HU226274B1 - Process for preparing amides - Google Patents
Process for preparing amides Download PDFInfo
- Publication number
- HU226274B1 HU226274B1 HU0003069A HUP0003069A HU226274B1 HU 226274 B1 HU226274 B1 HU 226274B1 HU 0003069 A HU0003069 A HU 0003069A HU P0003069 A HUP0003069 A HU P0003069A HU 226274 B1 HU226274 B1 HU 226274B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- nitrile
- rhodococcus
- microorganisms
- amycolatopsis
- activity
- Prior art date
Links
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 title claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 54
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 claims description 53
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 51
- 241000187643 Amycolatopsis Species 0.000 claims description 49
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 claims description 43
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 40
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 30
- GZPHSAQLYPIAIN-UHFFFAOYSA-N 3-pyridinecarbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CN=C1 GZPHSAQLYPIAIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- -1 Aromatic nitrile Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 13
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 25
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 description 16
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 16
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 16
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 16
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 15
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241001327989 Actinoallomurus spadix Species 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 12
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 10
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 10
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- GJNGXPDXRVXSEH-UHFFFAOYSA-N 4-chlorobenzonitrile Chemical compound ClC1=CC=C(C#N)C=C1 GJNGXPDXRVXSEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- MLIREBYILWEBDM-UHFFFAOYSA-N cyanoacetic acid Chemical compound OC(=O)CC#N MLIREBYILWEBDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 6
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 6
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N adiponitrile Chemical compound N#CCCCCC#N BTGRAWJCKBQKAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GPHQHTOMRSGBNZ-UHFFFAOYSA-N pyridine-4-carbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=NC=C1 GPHQHTOMRSGBNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JAUPUQRPBNDMDT-UHFFFAOYSA-N 2-chloropyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClC1=NC=CC=C1C#N JAUPUQRPBNDMDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FFNVQNRYTPFDDP-UHFFFAOYSA-N 2-cyanopyridine Chemical compound N#CC1=CC=CC=N1 FFNVQNRYTPFDDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WBUOVKBZJOIOAE-UHFFFAOYSA-N 3-chlorobenzonitrile Chemical compound ClC1=CC=CC(C#N)=C1 WBUOVKBZJOIOAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GYCMBHHDWRMZGG-UHFFFAOYSA-N Methylacrylonitrile Chemical compound CC(=C)C#N GYCMBHHDWRMZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N butanamide Chemical compound CCCC(N)=O DNSISZSEWVHGLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N butyronitrile Chemical compound CCCC#N KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 150000001869 cobalt compounds Chemical class 0.000 description 4
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 4
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 125000000695 menaquinone group Chemical group 0.000 description 4
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 4
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 3
- PLZZPPHAMDJOSR-UHFFFAOYSA-N nonanenitrile Chemical compound CCCCCCCCC#N PLZZPPHAMDJOSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N propionitrile Chemical compound CCC#N FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZONJATNKKGGVSU-UHFFFAOYSA-N 14-methylpentadecanoic acid Chemical class CC(C)CCCCCCCCCCCCC(O)=O ZONJATNKKGGVSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGHSBPIZNUXPLA-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)=O JGHSBPIZNUXPLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFKYQYMHJANOTR-UHFFFAOYSA-N 2h-pyrimidine-1-carbonitrile Chemical compound N#CN1CN=CC=C1 BFKYQYMHJANOTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUELICYVEQDHIX-UHFFFAOYSA-N 4-(3-cyanopyridin-2-yl)pyridine-3-carboxamide Chemical compound C(#N)C=1C(=NC=CC=1)C1=CC=NC=C1C(=O)N FUELICYVEQDHIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024026 Nitrile hydratase Proteins 0.000 description 2
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001518128 Rhodococcus coprophilus Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N epsilon-caprolactam Chemical compound O=C1CCCCCN1 JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- QXOYPGTWWXJFDI-UHFFFAOYSA-N nonanedinitrile Chemical compound N#CCCCCCCCC#N QXOYPGTWWXJFDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- BEOUGZFCUMNGOU-UHFFFAOYSA-N tuberculostearic acid Chemical compound CCCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O BEOUGZFCUMNGOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFMPMSCZPVNPEM-UHFFFAOYSA-N 2-bromobenzonitrile Chemical compound BrC1=CC=CC=C1C#N AFMPMSCZPVNPEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHWQMJMIYICNBP-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzonitrile Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C#N NHWQMJMIYICNBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLNVISNJTIRAHF-UHFFFAOYSA-N 4-chlorobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 BLNVISNJTIRAHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MQWCXKGKQLNYQG-UHFFFAOYSA-N 4-methylcyclohexan-1-ol Chemical compound CC1CCC(O)CC1 MQWCXKGKQLNYQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DUJMVKJJUANUMQ-UHFFFAOYSA-N 4-methylpentanenitrile Chemical compound CC(C)CCC#N DUJMVKJJUANUMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005725 8-Hydroxyquinoline Substances 0.000 description 1
- 241000187642 Amycolatopsis methanolica Species 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101150019216 BETA1 gene Proteins 0.000 description 1
- ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N Bipyridyl Chemical group N1=CC=CC=C1C1=CC=CC=N1 ROFVEXUMMXZLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXKGHFUZEMZMOD-UHFFFAOYSA-N CCC(N)=O.CC(=C)C#N Chemical compound CCC(N)=O.CC(=C)C#N CXKGHFUZEMZMOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIUDGYMCSHLZAE-UHFFFAOYSA-N ClC1=CC=C(C#N)C=C1.ClC=1C=C(C(=O)N)C=CC1 Chemical compound ClC1=CC=C(C#N)C=C1.ClC=1C=C(C(=O)N)C=CC1 QIUDGYMCSHLZAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEWZYDAJEVWWMA-UHFFFAOYSA-N ClC1=NC=CC=C1C#N.ClC1=CC=C(C(=O)N)C=C1 Chemical compound ClC1=NC=CC=C1C#N.ClC1=CC=C(C(=O)N)C=C1 LEWZYDAJEVWWMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000595586 Coryne Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 241001524109 Dietzia Species 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N Pentanenitrile Chemical compound CCCCC#N RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100409194 Rattus norvegicus Ppargc1b gene Proteins 0.000 description 1
- 241000187563 Rhodococcus ruber Species 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 241000204066 Tsukamurella Species 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- ASLHGDLLKNKXKM-UHFFFAOYSA-N acetamide propanenitrile Chemical compound CCC#N.CC(N)=O ASLHGDLLKNKXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000005219 aminonitrile group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008430 aromatic amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- UQZCELIAPOTGHG-UHFFFAOYSA-N benzamide;prop-2-enenitrile Chemical compound C=CC#N.NC(=O)C1=CC=CC=C1 UQZCELIAPOTGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical class [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L cobalt(2+) sulfate Chemical class [Co+2].[O-]S([O-])(=O)=O KTVIXTQDYHMGHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- QAHREYKOYSIQPH-UHFFFAOYSA-L cobalt(II) acetate Chemical class [Co+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O QAHREYKOYSIQPH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- NKKMVIVFRUYPLQ-NSCUHMNNSA-N crotononitrile Chemical compound C\C=C\C#N NKKMVIVFRUYPLQ-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- DFJYZCUIKPGCSG-UHFFFAOYSA-N decanedinitrile Chemical compound N#CCCCCCCCCC#N DFJYZCUIKPGCSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940116901 diethyldithiocarbamate Drugs 0.000 description 1
- LMBWSYZSUOEYSN-UHFFFAOYSA-N diethyldithiocarbamic acid Chemical compound CCN(CC)C(S)=S LMBWSYZSUOEYSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRKBLBQTSTUKOV-UHFFFAOYSA-N diphosphatidyl glycerol Natural products OP(O)(=O)OCC(OP(O)(O)=O)COP(O)(O)=O FRKBLBQTSTUKOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZTOMUSMDRMJOTH-UHFFFAOYSA-N glutaronitrile Chemical compound N#CCCCC#N ZTOMUSMDRMJOTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- VFQXVTODMYMSMJ-UHFFFAOYSA-N isonicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=NC=C1 VFQXVTODMYMSMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004767 nitrides Chemical class 0.000 description 1
- 229960003540 oxyquinoline Drugs 0.000 description 1
- IPWFJLQDVFKJDU-UHFFFAOYSA-N pentanamide Chemical compound CCCCC(N)=O IPWFJLQDVFKJDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N phenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1 HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067157 phenylhydrazine Drugs 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-BKFZFHPZSA-N potassium-44 Chemical compound [44K] ZLMJMSJWJFRBEC-BKFZFHPZSA-N 0.000 description 1
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940080818 propionamide Drugs 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- TWNDNUUBEBLCNU-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-carbonitrile;pyridine-3-carboxamide Chemical compound N#CC1=CC=CC=N1.NC(=O)C1=CC=CN=C1 TWNDNUUBEBLCNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- IAHFWCOBPZCAEA-UHFFFAOYSA-N succinonitrile Chemical compound N#CCCC#N IAHFWCOBPZCAEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 229940046001 vitamin b complex Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/03—Actinomadura
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/829—Alcaligenes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
A találmány új, az Actinomadura, Amycolatopsis és Rhodococcus nemzetségéhez tartozó mikroorganizmusokra vonatkozik. A találmány továbbá amidok előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik, amely eljárás során az említett mikroorganizmusokat, illetve e mikroorganizmusok enzimkivonatait felhasználjuk.
