CZ299166B6

CZ299166B6 - Mikroorganismy rodu Amycolatopsis nebo Actinomadura, enzymy z nich získané a zpusob výroby amidu

Info

Publication number: CZ299166B6
Application number: CZ20000153A
Authority: CZ
Inventors: Tracey Robins@Karen; Nagasawa@Toru
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1997-07-22
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2008-05-07
Also published as: KR20010022073A; US20080050798A1; US7666635B2; AU8978398A; CA2294621A1; DK1002122T3; PL338249A1; US6444451B1; JP4302876B2; CN1265154A; HU226274B1; EA200000135A1; CZ2000153A3; KR100517776B1; PL194729B1; US7741097B2; US20070031949A1; JP2001511355A; US20080057550A1; UA83654C2

Abstract

Mikroorganismy rodu Amycolatopsis nebo Actinomadura, zvlášte druhu Amycolatopsis NA40 a Amycolatopsis NE31, (DSM 11617 a DMS 11616) a druhu Rhodococcus GF270 a GF376, (DSM 12211 a DSM 12175) stejne jako jejich funkcne ekvivalentní varianty a mutanty, a enzymové extrakty z nich mající schopnost premenovat nitril na amid. Enzym s aktivitou nitrilhydratázy, vhodný pro výrobu amidu z nitrilu, získatelný z techto mikroorganismu, a) pH optimum pri pH6,5 .+-. 1,0; b) teplotní optimum mezi 25 a 40 .degree.C pri pH 7,0; c) hodnotu K.sub.M.n. pro substrát 3-kyanpyridin 41,7 .+-. 7,7 mM.

Description

Vynález se týká nových mikroorganismů rodu Actinomadura, Amycolatopsis a Rhodococcus. Dále se vynález týká způsobu výroby amidů za použití těchto mikroorganismů, popř. za použití enzymových extraktů těchto mikroorganismů.

Dosavadní stav techniky

Pro amidy jako je například nikotinamid, který je pro člověka a zvířata esenciálním vitaminem vitaminů B-komplexu, je známo více biotechnologických způsobů. Obecně se ví, že mikroorganismy obsahující nitrilhydratázu přeměňují nitrily na odpovídající amidy. EP-AO 188 316 popisuje způsob výroby nikotinamidu z 3-kyanpyridinu za použití mikroorganismů rodu, Rhodococcus, Arthrobacter nebo Mikrobacterium.

Nevýhodou při tomto způsobuje to, že mají mikroorganismy pro přeměnu 3-kyanpyridinu na nikotinamid jen malou aktivitu. EP-AO 307 926 popisuje přeměnu 3-kyapyridinu na nikotinamid pomocí mikroorganismů druhu Rhodococcus rhodochrous JI. Aby tyto mikroorganismy katalyzovaly potřebnou reakci, musejí se indukovat. Další nevýhodou tohoto způsobuje to, že je Rhodococcus rhodochrous J1 červeně zbarven a tím dochází k zabarvení produktu. Dále má tento mikroorganismus malou teplotní stabilitu a je např. substrátem 3-kyanpyrimidinem inhibován.

Další způsob výroby nikotinamidu z 3-kyanpyridinu pomocí mikroorganismů druhu Rhodococcus rhodochrous JI je popsán v EP-AO 362 829. Pro zvýšení specifické aktivity mikroorganismů obsahujících nitrilhydratázu se ke kultivačnímu médiu přidala močovina, popř. derivát močoviny jako induktor. Stejné jako u předešlého způsobu, také při tomto dochází k zabarvení produktu. Dále popisuje WO 95/17 505 způsob výroby aromatických amidů zodpovídajících nitrilů pomocí mikroorganismů druhu Rhodococcus rhodochrous M33. Nevýhodou tohoto způsobuje červené zbarvení Rhodococcus rhodochrous M33 a vysoká hodnota K_M pro substrát 3-kyan pyridin.

Úkolem předloženého vynálezu tedy bylo odstranit tyto nedostatky a poskytnout způsob výroby amidů, při kterém se mohou izolovat odpovídající amidy v dobrém výtěžku a čistotě.

Podstata vynálezu

Tento úkol se řeší pomocí nových mikroorganismů podle nároku 1 a 3 a způsobem podle nároku 6.

Způsob se podle vynálezu provádí tak, že se nitril jako substrát přemění na odpovídající amid pomocí mikroorganismů rodu Actinomadura, Amycolatopsis nebo Rhodococcus, pomocí enzy45 mového extraktu z těchto mikroorganismů nebo pomocí čištěné nitrilhydratázy mikroorganismů rodu Amycolatopsis nebo Actinomadura.

Nitrily použité pro biotransformaci, jako např. 3-kyapyridin, jsou komerčně dostupné sloučeniny.

Mikroorganismy podle vynálezu máji schopnost přeměnit nitrily jako substráty na odpovídající amidy. Výhodně mají tyto mikroorganismy schopnost růst na nitrilech nebo amidech jako jediném zdroji uhlíku a/nebo dusíku.

Mikroorganismy podle vynálezu se získají vhodnou selekci například ze vzorků půdy, kalu nebo odpadních vod za pomoci obvyklých mikrobiologických technik. Účelně se mikroorganismy

- 1 CZ 299166 B6 podrobí selekci pěstováním s nitrily nebo amidy jako výhodně jediný zdroj uhlíku nebo dusíku v přítomnosti iontů kobaltu. Nitrily a amidy vhodné pro selekci jsou zejména ty nitrily, které se také používají při pozdější biotransformaci jako substráty a z toho vzniklé odpovídající amidy. Vhodná růstová média jsou pro odborníka rovněž známá, například se může použít médium popsané v Tabulce 1.

Obvykle se mikroorganismy také stejným způsobem kultivují před vlastní biotransformaci, přičemž se používají shora uvedená média.

ío Jak je v oboru známo, nitrilhydratáza se tvoří pouze tehdy, jestliže kultivační médium obsahuje ionty kobaltu jako kofaktor. Vhodné sloučeniny kobaltu, které poskytují ionty kobaltu, jsou soli CO²⁺ nebo CO³⁺. Příklady soli CO²⁺ a CO³⁺ chloridy, sulfáty a acetáty kobaltu.

Účelně se jako sloučenina kobaltu použije sůl CO²⁺, jako např. COC1₂. Kultivace se může také provádět v přítomnosti vitaminu B12 spolu s kovovým kobaltem nebo jinými sloučeninami kobaltu, které vytvářejí iont kobaltu in sítu. Účelně se použije sloučenina kobaltu v množství od 1 do 10 mg/1, výhodně od 1 do 3 mg/1.

