kobaltu.

Účelne sa ako zlúčenina kobaltu použije soľ Co²⁺, ako napríklad CoCl₂. Kultivácia sa môže tiež uskutočňovať v prítomnosti vitamínu B₁₂ spolu s kovovým kobaltom alebo inými zlúčeninami kobaltu, ktoré vytvárajú ión kobaltu in situ. Účelne sa použije zlúčenina kobaltu v množstve od 1 do 10 mg/1, výhodne od 1 do 3 mg/1. Zvyčajne sa kultivácia uskutočňuje pri teplote od 20 do 50 °C a pri hodnote pH medzi 5 a 8, výhodne od 30 do 45 °C a medzi pH 5,5 a 7,5.

Vlastná biotransformácia sa môže uskutočniť pomocou mikroorganizmov rodu Actinomadura, Amycolatopsis, pomocou enzýmového extraktu z týchto mikroorganizmov alebo pomocou čistenej nitrilhydratázy z týchto mikroorganizmov. Účelne sa biotransformácia uskutočňuje s mikroorganizmami druhu Actinomadura spadix, napríklad s izolátmi Actinomadura spadix £3733, Actinomadura spadix £3736, Actinomadura spadix 45A32, Actinomadura spadix 4501 alebo Actinomadura spadix C15. Výhodne sa biotransformácia uskutočňuje s mikroorganizmami druhu Amycolatopsis NE31 a Amycolatopsis NA40 alebo ich funkčne ekvivalentnými variantmi alebo mutantmi. Obzvlášť výhodne sa používajú mikroorganizmy druhu Amycolatopsis NA40. Mikroorganizmy uvedených druhov sa uložili podľa Budapeštianskej dohody 03. 06. 1997 do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH, Mascheroderweg 1 b, D-38124 Braunschweig po označením Amycolatopsis NE31 a Amycolatopsis NA40 a dostali číslo uloženia DSMZ 11616, prípadne DSMZ 11617. Obidva tieto mikroorganizmy sa presnejšie identifikovali a môžu sa zaradiť ako druhy rodu Amycolatopsis, ktoré sa ešte v literatúre neopisujú.

Vynález sa teda taktiež týka mikroorganizmov rodu Amycolatopsis alebo Actinomadura, ktoré sú schopné premeniť nitril na amid, najmä mikroorganizmy s označením Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) a Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616).

Ďalej sa zistilo, že špeciálne mikroorganizmy rodu Rhodococcus majú lepšie vlastnosti na premenu nitrilov na amidy ako mikroorganizmus Rhodococcus rhodochrous Jl, ktorý sa opisuje v EP-A 0 362 829. Tieto mikroorganizmy sú Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF270 (DSMZ 12211) a Rhodococcus GF376 (DSMZ 12175) alebo ich funkčne ekvivalentné varianty a mutanty. Mikroorganizmus DSMZ 12175 sa uložil 15. 5. 1998 a mikroorganizmus DSMZ 12211 dňa 8. 6. 1988 do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH podľa Budapeštianskej zmluvy. Kmene Rhodococcus GF270, GF376, GF473, GF578 a GF674 sa priradili rodu Rhodococcus na základe identifi kácie v literatúre dosiaľ neopísaných druhov. Vynález sa teda taktiež týka mikroorganizmov Rhodococcus GF270, Rhodococcus GF376, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF578 a Rhodococcus GF674.

Oproti mikroorganizmom rodu Actinomadura, prípadne Amycolatopsis sa mikroorganizmy rodu Rhodococcus účelne pred vlastnou reakciou indukujú. Ako induktory sú vhodné induktory opísané v EP-A-0 307 926, ako napríklad acetamid, amid kyseliny maslovej, metakrylamid, amid kyseliny propiónovej, krotonamid a amid kyseliny valerovej.

Pod pojmom „funkčne ekvivalentné varianty a mutanty“ sa rozumejú mikroorganizmy, ktoré sa odvodzujú od uvedených pôvodných organizmov a majú v podstate rovnaké vlastnosti a funkcie. Takéto varianty a mutanty môžu vzniknúť náhodne, napríklad UV ožiarením alebo vplyvom mutagénnych chemikálií.

Identifikácia Amycolatopsis NA40
farba vzduch-mycela	biela
farba substrát-mycela	oranžová
farba difund. pigment	-
spektrum cukrov
ARA	+
GAL	+
MAD	-
XYL	-
GLU	tr
RIB	+
Typ	A
DAP	DL
menachinóny (v %)
8/4	-
9/0	(+)
9/2	+
9/4	+++
9/6	-
9/8	-
homológia 16S rDNA	96,9 %
fosfolipidy ako	nezisťované
PE, OH-PE, lyso, PE, met PE,
PC, NPG, PI, PIM, PG, DPG, GL
mastné kyseliny
izo 16	+++
izo 15	+
izo 17	(+)
anteizo 15	(+)
anteizo 17	(+)
10-me 16	-
10-me 17	4-
2-OH 15	+
2-OH 16	+
Typ	3f
MS	-
Identifikácia Amycolatopsis NE31
farba vzduch-mycela	biela
farba substrát-mycela	oranžová
farba difund. pigment	-
spektrum cukrov
ARA	+
GAL	+
MAD	-
XYL	-
GLU	tr
RIB	+
Typ	A

DAP	DL
menachinóny (v %)
8/4	-
9/0	(+)
9/2
9/4	+++
9/6	-
9/8	-
homológia 16S rDNA	96,1 %
fosfolipidy ako	nezisťované
PE, OH-PE, lyso, PE, met PE,
PC, NPG, PI, PIM, PG, DPG, GL
mastné kyseliny
izo 16	+++
izo 15	+
izo 17	ω
anteizo 15	w
anteizo 17	ω
10-me 16	-
10-me 17	+
2-OH 15	+
2-OH 16	+
Typ	3f
MS	-