Amidok, például a nikotinsavamid - a B-vitaminkomplex egyik, ember és állat egyaránt esszenciális vitaminja - előállítására már több biotechnológiai eljárás ismert. Általánosan ismert, hogy nitrilhidratázt tartalmazó mikroorganizmusok nitrileket a megfelelő amidokká alakítanak. Az EP-A-0 188 316 például a 3-cian-piridinből kiinduló eljárást ír le nikotinsavamid előállítására, amelynek során Rhodococcus, Arthrobacter vagy Microbacterium nemzetségbeli mikroorganizmusokat alkalmaznak.
Az eljárás hátránya, hogy az említett mikroorganizmusok aktivitása a 3-cian-pirimidin->nikotinsavamid reakció vonatkozásában csak csekély.
Az EP-A-0 307 926 szerint a 3-ciano-piridin nikotinsavamiddá alakítását Rhodococcus rhodochrous J1 fajtájú mikroorganizmus segítségével végzik. A mikroorganizmusokat indukálni kell, máskülönben nem katalizálják a kívánt reakciót. Hátrányos az is, hogy a Rhodococcus rhodochrous J1 törzs piros színű, így a termék elszlneződik. Emellett a mikroorganizmus hőstabilitása csekély, és például a 3-ciano-pirimidinszubsztrátum gátolja a törzs növekedését.
Nikotinsavamid előállítására irányuló, 3-ciano-piridinből kiinduló és a Rhodococcus rhodochrous J1 törzset alkalmazó eljárást az EP-A-0 362 829 is írja le. A nitrilhidratáz-tartalmú mikroorganizmusok aktivitásának növelése céljából karbamidot, illetve karbamidszármazékot adnak a tápközeghez induktorként. Mint az előzőleg leírt eljárás esetén, itt is elszíneződött termék keletkezik.
A WO 95/17 5065 tárgya eljárás aromás amidok előállítására a megfelelő nitrilekből Rhodococcus rhodochrous M33 mikroorganizmusok segítségével. Hátrányos, hogy a Rhodococcus rhodochrous M33 törzs is piros, továbbá, hogy a 3-ciano-pirimidin szubsztrátum esetén mért KM-értéke nagy.
A találmány feladata a fenti hátrányok megszűntetése és olyan eljárás kidolgozása volt, amellyel a megfelelő amidok nagy hozamban és jó tisztaságban különíthetők el.
A fenti feladatot az új, 1., 3. és 4. igénypont szerinti mikroorganizmusokkal, valamint a 7. igénypont szerinti eljárással oldottuk meg.
A találmány szerint az eljárás során egy nitrilt mint szubsztrátumot Actinomadura, Amycolatopsis vagy Rhodococcus nemzetségű mikroorganizmusokkal vagy ezek enzimkivonatával, vagy Amycolatopsis vagy Actinomadura nemzetségű mikroorganizmusok tisztított nitrilhidratázával megfelelő amiddá alakítunk.
A biotranszformáláshoz alkalmazott nitrilek, például a 3-ciano-piridin, a kereskedelmi forgalomban kapható vegyületek.
A találmány szerinti mikroorganizmusok képesek arra, hogy nitrileket mint szubsztrátumokat a megfelelő amidokká alakítsák. A mikroorganizmusok előnyösen azzal a képességgel is rendelkeznek, hogy nitriliken vagy amidokban mint egyetlen C- és/vagy N-forráson növekedjenek.
A találmány szerinti mikroorganizmusok megfelelő szelektálással például talajmintákból, Iszapból vagy szennyvízből kaphatók a szokásos mikrobiológiai technikák segítségével. Célszerű, ha a mikroorganizmusokat nitrilek vagy amidok mint előnyösen egyetlen C- és N-forrás jelenlétében és kobaltionok jelenlétében tenyésztjük és szelektáljuk. A szelektáláshoz nitrilként, illetve amidként előnyösen a későbbi biotranszformáláshoz szubsztrátumként alkalmazott nitrileket és a megfelelő, ezekből képződő amidokat alkalmazzuk. A szaporításhoz szükséges közegeket a szakember ismeri; például az 1. táblázat szerinti közeg alkalmazható. Általában ugyanígy tenyésztjük a mikroorganizmusokat a tulajdonképpeni biotranszformálás előtt is, ugyanezekben a közegekben.
Szakember tudja, hogy nitrilhidratáz csak akkor képződik, ha a tenyészközeg kofaktorként kobaltionokat tartalmaz. Kobaltionokat adó kobaltvegyületek például Co2+- és Co3+-sók. A Co2+- és Co3+-sók példáiként a kobalt-kloridokat, kobalt-szulfátokat és kobaltacetátokat nevezzük meg.
Célszerűen kobaltvegyületként Co2+-sót, például CoCI2-ot alkalmazunk. A tenyésztést azonban B12-vitamin és fémkobalt vagy más, in situ kobaltiont leadó kobaltvegyületek jelenlétében végezhetjük. A kobaltvegyületet előnyösen 1-10 mg/l, különösen előnyösen
1-3 mg/l mennyiségben alkalmazzuk.
A tenyésztés hőmérséklete általában 20-50 °C, a pH-érték 5 és 8 közötti. Előnyösen a hőmérséklet 30-45 °C, a pH 5,5 és 7,5 közötti.
A tulajdonképpeni biotranszformálás Actinomadura vagy Amycolatopsis nemzetségbeli mikroorganizmusokkal, azok enzimkivonatával vagy tisztított nitrilhidratázával történhet. Célszerű, ha a biotranszformáláshoz Actinomadura spadix fajtájú mikroorganizmust, például az Actinomadura spadix E3733, Actinomadura spadix E3736, Actinomadura spadix 45A32, Actinomadura spadix 4501 vagy Actinomadura spadix C15 izolátumot alkalmazunk. Előnyös, ha a biotranszformáláshoz az Amycolatopsis NE 31 és Amycolatopsis NA40 törzseket vagy funkcionálisan ekvivalens variánsait és mutánsait alkalmazzuk. Különösen előnyösen az Amycolatopsis NA40 törzset alkalmazzuk. Az említett mikroorganizmusokat 1997. 06. 03-án a Mikroorganizmusok és Sejtkultúrák Német Gyűjteményében (D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg 1b) a Budapesti szerződés értelmében letétbe helyeztük Amycolatopsis NE31 és Amycolatopsis Na40 néven, DSMZ 11616, illetve DSMZ letétbehelyezési szám alatt. A két mikroorganizmust közelebbről megvizsgáltuk; az Amycolatopsis nemzetségnek az irodalomban eddig le nem írt törzséről van szó.
A fentiek értelmében a találmány az Amycolatopsis vagy Actinomadura nemzetséghez tartozó mikroorganizmusokra is vonatkozik, amelyek képesek nitrilt amiddá alakítani. A találmány különösen az Amycola2
HU 226 274 Β1 topsis NA40 (DSMZ 116117) és Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) mikroorganizmusokra vonatkozik.
Azt találtuk továbbá, hogy a Rhodococcus nemzetséghez tartozó bizonyos mikroorganizmusok a nitril->amid átalakítás vonatkozásában jobb tulajdonságokkal rendelkeznek, mint az EP-A-0 362 829 szerinti Rhodococcus rhodochrous J1. Ezek a bizonyos mikroorganizmusok az alábbiak: Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF270 (DSMZ 12211) és Rhodococcus GF376 (DSMZ 12175) vagy ezek funkcionálisan ekvivalens variánsai és mutánsai. A DSMZ 12175 mikroorganizmus 1998. 05. 15-én és a DSMZ 12211 mikroorganizmus 1998. 05. 08-án került letétbe a Mikroorganizmusok és Sejtkultúrák Német Gyűjteményében a Budapesti szerződés szerint.
A GF270, GF376, GF473, GF578 és GF674 Rhodococcus törzsek az azonosítás szerint a Rhodococcus nemzetségnek az irodalomban eddig le nem írt törzsei. Ennek értelmében a találmány a Rhodococcus GF270, Rhodococcus GF376, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF578 és Rhodococcus GF674.