Obvykle se kultivace provádí při teplotě od 20 do 50 °C a při hodnotě pH mezi 5 a 8, výhodně od 30 do 45 °C a mezi pH 5,5 a 7,5.

Vlastní biotransformace se může uskutečnit pomocí mikroorganismů rodu Actinomadura, Amycolatopsis, pomocí enzymového extraktu z těchto mikroorganismů nebo pomocí čištěné nitrilhydratázy z těchto mikroorganismů. Účelně se biotransformace provádí s mikroorganismy druhu Actinomadura spadix, například s izoláty Actinomadura spadix E3733, Actinomadura spadix E3736, Actinomadura spadix 45A32, Actinomadura spadix 4501 nebo Actinomadura spadix Cl5. Výhodně se biotransformace uskutečňuje s mikroorganismy druhu Amycolatopsis NE 31 a Amycolatopsis NA40 nebo jejich funkčně ekvivalentními variantami nebo mutanty. Obzvláště výhodně se používají mikroorganismy druhu Amycolatopsis NA40. Mikroorganismy uvedených druhů byly uloženy podle Budapešťské úmluvy 03.06.1997 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH, Mascheroderweg lb, D-38124 Braunschweig pod označením Amy-colatopsis NE 31 a Amycolatopsis NA40 a dostaly číslo uložení DSM 11616, popř. DSM 11617. Oba tyto mikroorganismy byly přesněji identifikovány a jsou zařaditelné jako druhy rodu Amycolatopsis, které nejsou v literatuře ještě popsány.

Vynález se tedy také týká mikroorganismů rodu Amycolatopsis nebo Actinomadura, které jsou schopné přeměnit nitril na amid, zejména mikroorganismy s označením Amycolatopsis NA40 (DSM 11617) a Amycolatopsis NE31 (DSM 11616).

Dále bylo zjištěno, že speciální mikroorganismy rodu Rhodococcus mají lepší vlastnosti pro přeměnu nitrilů na amidy než mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous JI popsaný v EP-AO 362 829. Tyto mikroorganismy jsou Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF270 (DSM 12211) a Rhodococcus GF376 (DSM 12175) nebo jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty. Mikroorganismus DSM 12175 byl uložen 15.5.1998 a mikroorganismus DSM 12211 dne 8.6.1998 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH podle Budapešťské smlouvy. Kmeny Rhodococcus GF270, GF376, GF473, GF578 a GF674 byly přiřazeny rodu Rhodococcus na základě identifikace v literatuře dosud nepopsaných druhů. Vynález se tedy také týká mikroorganismů Rhodococcus GF270, Rhodococcus GF376, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF578 a Rhodococcus GF674.

Oproti mikroorganismům rodu Actinomadura, popř. Amycolatopsis se mikroorganismy rodu Rhodococcus účelně před vlastní reakcí indukují. Jako induktory jsou vhodné induktory popsané v EP-AO 307 926, jako například acetamid, amid kyseliny máselné, methakrylamid, amid kyseliny propionové, krotonamid a amid kyseliny valerové.

-2CZ 299166 B6

Pod pojmem funkčně ekvivalentní varianty a mutanty se rozumějí mikroorganismy, které se odvozují od shora uvedených původních organismů a mají v podstatě stejné vlastnosti a funkce. Takové varianty a mutanty mohou vzniknout náhodně, např. UV ozářením nebo vlivem mutagenních chemikálii.

Identifikace Amycolatopsis NA40

barva vzduch-mycela	bila
barva substrát-mycela	oranžová
barva difund. pigment	—
cukerné spektrum
ARA	+
GAL	+
MAD	-
XYL	-
GLU	tr
RIB	-Ι-
typ	Α
DAP	DL
menachinony (v %)
8/4	-
9/0	( + )
9/2	+
9/4	+++
9/6	-
9/8	—
homologie 16S rDNA	96,9 %
fosfolipidy jako	nezjišťovány
PE,OH-PE,lyso PE,met	PE,
PC,NPG,PI,PIM,PG,DPG	,GL
mastné kyseliny
iso 16
iso 15	+
iso 17	(+)
anteiso 15	(+)
anteiso 17	(+)
10-me 16	-
10-me 17	+
2-OH 15	+
2-OH 16	+
typ	3f

MS

-3CZ 299166 B6

Identifikace Amycolatopsis NE31

barva vzduch-mycela barva substrát-mycela barva difund. pigment	bílá oranžová
cukerné spektrum ARA GAL MAD XYL GLU RIB	+ + tr +
typ DAP	A DL
menachinony (v %) 8/4 9/0 9/2 9/4 9/6 9/8	( + ) + +++
homologie 16S rDNA	96,1 %
fosfolipidy jako	nezjišťovány

PE,OH-PE,lyso PE,met PE, PC,NPG,PI,PIM,PG,DPG,GL

mastné kyseliny iso 16 iso 15 iso 17 anteiso 15 anteiso 17 10-me 16 10-me 17 2-OH 15 2—OH 16	+++ + (+) (+) (+) + +
typ	3f
MS	—

-4CZ 299166 B6

Zkratky a vysvětlení pro identifikaci

(+)	1 až 5 %
+	5 až 15 %
++	15 až 30%
_\|—	>30 %
DAP	kyselina diaminopimelová
ARA	arabinosa
GAL	galaktosa
MAD	madurosa
XYL	xylosa
GLU	glukosa
RIB	ribosa
cukerné typy podle	Lechevalier a spol. 1971
mastně kyselinové	typy podle Kroppenstedt 1985 a 1992
9/4	MK-9 (H₄)
9/6	MK-9 (H₆)
9/8	MK-9 (H₈)
MS	kyselina mykolová
PE	fosfatidylethanolamin
OH-PE	hydroxy-PE
met PE	fosfatidimethylethanolamin
PC	fosfatidylcholin
NPG	fosfatidylglukosamin
PI	fosfatidylinositol
PIM	fosfatidylinositolmannosid
PG	fosfatidylglycerol
DPG	difosfatidylglycerol
GL	glykolipidy
mastné kyseliny
iso-16	kyseliny iso-hexadekanové nebo 14methy1-pentadekanově
10-me-18	kyselina tuberkulostearová
2-OH-16	kyselina 2-hydroxypalmitová

-5CZ 299166 B6

Identifikace GF270, GF376, GF473, GF578 a GF674 Identifikace těchto kmenů spočívá na 5 na sobě nezávislých vlastnostech

1. Morfologie a barva kolonií: krátké rozvětvené hyfy, které dezintegrují do částic podobných tyčinkám a sporům. Kolonie GF270 a GF376 jsou lososově růžové barvy (RAL 3022) a GF578 a GF674 světle červené (RAL 3012).