Skratky a vysvetlivky na identifikáciu (+) 1-5 % + 5-15 % ++ 15-30% +++ >30 %

DAP kyselina diaminopimelová

ARA arabinóza

GAL galaktóza

MAD maduróza

XYL xylóza

GLU glukóza

RIB ribóza typy cukrov podľa Lechevalier a spol. 1971 mastné kyselinové typy podľa Kroppenstedt 1985 a 1992

9/4 MK-9 (H₄)

9/6 MK-9 (H₆)

9/8 MK-9 (H₈)

MS kyselina mykolová

PE fosfatidyletanolamín

OH-PE hydroxy-PE met PE fosfatidimetyletanolamín

PC fosfatidylcholín

NPG fosfatidylglukozamín

PI fosfatidylinozitol

PIM fosfatidylinozitolmanozid

PG fosfatidylglycerol

DPG difosfatidylglycerol

GL glykolipidy mastné kyseliny izo-16 kyseliny izo-hexadckanové alebo

14metyl-pentadekano vé

10-me-18 kyselina tuberkulosteárová

2-OH-16 kyselina 2-hydroxypalmito vá

Identifikácia GF270, GF376, GF473, GF578 a GF674 Identifikácia týchto kmeňov je založená na 5 od seba nezávislých vlastnostiach

1. Morfológia a farba kolónií: krátke rozvetvené hýíý, ktoré dezintegrujú do častíc podobných tyčinkám a spóram.

Kolónie GF270 a GF376 sú lososovo ružovej farby (RAL 3022) a GF578 a GF674 svetločervenej (RAL 3012).

2. Diaminokyseliny peptidoglykánu: kys. mezo-diaminopimelová

3. Kyseliny mykolové: mykolové kyseliny mikroorganizmu Rhodococcus·. Stanovenie mykolových kyselín s dlhým reťazcom sa uskutočnilo pomocou vysokotepelnej plynovej chromatografie. Elučné profily mykolových kyselín od GF270 a GF376, rovnako ako GF473, GF578 a GF674 boli identické. DÍžka mykolových kyselín pre GF270 a GF376 bola C₃₈-C₄₆ a pre GF473, GF578 a GF674 bola C₄₀-C₄₈. Vzorky mykolových kyselín sa porovnávali so vzorkami mykolových kyselín kmeňa Rhodococcus GF270 sa identifikoval ako patriaci k Rhodococcus rhodochrous s veľmi nízkym korelačným faktorom (0,086). GF376 nebolo možné touto metódou identifikovať. Ostatné tri izoláty GF473, GF578 a GF674 sa identifikovali ako patriace k Rhodococcus ruber s veľmi malým korelačným faktorom.

4. Vzorka mastných kyselín: nerozvetvené nasýtené a nenasýtené mastné kyseliny vrátane kyseliny tuberkulosteárovej. Vzorka mastných kyselín je diagnostická pre všetky rody Rhodococcus a blízke príbuzné Mycobacterium, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella a niektoré druhy Corynebaktérii. Identifikácia na úrovni druhu sa získala kvalitatívnymi a kvantitatívnymi rozdielmi vo vzorke mastných kyselín z GF270, GF376, GF473, GF578 a GF674 a vzorke mastných kyselín z druhov Rhodococcus.

5. Čiastočné sekvencie 16S r DNA GF270 a GF376 boli identické (100 %), hoci ich porovnanie s kmeňmi Rhodococcus malo len 99,1 % podobnosť k najbližšie príbuznému Rhodococcus rhodochrous GF473 a GF578 boli identické vo svojej sekvencií 16S r DNA (100 %). GF674 je rozdielny od GF578 iba v jednom páre zásad z 500 (99,8 %). Všetky tri izoláty vykázali len vzdialenú príbuznosť k Rhodococcus coprophilus (98,4 %).

Na základe chemotaxických a molekulámobiologických výsledkov je možné dokázať, že GF270, GF376 na jednej strane a GF473, GF578, GF674 na strane druhej sú kmene 2 nových druhov Rhodococcus GF270 a GF376 sú blízko príbuzné k Rhodococcus rhodochrous vo svojej 16S r DNA (99,1 %), naproti tomu GF473, GF578, GF674 sú vzdialene príbuzné k Rhodococcus coprophilus (98,4 %).

Enzýmový extrakt je možné získať pomocou v odbore bežne používaného „otvorenia“ mikroorganizmov, ako napríklad otvorením pomocou ultrazvuku, pomocou Frenchovej tlakovej metódy alebo lyzozymovej metódy. Tento enzýmový extrakt, ako i samozrejme celé bunky mikroorganizmu sa môžu na uskutočnenie spôsobu imobilizovať na vhodnom nosiči, zvyčajne uloženom na polyméri, alebo sa môžu absorbovať na vhodnom nosiči.

Enzýmy s nitrilhydratázovou aktivitou podľa vynálezu je možné získať z mikoorganizmov rodu Amycolatopsis a sú schopné premieňať nitril na amid. Možno ich získať najmä z Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617).

Tieto enzýmy vykazujú najmä nasledujúce vlastnosti:

a) pH-optimum pH 6,5 ± 1,0,

b) teplotné optimum medzi 35 a 40 °C pri pH 7,0,

c) hodnotu K_M pre substrát 3-kyánpyridín 41,7 ± 7,7 mM (20 °C, 45 mM fosfátového tlmivého roztoku, pH 7,0) enzýmy majú najmä

d) molekulovú hmotnosť 106 kDa, ako je napríklad stanovené pomocou SDSPAGE.