Az Actinomadura és Amycolatopsis nemzetségbeli mikroorganizmustörzsekkel ellentétben a Rhodococcus nemzetséghez tartozó mikroorganizmusokat a biotranszformálás előtt célszerűen indukáljuk. Induktorként az EP-A-0 307 926 számú közzétett európai szabadalmi bejelentésben leírt induktorok alkalmasak, így például acetamid, butiramid, metakrilamid, propionsavamid, krotonamid és valeriánsavamid.
A „funkcionálisan ekvivalens variánsok és mutánsok” terminuszon olyan mikroorganizmusokat értünk, amelyek a fent említett eredeti organizmusokból származnak, és lényegében ugyanazokkal a tulajdonságokkal és funkciókkal rendelkeznek, mint amazok. Az ilyen variánsok és mutánsok véletlenül, például UV-besugárzás vagy mutagén vegyszerek hatására jöhetnek létre.
Amycolatopsis NA40 azonosítása Levegőmicélium színe fehér
Szubsztrátumban lévő micélium narancsszínű
| Kidiffundált pigment színe - | |
| Cukorspektrum | |
| ARA | + |
| GÁL | + |
| MAD | - |
| XYL | - |
| GLU | tr |
| RIB | Ί- |
| Típus | Α |
| DAP | DL |
| Menakinonok (%-ban) | |
| 8/4 | - |
| 9/0 | (+) |
| 9/2 | + |
| 9/4 | +++ |
| 9/6 | - |
| 9/8 | - |
| 16S rDNS-homológia | 96,9% |
Foszfolipidek, például PE, OH-PE, lizo-PE met PE, PC, NPG, Pl PIM,
| PG, DPG, GL | nincs vizsgálva |
| Zsírsavak | |
| izo 16 | +++ |
| izo 15 | + |
| izo 17 | (+) |
| anteizo 15 | (+) |
| anteizo 17 | (+) |
| 10-Me 16 | - |
| 10-Me 17 | + |
| 2-OH 15 | + |
| 2-OH 16 | + |
| Típus | 3f |
| MS | - |
| Amycolatopsis NE31 azonosítása | |
| Levegőmicélium színe | fehér |
| Szubsztrátumban lévő micélium | narancsszínű |
| Kidiffundált pigment színe | - |
| Cukorspektrum | |
| ARA | + |
| GÁL | + |
| MAD | - |
| XYL | - |
| GLU | tr |
| RIB | + |
| Típus | A |
| DAP | DL |
| Menakinonok (%-ban) | |
| 8/4 | - |
| 9/0 | (+) |
| 9/2 | + |
| 9/4 | +++ |
| 9/6 | - |
| 9/8 | - |
| 16S rDNS-homológia | 96,1% |
| Foszfolipidek, például | |
| PE, OH-PE, lizo-PE | |
| met-PE, PC, NPG, Pl | |
| PIM, PG, DPG, GL | nincs vizsgálva |
| Zsírsavak | |
| izo 16 | +++ |
| izo 15 | + |
| izo 17 | (+) |
| anteizo 15 | (+) |
| anteizo 17 | (+) |
| 10-Me 16 | |
| 10-Me 17 | + |
| 2-OH 15 | + |
| 2-OH 16 | + |
| Típus | 3f |
| MS | - |
Az azonosításban alkalmazott rövidítések:
| (+) | 1-5% |
| + | 5-15% |
| ++ | 15-30% |
| +++ | >30% |
HU 226 274 Β1
| DAP | diamino-pimelinsav |
| ARA | arabinóz |
| GÁL | galaktóz |
| MAD | maduróz |
| XYL | xilóz |
| GLU | glükóz |
| RIB | ribóz |
Cukortípusok Lechevalier és munkatársai (1971) szerint
Zsírsavtípusok Kroppenstedt (1985 és 1992) szerint
| 9/4 | MK-9 (H4) |
| 9/6 | MK-9 (H6) |
| 9/8 | MK-9 (H„) |
| MS | mikolsavak |
| PE | foszfatidil-etanol-amin |
| OH-PE | hidroxí-PE |
| met-PE | foszfatidil-metil-etanol-amin |
| PC | foszfatidil-kolin |
| NPG | foszfatidil-glükóz-amin |
| Pl | foszfatidil-inozitol |
| PIM | foszfatidil-inozitol-mannozid |
| PG | foszfatidil-glicerin |
| DPG | difoszfatidil-glicerin |
| GL | glikolipidek |
| Zsírsavak izo 16 | izo-hexadekánsavak vagy |
| 10-Me-18 | 14-metil-pentadekánsavak tuberkulo-sztearinsav |
| 2-OH-16 | 2-hidroxi-palmitinsav. |
GF270, GF376, GF473, GF578és GF674 azonosítása
A fenti törzsek azonosítása öt, egymástól független tulajdonságon alapul.
1. A telepek morfológiája és színe: rövid, elágazó hífák, amelyek pálcika- és spóraszerű elemekké bomlanak. GF270 és GF376 telepei lazacpirosok (RAL 3022), GF578 és GF674 telepei világospirosak (RAL 3012).
2. A peptidoglikán diaminosava: mezo-diamino-pimelinsav
3. Mikolsavak: Rhodococcus-mikolsavak: a hosszú szénláncú mikolsav meghatározását nagy hőmérsékletű gázkromatográfiásán végeztük. GF270 és GF376, valamint GF473, GF578 és GF674 mikolsavainak eluálási profilja azonos volt. GF270 és GF376 mikolsavának hossza C38-C46, a GF473, GF578 és GF674 mikolsava hossza C40-C48 volt. A mikolsavmintákat összehasonlítottuk Rhodococcus törzsek mikolsavmintájával. A GF270 törzset igen kis korrelációs tényezővel (0,086) mint Rhodococcus rhodochroushoz tartozónak azonosítottuk; GF376 ezzel a módszerrel nem volt azonosítható. A többi három izolátum (GF473, GF578 és GF674) igen kis korrelációs tényezővel Rhodococcus ruberhoz került.
4. Zsírsavminták: egyenes szénláncú, telített és telítetlen zsírsavak, tuberkolosztearinsav is. A zsírsavminta jellemző minden Rhodococcus nemzetségre és közeli rokonokra (Mycobacterium, Nocardia,
Dietzia, Tsukamurella és néhány Coryne baktériumfajta). Fajtaszinten az azonosítás a GF270,
GF376, GF473, GF578 és GF674, valamint Rhodococcus fajták zsírsavmintái közötti mennyiségi és minőségi különbségek alapján történt.
5. A GF270 és GF376 16S rDNS-részszekvenciái azonosak voltak (100%), bár ezek és a Rhodococcus törzsekének összehasonlítása csak 99,1%-os hasonlóságot mutatott a legközelebbhez álló Rhodococcus rhodochroushoz. GF473 és GF578 16S rDNS-szekvenciája azonos volt (100%). GF674 GF578-tól csak egy bázispárban különbözik (500 közül; 99,8%). Mind a három izolált törzs Rhodococcus coprophilushoz csak távoli rokonságot mutat (98,4%). Kemotaxikus és molekulárbiológiai eredmények alapján a fentiekből arra lehet következtetni, hogy GF270 és GF376 egyrészt, és GF473, GF578 és GF376 másrészt két új Rhodococcus fajta törzsei. GF270 és GF376 a 16S rDNS-szekvenciája alapján közeli rokonai a Rhodococcus rhodochrousnak (99,1%), míg GF473, GF578, GF674 csak távoli rokonai a Rhodococcus coprophilusnak (98,4%).
Az enzimkivonatok a mikroorganizmusok szakember számára ismert módon történő feltárással nyerhetők. A feltárás például ultrahanggal, French-préssel vagy a lizozimes módszerrel történhet. Mind az enzimkivonat, mind természetesen az egész mikroorganizmus az eljárás megvalósítása céljából alkalmas hordozóanyagon, általában polimerbe beágyazva immobilizálható vagy alkalmas hordozóhoz adszorbeálható.
A nitrilhidratáz-aktivitással rendelkező, találmány szerinti enzimek a Amycolatopsis nemzetségben mikroorganizmusokból nyerhetők, és képesek a nitril->amid átalakításra. Az enzimek különösen az Amycolatopsis NA40 (DSMZ) törzsből nyerhetők. Ezeknek az enzimeknek főleg az alábbi tulajdonságai vannak:
a) pH-optimum 6,5±1,0
b) hőmérséklet-optimum (pH=7 mellett) 35 °C és ’C között
c) 3-ciano-piridin-szubsztrátum esetén a KM-érték
41,7 mM±7,7 mM (20 °C 45 mM foszfátpuffer, pH=7)
d) móltömegük 106 kDa, például SDS-PAGE szerint meghatározva.