ío 2. Diaminokyseliny peptidoglykanu: kys. meso-diaminopimelová

3. Kyseliny mykolové: mykolové kyseliny mikroorganismu Rhodococcus: Stanovení mykolových kyselin s dlouhým řetězcem se uskutečnila pomocí vysokoteplotní plynové chromatografie. Eluční profily mykolových kyselin od GF270 a GF376, stejně jako GF473,

GF578 a GF674 byly identické. Délka mykolových kyselin pro GF270 a GF376 byla

C₃₈ až C₄₆ a pro GF473, GF578 a GF674 byla C₄₀ až C₄₈. Vzorky mykolových kyselin byly srovnány se vzorky mykolových kyselin kmenu Rhodococcus. GF270 byl identifikován jako patřící k Rhodococcus rhodochrous s velmi nízkým korelačním faktorem (0,086). GF376 nemohl být touto metodou identifikován. Ostatní tři izoláty GF473, GF578 a GF674 byly identifikovány jako náležející k Rhodococcus ruber s velmi malým koleračním faktorem.

4. Vzorek mastných kyselin: nerozvětvené nasycené a nenasycené mastné kyseliny včetně kyseliny tuberkulostearové. Vzorek mastných kyselin je diagnostický pro všechny rody Rhodococcus a blízké příbuzné Mycobacterium, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella a některé druhy Corynebakterií. Identifikace na úrovni druhu se získala kvalitativními a kvantitativními rozdíly ve vzorku mastných kyselin z GF270, GF376, GF473, GF578 a GF674 a vzorku mastných kyselin z druhů Rhodococcus.

5. Částečné sekvence 16S r DNA GF270 a GF376 byly identické (100%), přestože jejich srovnání se kmeny Rhodococcus mělo jen 99,1 %ní podobnost k nejblíže příbuznému

Rhodococcus rhodochrous. GF473 a GF578 byly identické ve své sekvenci 16S r DNA (100 %). GF674 je rozdílný od GF578 pouze vjednom páru bází z 500 (99,8 %). Všechny tři izoláty ukázaly jen vzdálenou příbuznost k Rhodococcus coprophilus (98,4 %).

Na základě chemotaxických a molekuláměbiologických výsledků lze vyvodit, že GF270,

GF376 na jedné straně a GF473, GF578, GF674 na druhé straně jsou kmeny 2 nových druhů

Rhodococcus. GF270 a GF376 jsou blízce příbuzní k Rhodococcus rhodochrous ve své 16S rDNA (99,1%), naproti tomu jsou GF473, GF578, GF674 jen vzdáleně příbuzní k Rhodococcus coprophilus (98,4 %).

Enzymový extrakt lze získat pomocí v oboru běžně používaného otevření mikroorganismů, jako například otevřením pomocí ultrazvuku, pomocí Frenchovy tlakové metody nebo lysozymové metody. Tento enzymový extrakt jako i samozřejmé celé buňky mikroorganismu mohou být pro provedení způsobu imobilizovány na vhodném nosiči, obvykle uloženém na polymeru, nebo mohou být absorbovány na vhodném nosiči.

Enzymy s nitrilhydratázovou aktivitou podle vynálezu je možné získat z mikroorganismů rodu Amycolatopsis a jsou schopné přeměňovat nitril na amid. Zejména je lze získat z Amycolatopsis NA40 (DSM 11617). Tyto enzymy vykazuji zejména následující vlastnosti:

a) pH-optimum pH 6,5 ± 1,0

b) teplotní optimum mezi 35 a 40 °C při pH 7,0

c) hodnotu K_M pro substrát 3-kyanpyridin 41,7 ± 7,7 mM (20 °C, 45 mM fosfátového pufru, pH 7,0) zejména mají enzymy

d) molekulovou hmotnost 106 kDa, jak například stanoveno pomoci SDS-PAGE.

-6CZ 299166 B6

Jako substráty pro biotransformaci lze použít obecně nitrily. Účelné se používají buď alifatické nitrily s 1 až 10 atomy uhlíku, popř. substituované například skupinami hydroxy, amino, halogen nebo karboxy, nebo substituované nebo nesubstituované aromatické nitrily se 4 až 10 atomy uhlíku v aromatickém kruhu. Jako alifatické nitrily s 1 až 10 atomy uhlíku se mohou použít dinitrily, hydroxynitrily, aminonitrily jako např. oktannitril, kyselina kyanoctová, isokapronitril, n-valeronitril, adiponitril, glutaronitril, sukcinontril, sebakonitril, propionitril, krotonitril, akrylnitril, methakrylnitril, nitril kyseliny n-máselné nebo acelanitril. Jako aromatické nitrily se 4 až 10 atomy uhlíku se mohou použit nitrily obecného vzorce I nebo II

ío ve kterém R¹ a R² znamená atom vodíku, atom halogenu nebo C,^- alkyl. Jako atom halogenu se může použít F, Cl, Br nebo J. Jako C, ₄-alkyl se může použít methyl, ethyl, propyl, isopropyl, ter. propyl, butyl, isobutyl nebo terč. butyl. Účelnými zástupci aromatických nitrilů obecných vzorců I nebo II jsou 2-, 3- nebo 4-kyanpyridin, benzonitril, fluor-, chlor-, brombenzonitril, jako např. o-, m-, p-chlorbenzonitril nebo 2-chlor-3-kyanpyridin. Výhodně se jako aromatický nitril se 4 až 10 atomy uhlíku používá 3-kyanpyridin.

Účelně se biotransformace provádí při jednorázovém nebo kontinuálním přidávání substrátu tak, aby koncentrace substrátu nepřesáhla 40 % hmotn., výhodně 30 % hmotn.

Účelné se způsob provádí s buňkami v klidu (které nerostou).

Jako média pro biotransformaci jsou vhodná obvykle používaná v oboru, jako například nízkomolámí fosfátový pufr, HEPES-pufr, citrátový pufr, borátový pufr, média uvedená v tabulce 1 až 3, popř. jejich odvozená forma, jako např. média popsaná v příkladu 8 (1) nebo TR1S/HC1 pufr.

Účelně se biotransformace provádí při teplotě od 0 do 50 °C a při hodnotě pH mezi pH 4,5 a pH 10, výhodně při teplotě od 20 do 40 °C a při hodnotě pH mezi pH 4,5 a pH 10,0.

V obzvláště výhodném provedení se může biotransformace uskutečnit v přítomnosti C| _{a4 4}30 alkoholu. Jako Ci ₄-alkoholy se mohou použít methanol, ethanol, propanol nebo butanol. Výhodně se používá methanol.