Ako substráty na biotransformáciu je možné použiť všeobecne nitrily. Účelne sa používajú buď alifatické nitrily s 1 až 10 atómami uhlíka, prípadne substituované, napríklad skupinami hydroxy, amino, halogén alebo karboxy,

alebo substituované alebo nesubstituované aromatické nitrily so 4 až 10 atómami uhlíka v aromatickom kruhu. Ako alifatické nitrily s 1 až 10 atómami uhlíka sa môžu použiť dinitrily, hydroxynitrily, aminonitrily ako napríklad oktánnitril, kyselina kyánoctová, izokapronitril, n-valeronitril, adiponitril, glutaronitril, sukcinonitril, sebakonitril, propionitril, krotonitril, akrylnitril, metakrylnitril, nitril kyseliny n-maslovej alebo acelanitril. Ako aromatické nitrily so 4 až 10 atómami uhlíka sa môžu použiť nitrily všeobecného vzorca (I) alebo (II)

R²

O-^cn '

N

CN v ktorom R¹ a R² znamená atóm vodíka, atóm halogénu alebo C_M-alkyl. Ako atóm halogénu sa môže použiť F, Cl, Br alebo I. Ako C_M-alkyl sa môže použiť metyl, etyl, propyl, izopropyl, terc.propyl, butyl, izobutyl alebo terc.butyl. Účelnými zástupcami aromatických nitrilov všeobecných vzorcov (I) alebo (II) sú 2-, 3- alebo 4-kyánpyridín, benzonitril, fluór-, chlór-, brómbenzonitril, ako napríklad o-, m-, p-chlórbenzonitril alebo 2-chlór-3-kyanpyridín. Výhodne sa ako aromatický nitril so 4 až 10 atómami uhlíka používa 3-kyánpyridín.

Účelne sa biotransformácia uskutočňuje pri jednorazovom alebo kontinuálnom pridávaní substrátu tak, aby koncentrácia substrátu nepresiahla 40 % hmotn., výhodne 30 % hmotn.

Účelne sa spôsob uskutočňuje s bunkami v pokoji (ktoré nerastú).

Ako médiá na biotransformáciu sú vhodné zvyčajne používané v odbore, ako napríklad nízkomolekulový fosfátový tlmivý roztok, HEPES-tlmivý roztok, citrátový tlmivý roztok, borátový tlmivý roztok, médiá uvedené v tabuľke 1 až 3, prípadne ich odvodená forma, ako napríklad médiá opísané v príklade 8 (1) alebo TRIS/HC1 tlmivý roztok.

Účelne sa biotransformácia uskutočňuje pri teplote od 0 do 50 °C a pri hodnote pH medzi 4,5 a pH 10, výhodne pri teplote od 20 do 40 °C a pri hodnote pH medzi 4,5 a pH 10,0.

V obzvlášť výhodnom uskutočnení sa môže biotransformácia uskutočniť v prítomnosti C|.₄-alkoholu. Ako Ci 4-alkoholy sa môžu použiť metanol, etanol, propanol alebo butanol. Výhodne sa používa metanol.

Po reakcii sa potom môžu zodpovedajúce amidy izolovať zvyčajnými metódami spracovania, ako napríklad kryštalizáciou.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Kultivácia mikroorganizmov rodu Actinomadura a Amycolatopsis

a) Rôzne vzorky pôdy sa naočkovali vo všeobecnom médiu podľa tabuľky 1 rôznymi nitrilmi alebo amidmi ako zdroja uhlíka a dusíka a nechali sa 7 - 10 dni pri 37 alebo 45 °C. Potom sa kultúry preočkovali v rovnakom médiu a ešte raz kultivovali 7-10 dní pri 37 °C. To všetko sa trikrát opakovalo. Potom sa kultúry zriedili a rozprestreli, aby sa získali jednotlivé kolónie. Dosky sa nechali 5 dní pri 37 °C. Potom sa rozdielne kolónie testovali na požadovanú aktivitu.

Takto sa izolovali Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) a Amycolatopsis FlElí (DSMZ 11616)apotom sa pestovali v optimalizovamom médiu (tabuľka 3) 90- 100 hod. trepaním pri 37 °C.

Pre Amycolatopsis NE31 (DSMZ 1\6Í6), Actinomadura spadix E3733 a Actinomadura spadix E3736 slúžil adiponitril ako zdroj uhlíka a dusíka, pre Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617), Actinomadura spadix 45A32 slúžil acelanitril ako zdroj uhlíka a dusíka, pre Actinomadura spadix 4501 slúžil noktanitril ako zdroj uhlíka a dusíka a pre Actinomadura spadix C15 slúžil kyánoctan ako zdroj uhlíka a dusíka.

b) Amycolatopsis NA40 sa pestoval v médiu podľa tabuľky 3. Kultivovalo sa v subkultúrach (4 ml/rúrku) a v „hlavnej kultúre“ (500 ml/banku) za aeróbnych podmienok pri teplote 37 °C 2 prípadne 3 až 4 dni. Bunkový rast sa meral turbometricky pri 610 nm a suchá váha buniek sa spočítala nasledovne: hmotnosť suchých buniek v mg/ml = OD₆₁₀nm x 0,277.

Tabuľka 1 Obohacovacie médium

Nitril	2,0 g
KH₂PO₄	7,0 g
MgSO₄.7H₂O	0,1 g
zmes vitamínov	1,0 ml
CoCl₂.6H₂0	2,0 mg
FeSO„.7H-O	2.0 mg
Doplniť vodou na	1 1 (pH 6,7 - 7,3)
Tabuľka 2
Základné médium
Maltóza	2,0 g
NaNO₃	1,0 g
KH₂PO₄	0,1 g
MgSO₄.7H,O	0,05 g
Doplniť vodou na	100 ml (pH 7,0)
Tabuľka 3
ODtimalizované médium
D-glukóza	4,5 g
mäsový extrakt	0,5 g

KH₂PO₄ 0,1 g

MgSO₄.7H₂O 0,05 g

CoC1₂.6H,O 1,0 mg__________

Doplniť vodou na 100 ml (pH 7,0)

Príklad 2

Biotransformácia pomocou mikroorganizmov rodu Actinomadura a Amycolatopsis

1. Na stanovenie aktivity nitrilhydratázy sa inkubovala reakčná zmes (2 ml), 3-kánpyridín (1,0 M, 1,0 ml), káliumfosfátový tlmivý roztok (pH 7,0, 0,1 M, 0,5 ml) a 0,5 ml bunkovej suspenzie za miešania pri 20 °C počas 30 min. Reakcia sa skončila pridaním 0,2 ml 3 N HCI. Po krátkom odstredení sa vytvorený nikotínamid stanovil pomocou HPLC (systém Schimadzu SPD 6A so stĺpcom C18 (Develosil ODS-HG-5,4,6x250 cm); prietokový prostriedok: 10 mM KH₂PO₄/H₃PO₄ (pH 2,8)/acetonitril 9 : 1 (objem/objem); prietoková rýchlosť: 1 ml/min.; absorpcia sa merala pri 230 nm). Špecifická aktivita sa vyjadrila ako pmol vytvoreného nikotínamidu/ml/min/OD₆₁₀ nm.