A biotranszformálás szubsztrátumai általánosan nitrilek. Célszerűen alifás, 1-10 szénatomos, adott esetben például hidroxil-, aminocsoporttal, halogénatommal vagy karboxilcsoporttal szubsztituált nitrileket, vagy szubsztituált vagy szubsztituálatlan, az aromás gyűrűrendszerben 4-10 szénatomot tartalmazó aromás nitrileket alkalmazunk. Az 1-10 szénatomos alifás nitrilek lehetnek dinitrilek, hidroxi-nitrilek, amino-nitrilek. így például n-oktan-nitril, ciano-ecetsav, izokapro-nitril, n-valeronitril, adiponitril, glutaronitril, szukcinonitril, szebaconitril, propionitril, krotonitril, akrilnitril, metakrilnitril, n-vajsavnitril vagy azelanitril. Aromás nitrilként az (I) vagy (II) általános képletű nitrilek jöhetnek számításba, amelyek képletében R1 és R2 jelentése hidrogénatom, halogénatom vagy Ci-C4-alkil-csoport. A halo4
HU 226 274 Β1 génatom lehet fluor-, klór-, bróm- vagy jódatom. A C1-C4-alkil-csoport példájaként az alábbiakat soroljuk fel: metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutilvagy terc-butil-csoport. (I), illetve (II) általános képletű nitrilként célszerűen az alábbiakat alkalmazzuk: 2-, 3vagy 4-ciano-piridin, benzonitril, fluor-, klór-, brómbenzonitril, így például ο-, m-, p-klór-benzonitril vagy
2-klór-3-ciano-piridin. Az aromás magban 4-10 szénatomot tartalmazó aromás nitrilként előnyösen 3-cianopiridint alkalmazunk.
A biotranszformálás során a szubsztrátumot egyszerre vagy folyamatosan adjuk a reakcióelegyhez, előnyösen úgy, hogy a szubsztrátomkoncentráció ne haladja meg a 40 tömeg%-ot, előnyösen a 30 tömeg%-ot.
Az eljárást célszerűen nyugvó (nem növekvő) sejtekkel valósítjuk meg.
A biotranszformálás során közegként a szakember számára ismert közegeket alkalmazhatjuk, például: kis koncentrációjú foszfátpuffer, HEPES-puffer, citrátpuffer, borátpuffer, az 1., 2. és 3. táblázat szerinti közegek vagy ezek megváltoztatott formái, például a 8. példa 1. pontjában leírt TRIS-HCI-puffer.
A biotranszformálást célszerűen 0-50 °C-on és 4,5 és 10 közötti pH-értéken valósítjuk meg. A hőmérséklet előnyösen 20-40 ’C, a pH-érték előnyösen 4,5 és 10,0 közötti.
Az eljárás egy különösen előnyös kiviteli módja szerint a biotranszformálás C^-C^-alkoholok jelenlétében végezhetjük. C.,-C4-alkoholként metanolt, etanolt, propanolt vagy butanolt alkalmazhatjuk. A metanolt előnyben részesítjük.
A reakció befejeztével az előállított amidokat a szokásos feldolgozási módszerekkel, például kristályosítással elkülöníthetjük.
Példák
1. példa
Actimadura és Amycolatopsis nemzetségbeli mikroorganizmusok tenyésztése
a) Különböző talajmintákat az 1. táblázat szerinti dúsítóközegben C- és N-forrásként szolgáló különböző nitrilekkel oltottunk, majd 7-10 napon át 37 °C-on vagy 45 °C-on inkubáltunk. Ezt követően a tenyészeteket azonos közegbe átoltottuk, és újból 37 °C-on 7-10 napon át inkubáltuk. Ezt háromszor megismételtük. Ezt követően a tenyészeteket hígítottuk és szélesztettük, hogy telepeket kapjunk. A lemezeket 5 napon át 37 °C-on inkubáltuk. Utána a kapott telepek aktivitását vizsgáltuk.
A fentiek szerint az Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) és Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) törzseket izoláltuk, majd optimált közegben (3. táblázat) 90-100 órán át rázógépen 37 ’C-on tenyésztettük.
Az Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616), Actinomadura spadix E3733 és Actinomadura spadix E376 törzsek számára adiponitril, az Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617), Actinomadura spadix 45A32 törzsek számára azelanitril, az Actinomadura spadix
4501 törzs számára n-oktánitril és az Actinomadura spadix C15 törzs számára ciano-ecetsav volt a C- és
N-forrás.
b) Az Amycolatopsis NA40 törzset a 3. táblázat szerinti közegben tenyésztettük. A tenyésztést „szubkultúrákban” (4 ml/üvegcse) és egy „főtenyészet”-ben (500 ml/lombik) aerob körülmények között, 37 ’C hőmérsékleten 2, illetve 3-4 napon át végeztük. A sejtek növekedését turbimetriásan, 610 nm hullámhosszon mértük, és a sejtek száraztömegét az m (mg/ml)=ODei0 nm*0,277 képlettel számítottuk.
1. táblázat
| Dúsftóközeg | |
| Nitril | 2,0 g |
| KH2PO4 | 7,0 g |
| MgSO4.7H2O | 0,1 g |
| Vitaminkeverék | 1,0 ml |
| COCI2.6H2O | 2,0 mg |
| FeSO4.7H2O | 2,0 mg |
Vízzel 1 literre feltölteni (pH=6,7-7,3)
2. táblázat
| Bázisközeg | |
| Maltóz | 2,0 g |
| NaNO3 | 1,0 g |
| K2HPO4 | 0,1 g |
| MgSO4.7H2O | 0,05 g |
| Vízzel 100 ml-re feltölteni (pH=7,0) | |
| 3. táblázat | |
| Optimált közeg | |
| D-glükóz | 4,5 g |
| Húskivonat | 0,5 g |
| K2HPO4 | 0,1 g |
| MgSO4.7H2O | 0,05 g |
| COCI2.6H2O | 1,0 mg |
Vízzel 100 ml-re feltölteni (pH=7,0)
2. példa
Actinomadura és Amycolatopsis nemzetségben mikroorganizmusokkal végzett biotranszformálás (1) A nitrilhidratáz-aktivitás meghatározására 3 cianopiridin (1,0 M; 1,0 ml), kálium-foszfát-puffer (pH=7,0; 0,1 M; 0,5 ml) és 0,5 ml sejtszuszpenzió 2 ml térfogatú reakcióelegyét 20 °C-on keverés közben 30 percen át inkubáltuk. A reakciót 0,2 ml 3 N HCI adagolásával félbeszakítottuk. Rövid centrifugálás után a keletkezett nikotinamidot nagynyomású folyadékkromatográfiásán (Shimadzu SPD 6A rendszer C18 oszloppal; Develosil ODS-HG-5, 4,6*250 cm) eluálófolyadék: KH2PO4/H3PO4 (pH=2,8) és acetonitril 9:1 térfogatarányú elegye; áramlás: 1 ml/perc; az abszorpciót 230 nm-nél mértük) meghatároztuk. A fajlagos aktivitást a képződött nikotinamid ml-re, percre és OD6io nm’re vonatkoztatott pmol-ban adott mennyiségeként fejeztük ki.
HU 226 274 Β1
Az 5. táblázat mutatja az elkülönített baktériumokkal dúsítóközegben elért nitrilkonvertálást, a 2. táblázat szerinti bázisközegben lévő induktorok és kofaktorok befolyását a 4. táblázat szemlélteti, míg a 6. táblázat az Amycolatopsis és Rhodococcus bázisközegben kifej- 5 tett aktivitásának összehasonlítását tartalmazza. A 4. táblázatból kivehető módon Amycolatopsis NA40 a nitrilhidratáz-enzimet termeli, de az aktivitáshoz kobalt mint kofaktor szükséges.
(2) A hőmérséklet befolyása NA40 növekedésére ml térfogatú szubkultúrákat a 3. táblázat szerinti közegben 37 °C-on 2 napon át inkubáltunk, majd rázólombikban lévő 20 ml 3. táblázat szerinti közegbe átoltottuk. A tenyésztést 37,40,45, 50, illetve 55 °C-on 3-4 napon keresztül rázás közben folytattuk. Megmértük a sejtnövekedést, és meghatároztuk - 20 °C-on - a nitrilhidratáz-aktivitást. A 7. táblázat mutatja a hőmérséklet befolyását a sejtnövekedésre és a nitrilhidratáz-aktivitásra.