Po reakci se pak mohou odpovídající amidy isolovat obvyklými metodami zpracování, jako například krystal izaci.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kultivace mikroorganismů rodu Actinomadura a Amycolatopsis

a) Různé vzorky půdy byly v obohacovacím médiu podle tabulky 1 naočkovány různými nitrily nebo amidy jako zdroje uhlíku a dusíku a nechaly se 7 až 10 dnů při 37 nebo 45 °C.

Pak se kultury přeočkovaly ve stejném médiu a ještě jednou kultivovaly 7 až 10 dnů při

-7CZ 299166 B6 °C. To celé se třikrát opakovalo. Pak se kultury zředily a rozprostřely, aby se získaly jednotlivé kolonie. Desky se nechaly 5 dnů při 37 °C. Pak se rozdílné kolonie testovaly na požadovanou aktivitu.

Takto se izolovaly Amycolatopsis NA40 (DSM 11617) a Amycolatopsis NE31 (DSM

11616) a pak se pěstovaly v optimalizovaném médiu (tabulka 3) 90-100 hod. za třepání při 37 °C.

Pro Amycolatopsis NE31 (DSM 11616), Actinomadura spadix E3733 a Actinomadura spadix E3736 sloužil adiponitril jako zdroj uhlíku a dusíku, pro Amycolatopsis NA40 (DSM ío 11617), Actinomadura spadix 45A32 sloužil acelanitril jako zdroj uhlíku a dusíku, pro

Actinomadura spadix 4501 sloužil n-oktanitril jako zdroj uhlíku a dusíku a pro

Actinomadura spadix Cl5 sloužil kyanoctan jako zdroj uhlíku a dusíku.

b) Amycolatopsis NA40 se pěstoval v médiu podle tabulky 3. Kultivovalo se v subkulturách 15 (4 ml/trubičku) a v hlavní kultuře (500 ml/baňku) za aerobních podmínek při teplotě 37 °C popř. 3 až 4 dny. Buněčný růst se měřil turbimetricky při 610 nm a suchá váha buněk se spočítala následovně: hmotnost suchých buněk v mg/ml=OD₆i₀nm x 0,277.

Tabulka 1

Obohacovací médium
nitril	2,0	g
KH₂PO₄	7,0	g
MgSO₄.7H₂O	0,1	g
směs vitaminů	1,0	ml
CoCl₂.6H₂O	2,0	mg
FeSO₄.7H₂O	2,0	mg

doplnit vodou na 1 1 (pH 6,7 až 7,3)

Tabulka 2

Základní médium maltosa NaNO₃k₂hpo₄MgSO₄.7H₂O

2,0 g 1,0 g 0,1 g 0,05 g doplnit vodou na 100 ml (pH 7,0)

-8CZ 299166 B6

Tabulka 3

Z

Optimalizované medium

D-glukosa	4,5 g
masový extrakt	0,5 g
k₂hpo₄	0,1 g
MgS0₄.7H₂O	0,05 g
CoC1₂.6H₂O	1,0 mg

doplnit vodou na 100 ml (pH 7,0)

Příklad 2

Biotransformace pomocí mikroorganismů rodu Actinomadura a Amycolatopsis (1) Pro stanovení aktivity nitrilhydratázy se inkubovala reakční směs (2 ml) 3-kyanpyridin (1,0 M, 1,0 ml), kaliumfosfátový pufr (pH7,0, 0,1 M, 0,5 ml) a 0,5 ml buněčné suspenze za míchání při 20 °C po dobu 30 min. Reakce se ukončila přidáním 0,2 ml 3 N HC1. Po krátkém odstředění se vytvořený nikotinamid stanovil pomocí HPLC (systém Schimadzu

SPD 6A se sloupcem Cl 8 (Develosil ODS-HG-5,4,6x250 cm); průtokový prostředek:

mM KH2PO4/H3PO4 (pH 2,8)/acetonitril 9:1 (objem/objem); průtoková rychlost: 1 ml/min; absorpce se měřila při 230 nm). Specifická aktivita se vyjádřila jako pmol vytvořeného nikotinamidu/ml/min/OD₆1 _Onm.

Poměry přeměny alifatických nitrilů v obohacovacím médiu (tabulka 1) s izolovanými bakteriemi je shrnuto v tabulce 5, vliv induktorů a kofaktorů v základním médiu (tabulce 2) je shrnut v tabulce 4 a srovnání aktivity Amycolatopsis ku Rhodococcus v základním médiu (tabulka 2) je shrnuto v tabulce 6. Výsledky z tabulky 4 ukazuji, že nitrilhydratáza z Amycolatopsis NA40 je konstitutivně exprimována, ale pro aktivitu je nutný kofaktor kobalt.

(2) Vliv teploty na růst NA40

Subkultury (2 ml) byly inkubovány v médiu podle tabulky 3 po dobu 2 dny při 37 °C, ty se pak přeočkovaly do baněk třepačky s 20 ml média podle tabulky 3. Kultivovalo se při 37,

40, 45, 50 a 55 °C po dobu 3 až 4 dnů za třepání. Měřil se buněčný růst a aktivita nitrilhydratázy se zjišťovala při 20 °C. Tabulka 7 ukazuje vliv teploty na aktivitu nitrilhydratázy a na buněčný růst.

-9CZ 299166 B6

Tabulka 4

Vliv induktorů a kofaktorů na specifickou aktivitu v základním médiu

Induktor	Růst (OD610 nm)	Celková aktivita (pmol/ml/min)	Specifická aktivita (pmol/ml/min/OD)
—	1,26	20,9	16,6
£-kaprolaktam	0,66	9,52	14,5
krotonamid	3,41	22,9	6,72
methakrylamid	3,33	2,46	0,74
butyramid	2,19	0,19	0,88
propionamid	1,91	0,92	0,48
močovina	1,72	2,97	1,73

Kofaktor	RŮSt (OD610 nm)	Celková aktivita (μπιοί /ml /min)	Specifická aktivita (pmol/ml/min/OD)
-	7,97	0,10	0,01
FeSO₄.7H₂O	8,32	3,36	0,40
CoC1₂.6H₂0	8,41	47,8	5,68

- 10CZ 299166 B6

Tabulka 5

Reakční poměry alifatických nitrilů s izolovanými bakteriemi

Kmeny	Substráty (01	Růst 3610 nm)	Celková aktivita (gmol/ml/min)	Specifická aktivita (gmol/ml/ min/OD)
Amycolatopsis NE31 (DSMZ11616)	adiponitril	2,68	0,377	0,141
Actinomadura spadix E3733	adiponitril	1,62	0,347	0,214
E3736	adiponitril	1,36	3,00	2,21
45A32	acelanitril	5,81	18,8	3,23
4501	n-oktannitril	7,24	32,2	4,45
C15	kys. kyan- octová	2,04	7,01	3,43
Amycolatopsis ŇA40 (DSM 11617)	acelanitril	5,92	33,0	5,57