Pomery' premeny alifatických nitrilov v obohacovacom médiu (tabuľka 1) s izolovanými baktériami sú zhrnuté v tabuľke 5, vplyv induktorov a kofaktorov v základnom médiu (tabuľka 2) je zhrnuté v tabuľke 4 a porovnanie aktivity Amycolatopsis k Rhodococcus v základnom médiu (tabuľka 2) je zhrnuté v tabuľke 6. Výsledky z tabuľky 4 ukazujú, že nitrilhydratáza z Amycolatopsis NA40 je konštitutívne exprimovaná, ale pre aktivitu je potrebný kofaktor kobalt.

2. Vplyv teploty na rast Na40

Subkultúry (2 ml) sa inkubovali v médiu podľa tabuľky 3 počas 2 dní pri 37 °C, tie sa potom preočkovali do baniek trepačky s 20 ml média podľa tabuľky 3. Kultivovalo sa pri 37, 40, 45, 50 a 55 °C počas 3 až 4 dní za trepania. Meral sa bunkový rast a aktivita nitrilhydratázy sa zisťovala pri 20 °C. Tabuľka 7 ukazuje vplyv teploty na aktivitu nitrilhydratázy a na bunkový rast.

Tabuľka 4

Vplyv induktorov a kofaktorov na špecifickú aktivitu v základnom médiu

Induktor	Rast (OD₆io nm)	Celková aktivita (pmol/ml/tnin.)	Špecifická aktivita (pmol/ml/min./OD)
-	1,26	20,9	16,6
ε-kaprolaktám	0,66	9,52	14,5
krotonamid	3,41	22,9	6,72
metakrylamid	3,33	2,46	0,74
butyramid	2,19	0,19	0,88
propionamid	1,91	0,92	0,48
močovina	1,72	2,97	1,73

Kofaktor	Rast (OD₆₁₀ nm)	Celková aktivita (pmol/ml/min.)	Špecifická aktivita (pmol/ml/min./OD)
-	7,97	0,10	0,01
FeSO₄.7H₂O	8,32	3,36	0,40
CoCl₂.6H₂O	8,41	47,8	5,68

Tabuľka 5

Reakčné p ými baktériami nitrilov s i

Kmene	Substráty	Rast (OD₆₁o nm)	Celková aktivita (pmol/ml/min.)	Špecifická aktivita (pmol/ml/min./OD)
Amycolatopsis
NE31
(DSMZ 11616)	adiponitril	2,68	0,377	0,141
Actinomadura
spadix E3733	adiponitril	1,62	0,347	0,214
spadix E3736	adiponitril	1,36	3,00	2,21

spadix 45A32	acelanitril	5,81	18,8	3,23
spadix 4501	n-oktánnitril	7,24	32,2	4,45
spadix Cl5	kys. kyánoctová	2,04	7,01	3,43
Amycolatopsis NA40 (DSMZ11617)	acelanitril	5,92	33,0	5,57

Tabuľka 6

Aktivita Amycolatopsis v porovnaní s Rhodococcus rhodochrous J1

	Mikroorganizmus Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) (pmol/ml/min.)	Mikroorganizmus Rhodococcus rhodochrousJ1
Aktivita pre 3-kyánpyridín	303	314
	vyčistený enzým z NA40 (pmol/min./mg proteínu)	Vyčistený enzým z J1 (pmol/min./mg proteínu)
Aktivita pre 3-kyánpyridín	1110	371

3. Na stanovenie aktivity NA40 oproti viacerým substrátom sa bunky s hmotnosťou sušiny 0,0388 mg inkubovali v uvedenom tlmivom roztoku. Reakcia sa začala pridaním zodpovedajúceho substrátu a 10 min. sa inkubovalo za trepania pri 20 °C. Reakcia sa skončila pridaním 0,2 ml 2N HCl a rekčná zmes sa krátko odstredila. Supematant sa a nalyzoval pomocou HPLC alebo plynovej chromatografie. Tabuľka 8 ukazuje podmienky testu vzhľadom na substrátovú špecifitu a tabuľka 9 ukazuje substrátovú špecifitu buniek NA40 v pokoji pre rôzne substráty.

Jednotlivé podmienky testu sú zhrnuté v tabuľke 8 a výsledky sú v tabuľke 9.

Tabuľka 7

Vplyv teploty pri raste na aktivitu nitrilhydratázy a na rast buniek

Teplota	Rast (mg/ml)	Celková aktivita (pmol/ml/min.)	Špecifická aktivita (pmol/ml/min./mg)	Relatívna aktivita (%)
37 °C	6,16	4,96	0,761	100
40 °C	5,79	9,89	1,71	225
45 °C	6,56	4,83	0,736	97
50 °C	5,96	1,16	0,195	26

Tabuľka 8

Podmienky testu oproti substrátovej špecifite

Substrát	Substrát (mM)	Metóda analýzy	Vytvorený amid
3-kyánpyridín	1,0	HPLC	nikotínamid
2-kyánpyridín	0,25	HPLC	2-pikolínamid
4-kyánpyridín	0,25	HPLC	pyridín-4-karboxamid
krotonitril	0,4	HPLC	krotonamid
benzonitril	0,03	HPLC	benzamid
akrylonitril	0,4	HPLC	akrylamid
o-chlórbenzonitril	0,15	HPLC	o-chlórbenzamid
m-chlórbenzonitril	0,15	HPLC	m-chlórbenzamid
p-chlórbenzonitril	0,15	HPLC	p-chlórbenzamid
2-chlór-3-kyánpyridín	0,15	HPLC	2-chlómikotínamid
acetonitril	0,4	GC	acetamid
propionitril	0,4	GC	propionamid
metakrylnitril	0,4	GC	metakrylamid
n-butyronitril	0,4	GC	n-butyramid

o-, m-, p-chlórbenzonitril a 2-chlór-3-kyánpyridín sa rozpustil v metanole a pridal sa k reakčnej zmesi.