4. táblázat
Induktorok és kofaktorok befolyása a bázisközegben kifejtett fajlagos aktivitásra
| Induktor | Növekedés (°D610 nm) | összaktivitás (pmol/mlperc) | Fajlagos aktivitás (pmol/ml-perc-OD) |
| - | 1,26 | 20,9 | 16,6 |
| ε-Kaprolaktám | 0,66 | 9,52 | 14,5 |
| Krotonamid | 3,41 | 22,9 | 6,72 |
| Metakrilamid | 3,33 | 2,46 | 0,74 |
| Butiramid | 2,19 | 0,19 | 0,88 |
| Propionamid | 1,91 | 0,92 | 0,48 |
| Karbamid | 1,72 | 2,97 | 1,73 |
| Kofaktor: | |||
| - | 7,97 | 0,10 | 0,01 |
| FeSO4.7H2O | 8,32 | 3,36 | 0,40 |
| CoCI2.6H2O | 8,41 | 47,8 | 5,68 |
5. táblázat
Alifás nitrilek elkülönített baktériumokkal elérhető konvertálása
| Törzs | Szubsztrátum | Növekedés (OD610 nm) | Összaktivitás (pmol/ml'perc) | Fajlagos aktivitás (pmol/ml-perc-OD) |
| Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) | adiponitril | 2,68 | 0,377 | 0,141 |
| Actinomadura spadix E3733 | adiponitril | 1,62 | 0,347 | 0,214 |
| Act. sp. E3736 | adiponitril | 1,36 | 3,00 | 2,21 |
| Act. sp. 45A32 | azelanitril | 5,81 | 18,8 | 3,23 |
| Act. sp. 4501 | n-oktán-nitril | 7,24 | 32,2 | 4,45 |
| Act. sp. C15 | ciano-ecetsav-nitril | 2,04 | 7,01 | 3,43 |
| Amycolatopsis NA4 (DSMZ 11617) | azelanitril | 5,92 | 33,0 | 5,57 |
6. táblázat
Amycolatopsis NA40 és Rhodococcus rhodochrous aktivitásának összehasonlítása
3-cianoecetsav szubsztrátum esetén
| Amycolatopsis NA40 (DSMZ11617) | Rhodococcus rhodochrous J1 | |
| Mikroorganizmusok aktivitása (pmol/ml perc) | 303 | 314 |
| Tisztított enzim aktivitása (pmol/perc mg protein) | 1110 | 371 |
(3) Az NA40 törzs aktivitását több szubsztrátum esetén akartuk vizsgálni, ezért 0,0388 mg száraztömegű sejteket a fent leírt pufferban inkubáltunk. A reagá60 lást a megfelelő szubsztrátum adagolásával beindítottuk, és a tenyészeteket 20 °C-on rázás közben 10 percen át inkubáltuk.
HU 226 274 Β1
A reakciót 0,2 ml 2 N HCI adagolásával félbesza- natkozásában végzett teszt feltételeit tartalmazza, kilőttük, és a reakcióelegyet centrifugáltuk. A felül- míg a 9. táblázat az NA40 nyugvó sejtjeivel különúszót HPLC vagy gázkromatográfia segítségével ele- böző szubsztrátumokra kapott eredményeket tartalmeztük. A 8. táblázat a szubsztrátumfajlagosság vo- mázzá.
7. táblázat
A hőmérséklet befolyása a nitrilhidratáz-aktivitásra és a sejtnövekedésre
| Hőmérséklet (°C) | Növekedés (mg/ml) | Ossza ktivitás (pmol/ml-perc) | Fajlagos aktivitás (pmol/mlperc-mg) | Relatív aktivitás (%) |
| 37 | 6,16 | 4,69 | 0,761 | 100 |
| 40 | 5,79 | 9,89 | 1,71 | 225 |
| 45 | 6,56 | 4,83 | 0,736 | 97 |
| 50 | 596 | 1,16 | 0,195 | 26 |
8. táblázat
A szubsztrátumfajlagosság tesztkörülményei
| Szubsztrátum | Szubsztrátum konc. (mM) | Elemzési módszer | Képződött amid |
| 3-Ciano-piridin | 1,0 | HPLC | nikotinamid |
| 2-Ciano-piridin | 0,25 | HPLC | 2-pikolinamid |
| 4-Ciano-piridin | 0,25 | HPLC | piridin-4-karboxamid |
| Krotonitril | 0,4 | HPLC | krotonamid |
| Benzonitril | 0,03 | HPLC | benzamid |
| Akrilnitril | 0,4 | HPLC | akrilamid |
| o-Klór-benzonitril | 0,15 | HPLC | o-klór-benzamid |
| m-Klór-benzonitril | 0,15 | HPLC | m-klór-benzamid |
| p-Klór-benzonitril | 0,15 | HPLC | p-klór-benzamid |
| 2-Klór-3-ciano-piridin | 0,15 | HPLC | 2-klór-nikotinamid |
| Acetonitril | 0,4 | GC | acetamid |
| Propionitril | 0,4 | GC | propionamid |
| Metakrilnitril | 0,4 | GC | metakrilamid |
| n-Butironitril | 0,4 | GC | n-butiramid |
ο-, m-, p-Klór-benzonitrilt és 2-klór-3-ciano-piridint metanolos oldatként adagoltunk a reakcióelegyhez.
9. táblázat
NA40-nitril-hidratát szubsztrátumfajlagossága
| Szubsztrátum | Relatív aktivitás (%) | Szubsztrátum | Relatív aktivitás (%) |
| 3-Ciano-piridin | 100 | m-klór-benzonitril | 75 |
| 4-Ciano-piridin | 168 | p-klór-benzonitril | 16 |
| 2-Ciano-piridin | 128 | 2-klór-3-ciano-piridin | 126 |
| Benzonitril | 51 | acetonitril | - |
| Krotonitril | 52 | propionitril | 105 |
| Akrilnitril | 115 | metakrilnitril | 130 |
| o-Klór-benzonitril | 96 | n-butironitril | 194 |
HU 226 274 Β1 (4) Hőmérséklet-optimum és termikus stabilitás nyugvó sejtekkel
A reagáltatást 10 percen át a szabvány reakcióelegyben végeztük. A hőmérséklet optimuma 35 °C és 40 °C között volt (5. ábra). Ezt követően a sejteket különböző hőmérsékleten 30 percen át inkubáltuk, és az aktivitást szabványfeltételek mellett vizsgáltuk. A 4. ábrából kivehető módon a hőstabilitás határa kb. 40 °C-nál volt.
(5) pH-optimum és pH-stabilitás nyugvó sejtekkel
A reagáltatást 10 percen át olyan szabvány reakcióelegyben végeztük, amelyben a kálium-foszfát-puffer különböző 0,1 M pufferokkal ki lett cserélve. A 6. ábra azt mutatja, hogy a pH-optimum 4,5 és 10 közötti volt. Miután a sejtszuszpenziókat különböző pH-értékek mellett 20 °C-on 30 percen át inkubáltuk, a sejteket centrifugáltuk, mostuk, majd 0,1 M káliumfoszfát-pufferben (pH=7,0) újból szuszpendáltuk. A reakció 10 percen át, 3-ciano-piridin adagolása mellett, szabványkörülmények között folyt. Az enzim pH=4,5 és pH=10 között stabil volt (lásd 7. ábra).
(6) 3-Ciano-piridinből NA40 segítségével nyert nikotinamid felhalmozódása ml térfogatú reakcióelegyben végeztük a reagáltatást. Az elegy 500 nM 3-ciano-piridint, 40 mM káliumfoszfát-puffert (pH=7,0) és 2,3 mg száraztömegű nyugvó sejteket tartalmazott. Hétszer adagoltunk 3-cianopiridin (500 mM), ahányszor az elfogyott. Tizenöt óra alatt összesen 4,0 M 3-ciano-piridint adagoltunk, 3,89 M (475 g/l) nikotinamid képződött, ami 97,3%-os hozamnak felel meg. Nikotinsav nem keletkezett.
3. példa
Amycolatopsis nemzetségbeli mikroorganizmusok azonosítása
Az alábbi 5 kemotaxonomikus marker támasztja alá az azonosítást
1. a peptidoglikán diagnosztikai aminosava: mezodiamino-pimelinsav,
2. diagnosztikai cukrok: arabinóz és galaktóz,
3. mikolsavak: nincsenek minolsavak,
4. menakinonok: MK-9 (H4),
5. zsírsavminta: izo/anteizo elágazódó és 2-hidroxizsírsavak, kis mennyiségű 10-metil-elágazódó zsírsavak. Ezt a zsírsavmintát az Amycolatopsis nemzetség összes képviselőjében találtuk (3f jelű zsírsavminta).
A fenti kémiai ismérvek kombinációja az Amycolatopsis nemzetség minden fajtájára jellemző.
A két tenyészet zsírsavadatait főkomponens-elemzés segítségével a zsírsavadatbank adataival vettettük egybe. Ezzel a módszerrel mind az NE31 törzset, mind az NA40 törzset sikerült hozzárendelni az Amycolatopsis nemzetséghez. Fajtaszinten azonban nem sikerült a további azonosítás, tekintettel arra, hogy a korrelációs tényező túl alacsony volt. A két törzs zsírsavmintájának összehasonlítása azt is mutatta, hogy a két törzs két különböző fajtához tartozik.