Tabulka 6

Aktivita Amycolatopsis ve srovnání s Rhodococcus rhodochrous J1

	mikroorganismus Amycolatopsis NA40 (DSM 11617) (gmol/ml/min)	mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous JI
aktivita pro 3-kyanpyridin	303	314
	vyčištěný enzym z NA40 (gmol/min/mg proteinu)	vyčištěný enzym z JI (gmol/min/mg proteinu)
aktivita pro 3-kyanpyridin	1110	371

-11 CZ 299166 B6 (3) Ke stanovení aktivity NA40 vůči více substrátům se buňky o hmotnosti sušiny 0,0388 mg inkubovaly ve shora uvedeném pufru. Reakce byla zahájena přidáním odpovídajícího substrátu a 10 min. se inkubovalo za třepání při 20 °C. Reakce byla ukončena přidáním 0,2 ml 2N HC1 a reakění směs se krátce odstředila. Supematant se analyzoval pomocí HPLC nebo plynové chromatografie. Tabulka 8 ukazuje podmínky testu vzhledem ke substrátové specifitě a tabulka 9 ukazuje substrátovou specifitu buněk NA40 v klidu pro různé substráty.

Jednotlivé podmínky testu jsou shrnuty v tabulce 8 a výsledky jsou v tabulce 9.

Tabulka 7

Vliv teploty při růstu na aktivitu nitrilhydratázy a na růst buněk

Teplota	Růst (mg/ml)	Celková aktivita (pmol/ml/min)	Specifická aktivita (μιηοΐ/ιηΐ/ min/mg)	Relativní aktivita (%)
37 °C	6,16	4,96	0,761	100
40 °C	5,79	9,89	1,71	225
45 °C	6,56	4,83	0,736	97
50 °C	5,96	1,16	0,195	26

Tabulka 8

Podmínky testu vůči substrátové specifitě

Substrát	Substrát (mM)	Metoda analýzy	Vytvořený amid
3-kyanpyridin	1,0	HPLC	nikotinamid
2-kyanpyridin	0,25	HPLC	2-pikolinamid
4-kyanpyridin	0,25	HPLC	pyridin-4-karboxamid
krotonitril	0,4	HPLC	krotonamid
benzonitril	0,03	HPLC	benzamid
akrylonitril	0,4	HPLC	akrylamid
o-chlorbenzonitril	0,15	HPLC	o-chlorbenzamid
m-chlorbenzonitril	0,15	HPLC	m-chlorbenzamid
p-chlorbenzonitril	0,15	HPLC	p-chlorbenzamid
2-chlor-3-kyanpyridin	0,15	HPLC	2-chlornikotinamid
acetonitril	0,4	GC	acetamid
propionitril	0,4	GC	propionamid
methakrylnitril	0,4	GC	methakrylamid
n-butyronítrii	0,4	GC	n-butyramid

o-,m-,p-chlorbenzonitril a 2-chlor-3-kyanpyridin se rozpustil v methanolu a přidal k reakční směsi

-12CZ 299166 B6

Tabulka 9

Substrátová specifita NA40 nitrilhydratázy

Substrát	1 1 Relativní \|\| aktivita \|j (%) 11 I 1	Substrát	Relativní aktivita (%)
3-kyanpyridin	1 1 íoo \| \|	m-chlorbenzonitril	75
4-kyanpyridin	168 \| 1	p-chlorbenzonitrii	16
2-kyanpyridin	128 \| J	2-chlor-3-kyanpyridin	126
benzonitril	51 1 1	acetonitril	-
krotonitril	52 \| \|	propionitril	105
akrylnitril	115 I I	methakrylnitril	130
o-chlorbenznitri]	96 \| \| 1 1	butyronitril	194

(4) Teplotní optimum a teplotní stabilita v buňkách v klidu

Reakce se prováděla 10 min. ve standardní reakční směsi. Teplotní optimum bylo mezi 35 a 40 °C (Obr. 5). Pak se buňky 30 min. inkubovaly při různých teplotách a testovala se aktivita při standardních reakčních podmínkách. Jak je patrno z Obr. 4 je teplotní stabilita ca ío při 40 °C.

(5) pH optimum a pH stabilita v buňkách v klidu

Pro toto se reakce prováděla 10 min. ve standardní reakční směsi, ve které byl kaliumfosfátový pufr vyměněn různými 0,1 M pufry. Jak je patrné z Obr. 6 je pH optimum mezi

4,5 a 10. Potom, co byla buněčná suspenze inkubována 30 min. při různých hodnotách pH při 20 °C, se buňky odstředily. Pak se buňky promyly a resuspendovaly v 0,1 M kaliumfosfátovém pufru pH 7,0. Reakce se prováděla 10 min přidáním 3-kyanpyridinu za standardních podmínek. Enzym byl stabilní mezi pH 4,5 a pH 10,0 (Obr. 7).

(6) Akumulace nikotinamidu z 3-kyanpyridinu pomocí NA40

Reakce se prováděla v reakční směsi (30 ml), která obsahovala 500 mM 3-kyanpyridinu, 40 mM kaliumfosfátového pufru (pH 7,0) a buňky v klidu (hmotnost sušiny 2,3 mg). Během reakce se 7krát přidal 3-kyanpyridin (500 mM), když byl spotřebován. Během 15 hod. se takto přidalo 4,0 M 3-kyan- pyridinu, vytvořilo se 3,89 M (475 g/1) nikotinamidu, což odpovídá výtěžku 97,3 %. Nevytvořila se kyselina nikotinová.

Příklad 3

Identifikace mikroorganismů rodu Amycolatopsis

Následujících 5 chemotaxonomických znaků podpořilo identifikaci:

1. Diagnostická aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-di-aminopimelová

2. Diagnostické cukry: arabinosa a galaktosa

- 13 CZ 299166 B6

3. Kyseliny mykolové: chybí kyseliny mykolové

4. Menachinony: MK-9(I-U)

5. Vzorek mastných kyselin: iso/anteiso-rozvětvené a 2-hydroxy-mastné kyseliny, malá množství 10-methylrozvětvených mastných kyselin byla dodatečně prokázána. Tento vzorek mastných kyselin byl nalezen u všech zástupců rodu Amycolatopsis (vzorek mastných kyselin 3f).

Kombinace těchto chemických znaků je diagnostický pro všechny druhy rodu Amycolatopsis.