Tabuľka 9 Substrátová

Substrát	Relatívna aktivita (%)	Substrát	Relatívna aktivita (%)
3-kyánpyridín	100	m-chlórbenzonitril	75
4-kyánpyridín	168	p-chlórbenzonitril	16
2-kyánpyridin	128	2-chlór-3 -kyánpyridín	126

benzonitril	51	acetonitril	-
krotonitril	52	propionnitril	105
akrylnitril	115	metakrylnitril	130
o-chlórbenznitril	96	butyronitril	194

4. Teplotné optimum teplotná stabilita v bunkách v pokoji

Reakcia sa uskutočňovala 10 min. v štandardnej reakčnej zmesi. Teplotné optimum bolo medzi 35 a 40 °C (obr. 5). Potom sa bunky 30 min. inkubovali pri rôznych teplotách a testovala sa aktivita pri štandardných reakčných podmienkach. Ako vidno z obr. 4, teplotná stabilita je cca pri 40 °C.

5. pH optimum a pH stabilita v bunkách v pokoji

Pre toto sa reakcia uskutočňovala 10 min. v štandardnej reakčnej zmesi, v ktorej bol káliumfosfátový tlmivý roztok vymenený rôznymi 0,1 M tlmivými roztokmi. Ako vidieť z obr. 6, je pH optimum medzi 4,5 a 10. Potom, čo sa bunková suspenzia inkubovala 30 min. pri rôznych hodnotách pH pri 20 °C, sa bunky odstredili. Potom sa bunky premyli a resuspendovali v 0,1 M káliumfosfátovom tlmivom roztoku pH 7,0. Reakcia sa uskutočňovala 10 min. pridaním 3-kyánpyridínu za štandardných podmienok. Enzým bol stabilný medzi pH 4,5 a pH 10,0 (obr. 7).

6. Akumulácia nikotínamidu z 3-kyánpyridínu pomocou NA40

Reakcia sa uskutočnila v reakčnej zmesi (30 ml), ktorá obsahovala 500 mM 3-kyánpyridínu, 40 mM káliumfosfátového tlmivého roztoku (pH 7,0) a bunky v pokoji (hmotnosť sušiny 2,3 mg). V priebehu reakcie sa 7-krát pridal 3-kyánpyridín (500 mM), keď sa spotreboval. V priebehu 15 hod. sa takto pridalo 4,0 M 3-kyánpyridínu, vytvorilo sa 3,89 M (475 g/1) nikotínamidu, čo zodpovedá výťažku 97,3 %. Kyselina nikotínová sa nevytvorila.

Príklad 3

Identifikácia mikroorganizmov rodu Amycolatopsis

Nasledujúcich 5 chemotaxonomických znakov podporilo identifikáciu:

1. Diagnostická aminokyselina peptidoglykánu: kyselina mezo-diaminopimelová

2. Diagnostické cukry: arabinóza a galaktóza

3. Kyseliny mykolové: chýbajú kyseliny mykolové

4. Menachinóny: MK-9(H₄)

5. Vzorka mastných kyselín: izo/anteizo-rozvetvené a 2hydroxymastné kyseliny, malé množstvá metylrozvetvených mastných kyselín sa dodatočne dokázali. Táto vzorka mastných kyselín sa našla u všetkých zástupcov rodu Amycolatopsis (vzorka mastných kyselín 3 f).

Kombinácia týchto chemických znakov je diagnostická pre všetky druhy rodu Amycolatopsis.

Údaje pre mastné kyseliny obidvoch kultúr sa pomocou analýzy hlavných zložiek porovnávali s údajmi banky údajov mastných kyselín. Touto metódou sa NE31 a tiež NA40 priradil rodu Amycolatopsis, ale identifikácia druhu nebola možná, pretože korelačný faktor bol príliš nízky. Porovnanie vzorky mastných kyselín obidvoch kmeňov tiež ukázalo, že ide o dva kmene rôznych druhov. Výsledok sa potvrdil výsledkami sekvenčnej analýzy 16S rDNA. Taktiež tu prišlo k priradeniu k rodu Amycolatopsis, ale k žiadnemu opísanému druhu Amycolatopsis. Pri tejto metóde sa sekvencia 16S rDNA určovala priamym sekvencovaním PCR amplifikovaného génu 16S rDNA. Diagnostická časť sekvencie 16S rDNA sa porovnávala so sekvenciami typových druhov rodu Amycolatopsis a príbuznými taxa. Výsledok ukázal, že kmeň patrí rodu Amycolatopsis. Najväčší súhlas 96,9 % (NA40) a 96,1 % (NE31) sa našiel k Amycolatopsis methanolica. Obidva izoláty preukazovali medzi sebou 99,0 % súhlas v sekvenciách. Naše štúdie týkajúce sa zástupcov rodu Amycolatopsis preukázali, že pre dobrú identifikáciu druhu by korelačný faktor musel byť vyšší ako 99,5 %. Pretože hodnota 96,9 % leží zreteľne pod 99,5 %, je z toho možné vyvodiť, že pri obidvoch izolátoch nejde o zástupcu známych druhov Amycolatopsis.

Na základe predložených výsledkov nebolo možné izoláty priradiť známym druhom Amycolatopsis. Vychádzali sme z toho, že pri NA40 a NE31 ide o kmene dvoch dosiaľ neopísaných druhov rodu Amycolatopsis.