Az eredményt a 16S rDNS-szekvencia elemzése is alátámasztotta. Ezzel is az Amycolatopsis nemzetséghez lehetett hozzárendelni a két törzset, a már leírt Amycolatopsis fajtákhoz azonban nem. A 16S rDNSszekvenciát a PCR-amplifikált 16S rDNS-gén közvetlen szekvenálásával határoztuk meg. A 16S rDNS-szekvencia jellemző részét az Amycolatopsis nemzetség típusfajtáinak és hasonló taxonok szekvenciájával összehasonlítottuk. Az eredmény azt mutatta, hogy a törzs az Amycolatopsis nemzetséghez tartozik. A legnagyobb egybeesést, azaz 96,9%-ot (NA40), illetve 96,1 %-ot (NE31) az Amycolatopsis methanolica mutatta. A két izolátum szekvenciája 99,0%-ban egyezett egymással. Az Amycolatopsis nemzetség képviselőivel végzett vizsgálataink azt mutatta, hogy jó fajtaazonosításhoz a korrelációs tényezőnek 99,5%-nál nagyobbnak kell lennie. Tekintettel arra, hogy a 96,9% 99,5%-nál határozottan kisebb, abból indulhatunk ki, hogy a két izolátum egyike sem ismert Amycolatopsis fajta képviselője.
A fenti adatok alapján a két izolált törzset az ismert Amycolatopsis fajtákhoz hozzárendelni nem sikerült. Abból indulunk ki, hogy NA40 és NE31 két új, eddig le nem írt Amycolatopsis fajta törzsei.
Az Amycolatopsis nemzetségben mikroorganizmusok azonosítása
Levegőmicélium színe
Szubsztrátumban lévő micélium színe
Kidiffundált pigment színe
Cukorspektrum
ARA +
GÁL +
MAD
XYL
GLU v
RIB +
Típus A
DAP DL
Menakinonok (%-ban)
8/4
9/0 (+)
9/2 +
9/4 +++
9/6
9/8
16S rDNS-homológia >99,5%
Foszfolipidek
PE +
OH-PE + lizo-PE met-PE
PC
NPG
Pl +
PIM v
PG +
DPG +
GL
Típus ll+OH-PE
Zsírsavak izo 16 +++ izo 15 +
HU 226 274 Β1
| izo 17 | (+) |
| anteizo 15 | + |
| anteizo 17 | (+) |
| 10-Me 16 | (+) |
| 10-Me 17 | + 5 |
| 2-OH 15 | + |
| 2-OH 16 | + |
| Típus | 3f |
| MS | - |
| 10 | |
| 4. példa | |
| A NA40 mikroorganizmustörzsből nyert | |
| nitrilhidratáz tisztítása | |
| A törzset három napon át a 3. táblázat szerinti kő- | |
| zegben 37 °C-on tenyésztettük. | Két liter térfogatú te- 15 |
nyészet sejtjeit centrifugálással elkülönítettük, majd 0,85%-os NaCI-oldatban újraszuszpendáltuk. Utána a sejteket 44 mM n-vajsavat tartalmazó 0,1 mol-os kálium-foszfát-pufferbe (pH=7,0) vittük át, és a szuszpenziót ultrahanggal kezeltük. Centrifugálással a sejtkivo- 20 natot a sejttörmeléktől tisztítottuk, és a kapott extraktumot az enzimtisztításhoz használtuk. Az egész tisztítás alatt 44 mM n-vajsavat tartalmazó kálium-foszfát-puffert (pH=7,0) alkalmaztunk. A 10. táblázatból kivehetően az enzimet 3 lépésben homogenitásig tisztítottuk.
| Paraméter/lépés | Sejtmentes kivonat | DEAE- Sephacel | Phenyl- TOYO- PEARL |
| Összaktivitás (egységek) | 73 300 | 68 000 | 64 800 |
| összprotein (mg) | 1 020 | 110 | 61,4 |
| Paraméter/lépés | Sejtmentes kivonat | DEAE- Sephacel | Phenyl- TOYO- PEARL |
| Fajlagos aktivitás (egység/mg) | 71,9 | 620 | 1 105 |
| Dúsítás | 1 | 8,62 | 15,4 |
egység: az az enzimmennyiség, amely 20 °C-on 1 pmol nikotinamid/perc képződését katalizálja.
5. példa
A nitrilhldratáz jellemzése (1) A móltömegnek, alegységek szerkezetének és kobaltion-tartalomnak meghatározása
A móltömeget TSK-géloszlopon (G3000 SW, 0,75*60 cm) kromatográfiásan határoztuk meg 0,2 M kálium-kloridot és 44 mM n-vajsavat tartalmazó 0,1 M kálium-foszfát-puffer (pH=7,0) alkalmazásával. A móltömeg 106 kDa volt. Megállapítást nyert, hogy az enzim két különböző alegységből (a és β) áll, az egyiknek a móltömege 30 000, a másiké 26 000.
Az 1. ábra mutatja a móltömeg TSK-gél G3000 SW segítségével történő meghatározását.
A 2. ábra a móltömeg SDS-SPADE segítségével történő meghatározását szemlélteti.
A 3. ábra a tisztított enzim abszorpciós spektrumát mutatja. 300-400 nm-nél igen széles abszorpció tűnik fel.
(2) A tisztított enzim szubsztrátumfajlagossága
A szubsztrátumfajlagosságot a 2. példa 1. pontja szerint határoztuk meg. Az eredményeket a 11. táblázat mutatja.
11. táblázat
A tisztított nitrilhidratáz szubsztrátumfajlagossága
| Szubsztrátum | (M) | Összaktivitás (pmol/ml-perc) | Relatív aktivitás (%) | |
| enzimmel | nyugvó sejtekkel | |||
| 3-Ciano-piridin | 1,0 | 17,7 | 100 | 100 |
| 2-Ciano-piridin | 0,25 | 39,1 | 221 | 128 |
| 4-Ciano-piridin | 0,25 | 31,6 | 179 | 168 |
| Krotonitril | 0,4 | 11,9 | 67 | 52 |
| Benzonitril | 0,03 | 11,3 | 64 | 51 |
| Akrilnitril | 0,4 | 16,6 | 94 | 115 |
| o-Klór-benzonitril | 0,15 | 22,4 | 127 | 96 |
| m-Klór-benzonitril | 0,15 | 15,9 | 90 | 75 |
| p-Klór-benzonitril | 0,15 | 2,30 | 13 | 16 |
| 2-Klór-3-ciano-piridin | 0,15 | 16,0 | 90 | 126 |
| Acetonitril | 0,4 | - | - | - |
| Propionitril | 0,4 | 39,3 | 222 | 105 |
| Metakrilnitril | 0,4 | 22,1 | 125 | 130 |
| n-Butironitril | 0,4 | 17,9 | 101 | 194 |
A 2 ml-es reakcióelegyhez 1,7 egységnyi enzimet adtunk. A reakcióelegy az adott szubsztrátumot 45 mM foszfátpufferben (pH=7,0) tartalmazta.
HU 226 274 Β1
12. táblázat
Különböző inhibitorok hatása a tisztított enzimre (3) A KM-érték meghatározása
A KM-értéket a Lineweaver-Burk-diagram alapján határoztuk meg. 3-Ciano-piridin esetén 41,7 mM, akrilnitril esetében 3,7 mM adódott. A Rhodococcus rhodochrous J1 törzshöz viszonyítva (KM-érték 3-ciano-piridin esetében 200 mM) az NA40 KM-értéke lényegesen kisebb. Ez az NA40 egyik fő előnye.
(4) Hőstabilitás és hőmérsékleti optimum
A tisztított enzimet pH=7,0 mellett 30 percen át különböző hőmérsékleteken inkubáltuk, utána a 3-ciano-piridin->nikotinsavamid reakciót határoztuk meg 20 °C-on, 1 percen át. Az enzim 40 °C feletti hőmérsékleten Ínaktiválódott. A hőstabilitás határa - akár a nyugvó sejtek esetén is - kb. 40 °C volt. A hőmérsékleti optimum 35 °C és 40 °C közötti (5. ábra).
(5) pH-optimum és pH-stabilitás
A 3-ciano-piridin->nikotinsavamid reakciót végeztük 20 °C-on 2 ml-es reakcióelegyben, amely különböző puffért (42,5 mM), 1,71 egységnyi tisztított enzimet és 500 mM 3-ciano-piridint tartalmazott. A pH-optimum kb. pH=6,5±1,0 volt (8. ábra).