ío Údaje pro mastné kyseliny obou kultur se pomocí analýzy hlavních složek srovnávaly s údaji databanky mastných kyselin. Touto metodou byl NE31 a také NA40 přiřazen rodu Amycolatopsis, avšak identifikace druhu nabyla možná, protože byl kolerační faktor příliš nízký. Srovnání vzorku mastných kyselin obou kmenů ale také ukázalo, že se jedná o dva kmeny různých druhů.

Výsledek byl potvrzen výsledky sekvenční analýzy 16S rDNA. Také zde došlo k přiřazení k rodu Amycolatopsis, avšak k žádnému popsanému druhu Amycolatopsis. Při této metodě se sekvence 16S rDNA určovala přímým sekvenováním PCR amplifikovaného genu 16S rDNA. Diagnostická část sekvence 16S rDNA byla srovnávána se sekvencemi typových druhů rodu Amycolatopsis a taxa příbuznými. Výsledek ukázal, že kmen náleží rodu Amycolatopsis. Největší souhlas

96,9 % (NA40) a 96,1 % (NE31) byl nalezen k Amycolatopsis methanolica. Mezi sebou prokazovaly oba izoláty 99,0 %ní souhlas v sekvencích. Naše studie týkající se zástupců rodu Amycolatopsis ukázaly, že pro dobrou identifikaci druhu by musel být kolerační faktor vyšší než 99,5 %. Protože hodnota 96,9 % leží zřetelně pod 99,5 %, je z toho možné vyvozovat, že se u obou izolátu nejedná o zástupce známých druhů Amycolatopsis.

Na základě předložených výsledků, nebylo možné izoláty přiřadit známým druhům Amycolatopsis. Vycházeli jsme z toho, že se u NA40 a NE 31 jedná o kmeny dvou nových dosud nepopsaných druhů rodu Amycolatopsis.

Identifikační charakteristika mikroorganismů rodu Amycolatopsis barva vzduch-mycela barva substrát-mycela barva difund. pigment cukerné spektrum

ARA +

GAL +

MAD

XYL

GLU V

RIB + typ A

DAP DL menachinony (v %)

8/4

9/0 (+)

9/2 +

9/4 +++

-14CZ 299166 B6

9/6

9/8 homologie 16S rDNA >99,5 % fosfolipidy

PE +

OH-PE + lyso PE met PE

PC

NPG

PI +

PIM V

PG +

DPG +

GL typ II+OH-PE mastné kyseliny iso 16 +++ iso 15 + iso 17 (+) anteiso 15 + anteiso 17 (+)

10-me 16 (+)

10-me 17 +

2-0Ή 15 +

2-OH 16 + typ 3f

MS

Příklad 4

Čištění nitrilhydratázy z mikroorganismů NA40

Kmen se kultivoval 3 dny v médiu podle tabulky 3 při 37 °C. Buňky 2 1 kultury se získaly odstředěním a pak se resuspendovaly v 0,85 % roztoku NaCl. Pak se buňky převedly do 0,1 M kaliumfosfátového pufru(pH 7,0), který obsahoval 44 mM kyseliny n-máselné, a působilo se ultrazvukem. Buněčný extrakt se odstředil a buněčné zbytky se odstranily. Tento extrakt se použil pro čištění enzymu. Během celého čištění se používal kaliumfosfátový pufr (PH 7,0), který obsahoval 44 mM kyseliny n-máselné. Jak je vidět z tabulky 10, enzym se čistil ve třech krocích až k homogenitě.

- 15CZ 299166 B6

Tabulka 10

Čištění nitrilhydratázy z NA40

	Celková aktivita (Units)	Protein celkem (mg)	Specifická aktivita (U/mg)	Obohacení
Bezbuněčný
extrakt	73300	1020	71,9	1
DEAE-Sephacel	68000	110	620	8,62
Fenyl-TOYOPEARL	64800	61,4	1105	15,4

1 Unit: množství enzymu, které katalyzuje tvorbu 1 pmol nikotinamidu/min při 20 °C

Příklad 5 ío Charakterizace nitrilhydratázy (1) Určení molekulové hmotnosti, struktury pod jednotek a obsahu iontů kobaltu

Molekulová hmotnost se stanovila 106 kDa pomocí chromatografie na TSK-gelovém sloupci G3000 SW (0,75x60 cm) za použití 0,1 M kaliumfosfátového pufru (pH 7,0) s 0,2 M KC1 a 44 mM kyseliny n-máselné. Zjistilo se, že se enzym skládá ze 2 různých pod jednotek a a β, jejichž molekulová hmotnost byla stanovena jako 30 000 a 26 000.

Obr. 1 ukazuje stanovení molekulové hmotnosti pomocí chromatografie na TSK-gelu G3000 SW.

Obr. 2 ukazuje stanovení molekulové hmotnosti pomocí SDS-PAGE 20 Obr. 3 ukazuje absorpční spektrum čištěného enzymu. Byla pozorována široká absorpce

300-400 nm.

(2) Substrátová specifita čištěného enzymu

Stanovení substrátové specifity se provedlo analogickým způsobem jako v příkladu 2(1). 25 Výsledky jsou shrnuty v tabulce 11.

-16CZ 299166 B6

Tabulka 11

Substrátová specifita čištěné nitrilhydratázy

Substrát	(M) Celk. aktivita	Relativní aktivita (%)
	(gmol/ml/min)	Reakce enzymu	Reakce s buňkami v klidu
3-kyanpyridin	1,0	17,7	100	100
2-kyanpyridin	0,25	39,1	221	128
4-kyanpyridin	0,25	31,6	179	168
krotonitril	0,4	11,9	67	52
benzonitril	0,03	11,3	64	51
akrylonitril	0,4	16,6	94	115
o-chlorbenzonitril	0,15	22,4	127	96
m-chlorbenzonitril	0,15	15,9	90	75
p-chlorbenzonitril	0,15	2,30	13	16
2-chlor-3-kyan-
-pyridin	0,15	16,0	90	126
acetonitrii	0,4	-	-	-
propionitril	0,4	39,3	222	105
methakrylnitril	0,4	22,1	125	130
n-butyronitril	0,4	17,9	101	194

1,7 jednotek (U) enzymu se přidalo k reakční směsi (2,0 ml). Reakční směs obsahovala určitý substrát v 45 mM fosfátovém pufru (pH 7,0).

(3) Určování hodnoty K_M

Hodnota K_M se podle diagramu Lineweaver-Burk určila pro 3-kyanopyridin 41,7 mM a pro ío akrylonitril 3,7 mM. Srovnáním s Rhodococcus rhodochrous JI, který má hodnotu _M u 3-kyanpyridinu 200 mM, je tato hodnota u NA40 podstatně menší. To je jedna z hlavních výhod NA40.