Identifikčná charakteristika mikroorganizmov rodu Amycolatopsis farba vzduch-mycela

farba substrát-mycela
farba difund. Pigment
spektrum cukrov
ARA	T
GAL	4-
MAD	-
XYL	-
GLU	V
RIB	+
typ	A
DAP	DL
menachinóny (v %)
8/4	-
9/0	ω
9/2	+
9/4	+++
9/6	-
9/8	-
homológia
16SrDNA	>99,5 %
fosfolipidy
PE	+
OH-PE	+
lyzo PE	-
metPE	-
PC	-
NPG	-
PI	+
PIM	v
PG	+
DPG	+
GL	-
typ	II+OH-PE
mastné kyseliny
izo 16	+4-4-
izo 15	+
izo 17	(+)
anteizo 15	+
anteizo 17	(+)
10-me 16	(+)
10-me 17	+
2-0 H 15	+
2-OH 16	+
typ	3f
MS	-

Príklad 4

Čistenie nitrilhydratázy z mikroorganizmov NA40

Kmeň sa kultivoval 3 dni v médiu podľa tabuľky 3 pri 37 °C. Bunky 2 1 kultúry sa získali odstredením a potom sa resuspendovali v 0,85 % roztoku NaCl. Potom sa bunky preniesli do 0,1 M káliumfosfátového tlmivého roztoku (pH 7,0), ktorý obsahoval 44 mM kyseliny n-maslovej a pôso bilo sa ultrazvukom. Bunkový’ extrakt sa odstredil a bunkové zvyšky sa odstránili. Tento extrakt sa použil na čistenie enzýmu. V priebehu celého čistenia sa používal káliumfosfátový tlmivý roztok (pH 7,0), ktorý' obsahoval 44 mM kyseliny n-maslovej. Ako vidieť z tabuľky 10, enzým sa čistil v troch krokoch až k homogenite.

Tabuľka 10

Čistenie nitrilhydratázy zNA40

	Celková aktivita (Units)	Proteín celkom (mg)	Špecifická aktivita (U/mg)	Obohatenie
Bezbunkový extrakt	73300	1020	71,9	1
DEAE-Sephacel	68000	110	620	8,62
Fenyl-TOYOPEARL	64800	61,4	1105	15,4

Unit: množstvo enzýmu, ktoré katalyzuje tvorbu 1 pmol nikotínamidu/min pri 20 °C

Príklad 5

Charakteristika nitrilhydratázy

1. Určenie molekulovej hmotnosti, štruktúry podjednotiek a obsahu iónov kobaltu

Molekulová hmotnosť sa stanovila 106 kDa pomocou chromatografie na TSK-gélovom stĺpci G3000 SW (0,75 x x 60 cm) použitím 0,1 M káliumfosfátového tlmivého roztoku (pH 7,0) s 0,2 M KC1 a 44 mM kyseliny n-maslovej. Zistilo sa, že sa enzým skladá z 2 rôznych podjednotiek α a β, ktorých molekulová hmotnosť sa stanovila ako 30 000 a 26 000.

Obr. 1 ukazuje stanovenie molekulovej hmotnosti pomocou chromatografie na TSK-géli 63000 SW.

Obr. 2 ukazuje stanovenie molekulovej hmotnosti pomocou SDS-PAGE

Obr. 3 ukazuje absorpčné spektrum čisteného enzýmu. Pozorovala sa široká absorpcia 300 - 400 nm.

2. Substrátová špecifita čisteného enzýmu

Stanovenie substrátovej špecifity sa uskutočnilo analogickým spôsobom ako v príklade 2(1). Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 11.

Tabuľka 11

Substrátová špecifita čistenej nitrilhydratázy

Substrát	(M)	Celková aktivita	Relatívna aktivita
(pmol/ml/min.)	Reakcia enzýmu	Reakcia s bunkami v pokoji
3-kyánpyridín	1,0	17,7	100	100
2-kyánpyridín	0,25	39,1	221	128
4-kyánpyridín	0,25	31,6	179	168
krotonitril	0,4	11,9	67	52
benzonitril	0,03	11,3	64	51
akrylonitril	0,4	16,6	94	115
o-chlórbenzonitril	0,15	22,4	127	96
m-chlórbenzonitril	0,15	15,9	90	75
p-chlórbenzonitril	0,15	2,30	13	16
2-chlór-3-kyánpyridín	0,15	16,0	90	126
acetonitril	0,4		-	-
propionitril	0,4	39,3	222	105
metakrylnitril	0,4	22,1	125	130
n-butyronitril	0,4	17,9	101	194

1,7 jednotiek (U) enzýmu sa pridalo k reakčnej zmesi (2,0 ml). Reakčná zmes obsahovala určitý substrát v 45 mM fosfátovom tlmivom roztoku (pH 7,0).

(3) Určovanie hodnoty K_M

Hodnota K_M sa podľa diagramu Lineweaver-Burk určila pre 3-kyanopyridín 41,7 mM a pre akrylonitril 3,7 mM. Porovnaním s Rhodococcus rhodochrous J!, ktorý má hodnotu K_M pri 3-kyanopyridíne 200 mM, je táto hodnota pri NA40 podstatne menšia. To je jedna z hlavných výhod NA40.

4. Teplotná stabilita a teplotné optimum

Čistený enzým sa 30 min. inkuboval pri pH 7,0 pri rôznych teplotách a potom sa merala premena 3-kyanopyridínu na nikotínamid 1 min. pri 20 °C. Enzým sa inaktivoval pri teplote vyššej ako 40 °C. Teplotná stabilita bola ako pri bunkách v pokoji pri cca 40 °C, teplotné optimum bolo medzi 35 a 40 °C (obr. 5).