A pH-stabilitás meghatározására 4,2 egység tisztított enzimet 20 °C-on különböző pufferokkal (42,5 mM) 1 órán át inkubáltunk. Az inkubált oldat egy részét, 1,71 egységet a szabvány reakcióelegyhez (lásd 2. példa (1) pontja) adtuk. A maradék aktivitást meghatároztuk. Az enzim 5-9 közötti pH mellett stabil volt. Az eredményeket a 9. ábra mutatja.
(6) Inhibitorok
Különböző inhibitorok hatását vizsgáltuk. Az eredményeket a 12. táblázat mutatja.
| Inhibitor | mM | Relatív aktivitás (%) |
| - | 100 | |
| N-Etil-malein-imid | 1 | 97 |
| Jódecetsav | 1 | 39 |
| 4-Klór-merkuro-benzoesav | 0,1 | 69 |
| Nátrium-azid | 1 | 59 |
| Hidroxil-amin | 1 | 37 |
| Fenil-hidrazin | 1 | 8 |
| Szemikarbazin | 1 | 82 |
| Tiron(4,5-dihidroxi-1,3benzol-diszulfonsav dinátriumsója) | 1 | 110 |
| o-Fenantrolin | 1 | 89 |
| α,α'-Dipiridil | 1 | 100 |
| 8-Hidroxi-kinolin | 1 | 110 |
| EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav) | 1 | 115 |
| Dietil-ditiokarbamát | 1 | 89 |
6. példa
Metanol NA40 nyugvó sejtjeire gyakorolt hatása A reagáltatást 0-20 térfogat% metanol jelenlétében
10 percen át a 13. táblázat szerint végeztük. Ahogy a
14. táblázat mutatja, 5-15 térfogat% metanol adagolása az aktivitást fokozza.
13. táblázat
| Alkotó | Módszerek | ||||
| (1) | (2) | (3) | (4) | (5) | |
| 1,0 M 3-ciano-piridin | 1,0 ml | 1,0 ml | 1,0 ml | 1,0 ml | 1,0 ml |
| 0,1 Μ KPB* (pH=7,0) | 0,9 ml | 0,8 ml | 0,7 ml | 0,6 ml | 0,5 ml |
| Metanol | - | 0,1 ml | 0,2 ml | 0,3 ml | 0,4 ml |
| Sejtszuszpenzió (0,388 mg/ml) | 0,1 ml | 0,1 ml | 0,1 ml | 0,1 ml | 0,1 ml |
| össztérfogat | 2,0 ml | 2,0 ml | 2,0 ml | 2,0 ml | 2,0 ml |
*KPB=kálium-foszfát-puffer
14. táblázat
Metanol hatása Amycolatopsis NA40 aktivitására
| Módszer | Metanol (térfogat%) | Relatív aktivitás (%) |
| (1) | 0 | 100 |
| (2) | 5 | 123 |
| (3) | 10 | 128 |
| (4) | 15 | 130 |
| (5) | 20 | 105 |
7. példa
Rhodococcus nemzetségben mikroorganizmus feldúsítása
Különböző talajmintákhoz az 1. táblázat szerinti dúsítóközegben C- és N-forrás gyanánt ciano-ecetsavat adtunk, és az 1. példa szerint a Rhodococcus GF270, GF578, GF473 és GF376 mikroorganizmusokat izoláltuk.
8. példa
Rhodococcus nemzetségbeli mikroorganizmusokkal végrehajtott biotranszformálás
HU 226 274 Β1 (1) Rhodococcus GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF270 és Rhodococcus GF376 hőstabilitása a Rhodococcus rhodochrous J1 törzséhez viszonyítva
A hőstabilitás meghatározására a fent említett mikroorganizmusokat az alábbi közegekben tenyésztettük. Rhodococcus rhodochrous J1: az EP-A 0 307 926 leírásban megadott közegben, 72 órán át. A Rhodococcus GF674, GF578, GF270 és GF376 mikroorganizmusokat az alábbi közegekben pH=7,0 mellett akár 96 órán át tenyésztettük.
Rhodococcus GF674: 1,0 g/l élesztőkivonatot, 5,0 g/l fruktózt, 10,0 g/l malátakivonatot, 5,0 g/l acetamidot, 2,0 g/l KH2PO4-ot, 0,5 g/l MgSO4.7H2O-t és 10,0 mg/l COCI2.6H2O-t tartalmazó közegben.
Rhodococcus GF578: 1,0 g/l élesztőkivonatot, 15,0 g/l fruktózt, 10,0 g/l malátakivonatot, 25,0 g/l acetamidot, 2,0 g/l KH2PO4-ot, 0,5 g/l MgSO4.7H2O-t és 5,0 mg/l COCI2.6H2O-t tartalmazó közegben.
Rhodococcus GF270:12,5 g/l élesztőkivonatot, 5,0 g/l nátrium-citrátot, 7,5 g/l metakrilamidot, 2,0 g/l KH2PO4-ot, 0,5 g/l MgSO4.7H2O-t és 30,0 mg/l COCI2.6H2O-t tartalmazó közegben.
Rhodococcus GF376: 1,0 g/l élesztőkivonatot, 10,0 g/l nátrium-citrátot, 15,0 g/l malátakivonatot, 7,5 g/l butiramidot, 2,0 g/l KH2PO4-ot, 0,5 g/l MgSO4.7H2O-t és 15,0 mg/l COCI2.6H2O-t tartalmazó közegben.
A nyugvó sejteket különböző hőmérsékleteken 15 percen át inkubáltuk, utána a maradandó aktivitást a 2. példa (1) pontja szerinti szabvány reakciókörülmények között meghatároztuk.
Ennek során bebizonyosodott, hogy a Rhodococcus GF674 törzs relatív aktivitása 50 °C-on majdnem 100% volt, és 60 °C-on még mindig 10%. Rhodococcus GF578 50 °C-on szintén 100% relatív aktivitással rendelkezett, 60 °C-on még 20% volt az aktivitása. Rhodococcus GF376 relatív aktivitása 50 °C-ig 100% volt, 60 °C-on 70% és 70 °C-on még mindig közel 5%. Rhodococcus GF270 relatív aktivitása 60 °C-ig majdnem 100% volt, 70 °C-on az aktivitás még 5% volt. Ezekkel összehasonlítva Rhodococcus rhodochrous J1 relatív aktivitása 50 ’C-ig 100% volt, 60 ’C-on 80%, 70 ’C-on nulla.
Összefoglalva tehát megállapíthatjuk, hogy a Rhodococcus GF270 és GF376 törzsek hőstabilitása meghaladja a J1 törzs hőstabilitását, és a legjobb hőstabilitást a GF270 törzs mutatja.
A Rhodococcus törzsek pH-optimuma
A pH-értéknek a GF674, GF578, GF270 és GF376 Rhodococcus törzsek nitrilhidratáz-aktivitására gyakorolt befolyását a 2. példa (5) pontja szerint vizsgáltuk. Rhodococcus GF674 pH-optimuma pH=7,5-9,5; GF578: pH=8-8,5; GF270: pH=6-7,0 és GF376: pH=6-8.
A Rhodococcus törzsek szubsztrátumfajlagossága
A szubsztrátumfajlagosságot relatív aktivitásként a
15. táblázatban tüntettük fel.
(4) Nikotinamid felhalmozódása (Rhodococcus törzsek)
A 2. példa (6) pontja szerint eljárva a GF674, GF578, GF270 és GF376 Rhodococcus törzseket kb. 500 mM 3-ciano-piridinnel inkubáltuk. Ennek során Rhodococcus GF674 25 óra alatt 6 M, GF578 10 óra alatt 5,5 M, GF270 20 óra alatt mintegy 8,5 M és GF376 20 óra alatt 7,5 M nikotinamidot termelt.
(5) A Rhodococcus törzsek 3-ciano-piridin-tűrő képessége
Megvizsgálva azt, hogy milyen mértékben képesek a törzsek a 3-ciano-piridint tolerálni, nyugvó sejteket 20 ’C-on 15 percen át 1-10 vegyes% közötti különböző szubsztrátumkoncentrációk mellett inkubáltunk, majd a sejteket centrifugáltuk, 0,85%-os NaCI-oldattal mostuk, majd a megmaradt aktivitást mértük.
Megállapítást nyert, hogy 2 vegyes% szubsztrátumkoncentráció esetén a Rhodococcus rhodochrous J1 mikroorganizmus nitrilhidratáz-aktivitása 1,4 tényezővel, Rhodococcus GF674 nitrilhidratáz-aktivitása 4 vegyes% szubsztrátumkoncentráció esetén 1,4 tényezővel csökkent, Rhodococcus GF578 nitrilhidratázaktivitása 8 vegyes% szubsztrátumkoncentráció esetén majdnem állandó maradt, Rhodococcus GF270 nitrilhidratáz-aktivitása 4 vegyes% szubsztrátumkoncentráció esetén 1,17 tényezővel és Rhodococcus GF376 nitrilhidratáz-aktivitása 10 vegyes% szubsztrátumkoncentráció esetén 1,25 tényezővel csökkent.