(4) Teplotní stabilita a teplotní optimum

Čištěný enzym se 30 min. inkuboval při pH 7,0 při různých teplotách a pak se měřila přeměna 3-kyanpyridinu na nikotinamid 1 min při 20 °C. Enzym byl inaktivován při teplotě větší než 40 °C. Teplotní stabilita byla jako u buněk v klidu při ca. 40 °C, teplotní optimum bylo mezi 35 a 40 °C (Obr. 5).

(5) pH optimum a pH stabilita

Pro tento účel se reakce 3-kyanpyridinu za vzniku nikotinamídu prováděla při 20 °C v reakění směsi (2,0 ml), která obsahovala různé pufry (42,5 mM), 1,71 Units čištěného enzymu a 500 mM 3-kyanpyridinu. pH optimum bylo ca při pH 6,5 ± 1,0 (Obr 8).

Pro stanovení pH stability se inkubovalo 4,2 Units čištěného enzymu v různých pufrech (45 mM) při 20 °C 1 hodinu. Část inkubovaného roztoku 1,71 Units se přidala ke standardní

- 17CZ 299166 B6 reakční směsi (srovnej Příklad 2(1)). Stanovila se zbylá aktivita. Enzym byl stabilní v rozsahu pH 5 až 9. Výsledek je vyznačen na Obr. 9.

(6) Inhibitory

Byl zjišťován účinek různých inhibitorů. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 12.

Tabulka 12

Vliv různých inhibitorů na čištěný enzym

Inhibitor	mM	Relativní aktivita (%)
N-ethylmaleinimid	1	100 97
kyselina jodoctová	1	39
kyselina 4-chlorměd'natobenzoová	0,1	69
natriumazid	1	59
hydroxylamin	1	37
fenylhydrazin	1	8
semikarbazin	1	82
tiron (dvojsodná sůl 4,5-dihydroxy- 1,3-benzendisulfonové kyseliny)	1	110
o-fenantrolin	1	89
α-,a¹-dipyridyl	1	100
8-hydroxychino1in	1	110
EDTA (kys. ethylendiamintetraoctová)	1	115
diethyldithiokarbaraát	1	89

Příklad 6

Vliv methanolu na buňky v klidu NA40

Reakce se prováděla 10 min. v přítomnosti 0 až 20 % (objem/objem) methanolu podle tabulky 13. Jak ukazuje tabulka 14, aktivita se zvyšuje přidáním 5 až 15 % methanolu.

-18CZ 299166 B6

Tabulka 13

Reakce s buňkami v klidu

Metody

	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)
1,0 M 3-kyanpyridin	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml	1,0 ml
0,1 Μ KPB* (pH 7,0)	0,9 ml	0,8 ml	0,7 ml	0,6 ml	0,5 ml
methanol	-	0,1 ml	0,2 ml	0,3 ml	o,4 ml
buněčná suspenze	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml	0,1 ml
celkový objem	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml	2,0 ml

KPB=kaliumfosfátový pufr

Tabulka 14 ío Vliv methanolu na Amycolatopsis NA40

Metody	Methanol [% (obj./obj.)]	Relativní aktivita [%]
(1)	0	100
(2)	5	123
(3)	10	128
(4)	15	130
(5)	20	105

Příklad 7

Obohacení mikroorganismů rodu Rhodococcus

Různé vzorky půdy se v obohacovacím médiu podle tabulky 1 naočkovaly kyselinou kyanoctovou jako zdrojem uhlíku a dusíku a podle příkladu 1 se izolovaly mikroorganismy Rhodococcus GF270, GF578, GF473 a GF376.

Příklad 8

Biotransformace s mikroorganismy rodu Rhodococcus 25 (1) Tepelná stabilita mikroorganismů Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF270 a Rhodococcus GF376 ve srovnání s Rhodococcus rhodochrous JI.

- 19CZ 299166 B6

Pro určení tepelné stability se shora uvedené mikroorganismy kultivovaly v následujících médiích.

Rhodococcus rhodochrous JI se kultivoval 72 hod. v médiu popsaném v EP-A-0 307 926. Mikroorganismy Rhodococcus GF674, GF578, GF270 a GF376 se kultivovaly v následujících médiích při pH 7,0 až 96 hod.

Rhodococcus GF674 v médiu obsahujícím extrakt kvasnic 1,0 g/1, fruktosu 5,0 g/1, extrakt sladu 10,0 g/1, acetamid 5,0 g/l/KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a COC1₂.6H₂O 10,0 mg.

Rhodococcus GF578 v médiu obsahujícím extrakt kvasnic 1,0 g/1, fruktosu 15,0 g/1, extrakt sladu 10,0 g/1, acetamid 25,0 g/1, KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄. 7H₂O 0,5 g/1 a COC1₂.6H₂O

5,0 mg.

Rhodococcus GF270 v médiu obsahujícím extrakt kvasnic 12,5 g/1, natriumcitrát 5,0 g/1, methakrylamid 7,5 g/1, KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a COC1₂.6H₂O 30,0 mg. Rhodococcus GF376 v médiu obsahujícím extrakt kvasnic 1,0 g/1, natriumcitrát 10,0 g/1, extrakt sladu 15,0 g/1, butyramid 7,5 g/1, KH₂PO₄ 2,0 g/1, MgSO₄.7H₂O 0,5 g/1 a

COC1₂.6H₂O 15,0 mg.

Pak se nechaly buňky v klidu 15 min. při různých teplotách a pak se určila zůstatková aktivita za standardních reakčních podmínek podle příkladu 2(1).

Při tom se zjistilo, že má Rhodococcus GF674 při teplotě 50 °C relativní aktivitu téměř

100% a při 60 °C má ještě aktivitu ca 10%. Rhodococcus GF578 měl rovněž 100% relativní aktivitu při 50 °C a relativní aktivitu 20 % při 60 °C. Rhodococcus GF376 měl 100 % relativní aktivitu až k 50 °C, při 60 °C měl relativní aktivitu 70 % a při 70 °C téměř 5 % relativní aktivitu.Rhodococcus GF270 měl až do 60 °C relativní aktivitu 100 % a rovněž při 70 °C ještě 5 % relativní aktivitu. Ve srovnání s tím měl Rhodococcus rhodochrous JI až k 50 °C relativní aktivitu 100 %, při 60 °C 80 % a při 70 °C již neměl žádnou aktivitu.