5. pH optimum a pH stabilita

Na tento účel sa reakcia 3-kyánpyridínu za vzniku nikotínamidu uskutočňovala pri 20 °C v reakčnej zmesi (2,0 ml), ktorá obsahovala rôzne tlmivé roztoky (42,5 mM),

1,71 Units čisteného enzýmu a 500 mM 3-kyáanpyridínu. pH optimum bolo cca pri pH 6,5 + 1,0 (obr. 8).

Na stanovenie pH stability sa inkubovalo 4,2 Units čisteného enzýmu v rôznych tlmivých roztokoch (45 mM) pri 20 °C 1 hodinu. Časť inkubovaného roztoku 1,71 Units sa pridala k štandardnej reakčnej zmesi (porovnaj príklad

2(1)). Stanovila sa zvyšná aktivita. Enzým bol stabilný v rozsahu pH 5 - 9. Výsledok je znázornený na obr. 9.

6. Inhibítory

Zisťoval sa účinok rôznych inhibítorov. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 12.

Tabuľka 12

Vplyv rôznych inhibítorov na čistený enzým

Inhibítor	mM	Relatívna aktivita (%)
		100
N-etylmaleíinimid	1	97
kyselina jódoctová	1	39
kyselina 4-chlórmeďnatobenzoová	0,1	69
nátriumazid	1	59
hydroxylamín	1	37
fenylhydrazín	1	8
semikarbazín	1	82
tiron (dvojsodná soľ 4,5-dihydroxy-1,3-benzéndisulfónovej kyseliny	1	110
o-fenantrolín	1	89
α-,α'-dipyridyl	1	100
8-hydroxychinolín	1	110
EDTA (kys. etvléndiamíntetraoctová)	1	115
dietyldŕtiokarbamát	1	89

Príklad 6

Vplyv metanolu na bunky v pokoji NA40

Reakcia sa uskutočnila 10 min. v prítomnosti 0 - 20 % (objem/objem) metanolu podľa tabuľky 13. Ako ukazuje tabuľka 14, aktivita sa zvyšuje pridaním 5 - 15 % metanolu.

Tabuľka 13

Reakcia s bunkami v pokoji * KPB = káliumfosfátový tlmivý roztok

	Metódy
	(D	_	(3)	(4)	_
1,0 M 3-kyánpyridín	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml
0,1 M KPB* (pH 7,0)	0,9 ml	0,8 ml	0,7 ml	0,6 ml	0,5 ml
metanol	-	0,1 ml	0,2 ml	0,3 ml	0,4 ml
bunková suspenzia	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml
celkový objem	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml

Tabuľka 14

Vplyv metanolu na Amycolatopsis NA40

Metódy	metanol [(% (obj./obj.)]	Relatívna aktivita [%]
(1)	0	100
(2)	5	123
(3)	10	128
(4)	15	130
(5)	20	105

Príklad 7

Obohatenie mikroorganizmov rodu Rhodococcus

Rôzne vzorky pôdy sa v obohacovacom médiu podľa tabuľky 1 naočkovali kyselinou kyánoctovou ako zdrojom uhlíka a dusíka a podľa príkladu 1 sa izolovali mikroorganizmami Rhodococcus GF270, GF578, GF473 a GF376.

Príklad 8

Biotransformácia s mikroorganiznami rodu Rhodococcus (1) Teplotná stabilita mikroorganizmov Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF270 a Rhodococcus GF376 v porovnaní s Rhodococcus rhodochrous J!

Na určenie teplotnej stability sa uvedené mikroorganizmy kultivovali v nasledujúcich médiách.

Rhodococcus rhodochrous Jl sa kultivoval 72 hod. v médiu opísanom v EP-A-0 307 926. Mikroorganizmy Rhodococcus GF674, GF578, GF270 a GF376 sa kultivovali v nasledujúcich médiách pri pH 7,0 až 96 hod.

Rhodococcus GF674 v médiu obsahujúcom extrakt kvasníc 1,0 g/1, fruktózu 5,0 g/1, extrakt sladu 10,0 g/1, acctamid 5,0 g/í, KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a CoCl₂.6H₂O 10,0 mg.

Rhodococcus GF578 v médiu obsahujúcom extrakt kvasníc 1,0 g/1, fruktózu 15,0 g/1, extrakt sladu 10,0 g/1, a cetamid 25,0 g/1, KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a CoC1₂.6H₂O 5,0 mg.

Rhodococcus GF270 v médiu obsahujúcom extrakt kvasníc 12,5 g/1, nátriumcitrát 5,0 g/1, metakrylamid 7,5 g/1, KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a CoCl₂.6H₂O 30,0 mg.

Rhodococcus GF376 v médiu obsahujúcom extrakt kvasníc 1,0 g/1, nátriumcitrát 10,0 g/1, extrakt sladu 15,0 g/1, butyramid 7,5 g/1, KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a CoC1₂.6H₂O 15,0 mg.

Potom sa bunky nechali v pokoji 15 min. pri rôznych teplotách a potom sa určila zostatková aktivita za štandardných reakčných podmienok podľa príkladu 2(1).

Pritom sa zistilo, že Rhodococcus GF674 má pri teplote 50 °C relatívnu aktivitu takmer 100 % a pri 60 °C má ešte aktivitu cca 10 %. Rhodococcus GF578 mal taktiež 100 % relatívnu aktivitu pri 50 °C a relatívnu aktivitu 20 pri 60 °C. Rhodococcus GF376 mal 100 % relatívnu aktivitu až pri 50 °C, pri 60 °C mal relatívnu aktivitu 70 % a pri 70 °C takmer 5 % relatívnu aktivitu. Rhodococcus GF270 mal až do 60 °C relatívnu aktivitu 100 % a rovnako pri 70 °C ešte 5 % relatívnu aktivitu. V porovnaní s tým mal Rhodococcus rhodochrous Jl až pri 50 °C relatívnu aktivitu 100 %, pri 60 °C 80 % a pri 70 °C už nemal žiadnu aktivitu.

Je možné zhrnúť, že Rhodococcus GF270 a GF376 majú lepšiu teplotnú stabilitu ako Jl a GF270 má najlepšiu teplotnú stabilitu.

pH optimum kmeňov Rhodococcus

Vplyv hodnoty pH na aktivitu nitrilhydratázy kmeňov Rhodococcus GF674, GF578, GF270, GF376 sa skúmal podľa príkladu 2(5).

pH optimum Rhodococcus GF674 je pri pH 7,5 - 9,5, GF578 pri pH 8 - 8,5, GF270 pri pH 6 - 7,0 a GF376 pri pH 6-8.

3. Substrátová špccifita kmeňov Rhodococcus

Substrátová špecifita sa súhrnne uvádza v tabuľke 15 ako relatívna aktivita.

4. Akumulácia nikotínamidu kmeňov Rhodococcus

Ako v príklade 2(6) sa kmene Rhodococcus GF674, GF578, GF270 a GF376 kultivovali s 3-kyánpyridínom (cca 500 mM). Rhodococcus GF674 vytvoril pritom v priebehu 25 hod. 6 M nikotínamidu, Rhodococcus GF578 v priebehu 10 hod. 5,5 M nikotínamidu, Rhodococcus GF270 v priebehu 20 hod. cca 8,5 M nikotínamidu a Rhodococcus GF376 v priebehu 20 hod. 7,5 M nikotínamidu.

5. Tolerancia 3-kyánpyridínu na aktivitu kmeňov Rhodococcus

Na testovanie tolerancie 3-kyánpyridínu sa bunky v pokoji 15 min. inkubovali pri 20 °C pri koncentrácii 3-kyánpyridínu medzi 1 a 10 % (hmotn./obj.) a potom sa bunky odstredili. Po premytí buniek 0,85 % NaCl sa merala zvyšná aktivita.

Tolerancia 3-kyánpyridínu ako substrátu sa testovala pri rôznych koncentráciách substrátu. Zistilo sa, že pri koncentrácii substrátu 2 (hmotn./obj.) aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus rhodochrous Jl sa znížila o faktor 1,4, aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF674 pri koncentrácii substrátu 4 % (hmotn./obj.) sa znížila o faktor 1,4, aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF578 až po koncentráciu substrátu 8 % zostala takmer konštantná, aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF270 pri koncentrácii substrátu 4 % (hmotn./obj.) sa znížila o faktor 1,17 a aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF376 pri koncentrácii substrátu 10 % (hmotn./obj.) sa znížila o faktor 1,25.

V porovnaní s inými kmeňmi Rhodococcus mal Rhodococcus rhodochrous Jl najhoršiu toleranciu oproti 3-kyánpyridínu.

	Rhodococcus rhodochrous Jl	Rhodococcus GF674	Rhodococcus GF578	Rhodococcus GF270	Rhodococcus GF376
3-Kyánpyridín	100 (%)	100 (%)	100 (%)	100 (%)	100 (%)
2-Kyánpyridín	45	308	200	15,7	54,3
4-Kyánpyridín	70	231	167	55,6	79,8
Benzonitril	27	138	85,1	13,4	57,2
2-Chlórbenzonitril	2,8	64,8	49,0	0	0
3-Chlórbenzonitril	43	27,8	28,9	8,41	8,63
4-Chlórbenzonitril	13	0	0	0	0
Acetonitril	608	1,49	347	659	806
Propionitnl	434	274	132	37,3	245
n-Butyronitril	352	491	368	181	195
Akrylnitril	478	147	101	192	257
Krotonitril	78,2	98,0	124	37,1	110
Metakrylnitril	86,9	176	122	0	0

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Mikroorganizmy rodu Amycolatopsis alebo Actinomadura, majúce schopnosť premieňať nitril na amid, rovnako ako enzýmové extrakty z nich.

2. Mikroorganizmy podľa nároku 1 druhu Amycolatopsis NA40 a Amycolatopsis NE31, ako sú uložené pod depozitným číslom DSM 11617 a DSM 11616, rovnako ako ich funkčne ekvivalentné varianty a mutanty.

3. Mikroorganizmy druhu Rhodococcus GF270 a GF376, ako sú uložené pod depozitným číslom DSM 12211 a DSM 12175, rovnako ako ich funkčne ekvivalentné varianty a mutanty, majúce schopnosť premieňať nitril na amid, rovnako ako enzýmové extrakty z nich.

4. Enzým s aktivitou nitrilhydratázy, získateľný z mikroorganizmov podľa nároku 1 a 2.

5. Enzým podľa nároku 4, ktorý má

a) pH optimum pri pH 6,5 ± 1,0,

b) tepelné optimum medzi 35 a 40 °C pri pH 7,0,

c) hodnotu K_M pre substrát 3-kyánpyridín 41,7 ±7,7 mM.

6. Spôsob výroby amidov, vyznačujúci sa t ý m , že sa nitril ako substrát premení na zodpovedajúci amid pomocou mikroorganizmov podľa jedného z nárokov 1 až 3 enzýmového extraktu z týchto mikroorganizmov alebo pomocou enzýmu podľa nároku 4.

7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že sa ako nitril použije prípadne substituovaný alifatický nitril s 1 až 10 atómami uhlíka.

8. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že sa ako nitril použije prípadne substituovaný aromatický nitril so 4 až 10 atómami uhlíka v aromatickom kruhu.

9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa t ý m , že sa aromatický nitril zvolí zo zlúčenín všeobecných vzorcov (I) alebo (II) cn i

II

CN kde R¹ a R² znamená atóm vodíka, atóm halogénu alebo C_M-alkyl.

10. Spôsob podľa jedného z nárokov 6 až 9, v y značujúci sa tým, že sa reakcia uskutočňuje pri teplote od 0 do 50 °C a pri pH 4,5 až 10.

11. Spôsob podľa jedného z nárokov 6 až 10, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia uskutočňuje pomocou miroorganizmov rodu Amycolatopsis s označením NA40 (DSMZ 11617) alebo NE31 (DSMZ 11616) alebo s ich funkčne ekvivalentnými variantmi alebo mutantmi.