Lze shrnout, že Rhodococcus GF270 a GF376 mají lepší tepelnou stabilitu než JI a GF270 má nejlepší tepelnou stabilitu.

pH optimum kmenů Rhodococcus

Vliv hodnoty pH na aktivitu nitrilhydratázy kmenů Rhodococcus GF674, GF578, GF270, GF376 se zkoumal podle příkladu 2(5).

pH optimum Rhodococcus GF674 je při pH 7,5-9,5, GF578 při pH 8-8,5, GF270 při pH

6-7,0 a GF376 při pH 6-8.

(3) Substrátová specifita kmenů Rhodococcus

Substrátová specifita je shrnuté uvedena v tabulce 15 jako relativní aktivita.

(4) Akumulace nikotinamidu kmenů Rhodococcus

Jako v příkladu 2(6) se kmeny Rhodococcus GF674, GF578, GF270 a GF376 kultivovaly s 3-kyanpyridinem (ca 500 mM).

Přitom vytvořil Rhodococcus GF674 během 25 hod. 6 M nikotinamidu, Rhodococcus

GF578 během 10 hod. 5,5 M nikotinamidu, Rhodococcus GF270 během 20 hod. ca 8,5 M nikotinamidu a Rhodococcus GF376 během 20 hod. 7,5 M nikotinamidu.

(5) Tolerance 3-kyanpyridinu na aktivitu kmenů Rhodococcus

Pro testování tolerance 3-kyanpyridinu, se buňky v klidu 15 min. inkubovaly při 20 °C při koncentraci 3-kyanpyridinu mezi 1 a 10% (hmotn./obj.) a pak se buňky odstředily. Po promytí buněk 0,85 % Nad se měřila zbylá aktivita.

-20CZ 299166 B6

Tolerance 3-kyanpyridinu jako substrátu se testovala při různých koncentracích substrátu. Bylo zjištěno, že při koncentraci substrátu 2 % (hmotn./obj.) aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus rhodochrous J1 se snížila o faktor 1,4, aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus

GF674 při koncentraci substrátu 4% (hmotn./obj.) se snížila o faktor 1,4, aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF578 až po koncentraci substrátu 8 % zůstala téměř konstantní, aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF270 při koncentraci substrátu 4 % (hmotn./obj.) se snížila o faktor 1,17 a aktivita nitrilhydratázy z Rhodococcus GF376 při koncentraci substrátu 10 % (hmotn./obj.) se snížila o faktor 1,25.

Ve srovnání s jinými kmeny Rhodococcus měl Rhodococcus rhodochrous JI nejhorší toleranci vůči 3-kyanpyridinu.

-21 CZ 299166 B6

{Λ u u o u o w O s

GF376

100 (%)

54,3

79,8

ťN r~* tr,

O

m CO

o

908

un 04

VI C\

257

o

O

CA

s

u

o

O

s®

o

θ’·*

Γ

O

^r

Ch

CO

Ol

·—·

v

Γ4 U-

o

in

vf tn

m

O

OO*

o

kD

r^* m

00

CA

rn

o

w o

ϋ

o

es

ca

S

O

00

X©

o

o-

Ď*'

o

r-<

—>

o

CA

r*

oo

·—

XT

Ol

u

»n [x< u

o

Ό

V~i

O\

co

o

'í-

r*Y

\0

o

Ol

*w O

o o

Ol

****

00

3“

<s

r«>

ΟΊ

«Μ

ώ

ÍA

2

o

u

-3·

_so

o

o-

00

oo

ŮO

O

M*

>-♦

o-

o

MD

u

o

ro

n

xr

Γ*

o

θ’

o-

ca

xr

00

o-

w O

*< O

o o

rn

Ol

o

04

• 1 ·

04

XT

CA

f·

ctí

w-<

CA

»-s

cj

CA

o u o Ό

so cA O O

tn ^r

o r-

r- es

co oí

m

ΓΠ

809

rn ΤΓ

CM ΜΊ ΓΠ

478

ci 00

CA o OO

•a

δ

o

u

’C

.«5

«·*<

_c

5

o

r« o

—

L-«

T3

TJ

N

>Λ CL c fC

u* >x Q. C 5

Έ CL C re

o

lorben

*u +-· '£ o

*Γ2 *— r- o

'5 o L. ΪΟ

'c <-* Έ

e o

f

>1

řo

N

_*X

«—»

CL

Σ3

l-ř'

+-*

Ť

ř

¥

5

CJ

u

o

<u o

O u

CQ

b

g

ŮJ XT

rn

Ol

g·

CQ

Ol

rn

T

<

<—

-22CZ 299166 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Mikroorganismy rodu Amycolatopsis nebo Actinomadura, mající schopnost přeměňovat nitril na amid, jakož i ezymové extrakty z nich.
2. Mikroorganismy podle nároku 1, druhu Amycolatopsis NA40 a Amycolatopsis NE31 uložené pod depozitním číslem DSM 11617a DSM 11616, jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianto ty a mutanty.
3. Mikroorganismy druhu Rhodococcus GF270 a GF376, uložené pod depozitním číslem DSM 12211 a DSM 12175, jakož i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty, mající schopnost přeměňovat nitril na amid, jakož i enzymové extrakty z nich.
4. Enzym s aktivitou nitrilhydratázy, získatelný z mikroorganismů podle nároků 1 a 2.
5. Enzym podle nároku 4, který má a) pH optimum při pH 6,5 ± 1,0

20 b) teplotní optimum mezi 35 a 40 °C při pH 7,0

c) hodnotu K_M, pro substrát 3-kyanpyridin 41,7 ± 7,7 mM.
6. Způsob výroby amidů, vyznačující se tím, že se nitril jako substrát přemění na odpovídající amid pomocí mikroorganismů podle jednoho z nároků 1 až 3, enzymového extraktu

25 z těchto mikroorganismů nebo pomocí enzymu podle nároku 4.
7. Způsob podle nároku6, vyznačující se tím, že se jako nitril použije popřípadě substituovaný alifatický nitril s 1 až 10 atomy uhlíku.

30
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se jako nitril použije popřípadě substituovaný aromatický nitril se 4 až 10 atomy uhlíku v aromatickém kruhu.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující sloučenin obecných vzorců I nebo II se tí m, že se aromatický nitril zvolí ze kde R¹ a R² znamená atom vodíku, atom halogenu nebo Ci^- alkyl.
10. Způsob podle jednoho z nároků 6 až 9, vyznačující se tím, že se reakce provádí při teplotě od 0 do 50 °C a při pH 4,5 až 10.
11. Způsob podle jednoho z nároků 6 až 10, vy z n a č uj í c í se t í m , že se reakce provádí pomocí mikroorganismů rodu Amycolatopsis s označením NA40, uložených pod depozitním číslem DSM 11617, nebo NE31, uložených pod depozitním číslem DSM 11616, nebo s jejich funkčně ekvivalentními variantami nebo mutanty.