A többi Rhodococcus törzzsel összehasonlítva a Rhodococcus rhodochrous J1 törzs a 3-ciano-piridint a legrosszabban tolerálta.
15. táblázat
Szubsztrátumfajlagosság, a törzsek relatív aktivitása %-ban
| Szubsztrátum | J1 | GF674 | GF578 | GF270 | GF376 |
| 3-Ciano-piridin | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2-Ciano-piridin | 45 | 308 | 200 | 15,7 | 54,3 |
| 4-Ciano-piridin | 70 | 231 | 167 | 55,6 | 79,8 |
| Benzonitril | 27 | 138 | 85,1 | 13,4 | 57,2 |
| 2-Klór-benzonitril | 2,8 | 64,8 | 49,0 | 0 | 0 |
| 3-Klór-benzonitril | 43 | 27,8 | 28,9 | 8,41 | 8,63 |
| 4-Klór-benzonitril | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Acetonitril | 608 | 1,49 | 347 | 659 | 806 |
| Propionitril | 434 | 274 | 132 | 37,3 | 245 |
HU 226 274 Β1
15. táblázat (folytatás)
| Szubsztrátum | J1 | GF674 | GF578 | GF270 | GF376 |
| n-Butironitril | 352 | 491 | 368 | 181 | 195 |
| Akrilnitril | 478 | 147 | 101 | 192 | 257 |
| Krotonitril | 78,2 | 98,0 | 124 | 37,1 | 110 |
| Metakrilnitril | 86,9 | 176 | 122 | 0 | 0 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (12)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Amycolatopsis vagy Actinomadura nemzetségbeli mikroorganizmusok, azzal jellemezve, hogy képesek nitrilt amiddé alakítani.
- 2. Az 1. igénypont szerinti mikroorganizmusokból nyert enzimkivonatok, azzal jellemezve, hogy nitrilhidratáz-aktivitással rendelkeznek.
- 3. Az 1. igénypont szerinti mikroorganizmusok Amycolatopsis NA40 és Amycolatopsis NE31 törzse, letétbe helyezve DSM 11617 és DSM 11616 szám alatt, valamint e mikroorganizmusok nitrilamiddá alakítására képes variánsai és mutánsai.
- 4. A Rhodococcus nemzetségbeli Rhodococcus GF270 és GF376 törzs, letétbe helyezve DSM 12211 és DSM 12175 szám alatt, valamint azok nitrilamiddá alakítására képes variánsai és mutánsai.
- 5. A 4. igénypont szerinti mikroorganizmusokból nyert enzimkivonatok, azzal jellemezve, hogy nitrilhidratáz-aktivitással rendelkeznek.
- 6. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti mikroorganizmusokból nyert enzim, azzal jellemezve, hogy nitrilhidratáz-aktivitással rendelkezik, ésa) pH-optimuma pH=6,5±1,0,b) hőmérséklet-optimuma pH=7,0 mellett 35-40 °C,c) 3-ciano-piridin-szubsztrátum mellett KM-értéke41,7 mM±7,7 mM.
- 7. Eljárás amidok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy nitrilt mint szubsztrátumot az 1., 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti mikroorganizmusokkal15 vagy e mikroorganizmusokból nyert enzimkivonattal, vagy a 6. igénypont szerinti enzimmel a megfelelő amiddá alakítunk.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nitrilként adott esetben szubsztítuált alifás,20 1-10 szénatomos nitrilt alkalmazunk.
- 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nitrilként adott esetben szubsztítuált, az aromás gyűrűrendszerben 4-
- 10 szénatomot tartalmazó aromás nitrilt alkalmazunk.25 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aromás nitrilként (I) vagy (II) általános képletű nitrilt alkalmazunk, amelyek képletébenR1 és R2 jelentése hidrogénatom, halogénatom vagy C1-C4-alkil-csoport.30
- 11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatást 0-50 °C-on, 4,5-10 pH mellett valósítjuk meg.
- 12. A 7-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatást Amycolatopsis35 NA40 (DSMZ 11617) vagy Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) mikroorganizmusokkal, vagy ezek nitrilamiddá alakítására szintén képes variánsaival és mutánsaival végezzük.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH177697 | 1997-07-22 | ||
| CH262997 | 1997-11-17 | ||
| CH81598 | 1998-04-06 | ||
| PCT/EP1998/004587 WO1999005306A1 (de) | 1997-07-22 | 1998-07-22 | Verfahren zur herstellung von amiden |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0003069A2 HUP0003069A2 (hu) | 2000-12-28 |
| HUP0003069A3 HUP0003069A3 (en) | 2003-07-28 |
| HU226274B1 true HU226274B1 (en) | 2008-07-28 |
Family
ID=27172439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0003069A HU226274B1 (en) | 1997-07-22 | 1998-07-22 | Process for preparing amides |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US6444451B1 (hu) |
| EP (1) | EP1002122B1 (hu) |
| JP (1) | JP4302876B2 (hu) |
| KR (1) | KR100517776B1 (hu) |
| CN (2) | CN1108372C (hu) |
| AT (1) | ATE234932T1 (hu) |
| AU (1) | AU8978398A (hu) |
| CA (1) | CA2294621C (hu) |
| CZ (1) | CZ299166B6 (hu) |
| DE (1) | DE59807569D1 (hu) |
| DK (1) | DK1002122T3 (hu) |
| EA (2) | EA006444B1 (hu) |
| ES (1) | ES2190098T3 (hu) |
| HU (1) | HU226274B1 (hu) |
| IL (1) | IL133754A0 (hu) |
| MX (1) | MX215285B (hu) |
| NO (1) | NO319663B1 (hu) |
| PL (1) | PL194729B1 (hu) |
| PT (1) | PT1002122E (hu) |
| SK (1) | SK283395B6 (hu) |
| TR (1) | TR200000150T2 (hu) |
| UA (1) | UA83654C2 (hu) |
| WO (1) | WO1999005306A1 (hu) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2190098T3 (es) | 1997-07-22 | 2003-07-16 | Lonza Ag | Procedimiento para la preparacion de amidas. |
| BR0109480B1 (pt) * | 2000-03-21 | 2014-03-18 | Mitsubishi Rayon Co | Método de cultivo de microorganismo |
| AU2002228036A1 (en) * | 2001-01-09 | 2002-07-24 | Lonza Ag | Microbiological method for producing amides |
| CN101735961B (zh) * | 2008-11-21 | 2012-06-06 | 华东理工大学 | 一种放线菌菌株及其在制备芳香羟胺中的应用 |
| IT1400395B1 (it) | 2010-06-08 | 2013-05-31 | Procos Spa | Processo one-pot per la sintesi di dalfampridine. |
| CN115044501B (zh) * | 2022-05-27 | 2023-08-25 | 湖南大学 | 促进植物生长的内生稀有放线菌及其用途 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5937951B2 (ja) | 1981-11-18 | 1984-09-12 | 秀明 山田 | アミドの生物学的製造法 |
| US4629700A (en) | 1983-11-30 | 1986-12-16 | Standard Oil Company (Indiana) | Selective conversion of cyano compounds to amides and carboxylic acids |
| US5179014A (en) * | 1985-01-08 | 1993-01-12 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Process for the preparation of amides using microorganisms |
| JPS61162193A (ja) * | 1985-01-08 | 1986-07-22 | Nitto Chem Ind Co Ltd | 微生物によるアミド類の製造法 |
| JPH0797482B2 (ja) * | 1985-03-29 | 1995-10-18 | 株式会社東芝 | カラ−受像管 |
| US5200331A (en) * | 1985-06-04 | 1993-04-06 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method of producing an amide utilizing a microorganism |
| JPS62259586A (ja) | 1986-05-02 | 1987-11-11 | Nitto Chem Ind Co Ltd | ニトリル水和活性の保持方法 |
| JPS62257386A (ja) | 1986-05-02 | 1987-11-09 | Nitto Chem Ind Co Ltd | ニトリル水和活性の保持方法 |
| US5206158A (en) * | 1986-07-02 | 1993-04-27 | Gist-Brocades N.V. | Process for the preparation of difluorobenzamide |
| US4800162A (en) | 1987-04-01 | 1989-01-24 | Sepracor, Inc. | Method for resolution of steroisomers in multiphase and extractive membrane reactors |
| MX169933B (es) * | 1987-09-18 | 1993-08-02 | Hideaki Yamada | Procedimiento para la produccion biologica de amidas |
| US5283193A (en) | 1988-06-27 | 1994-02-01 | Asahi Kasei Kogyo K.K. | Process for producing optically active α-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefor |
| CZ280901B6 (cs) | 1988-10-06 | 1996-05-15 | Hideaki Yamada | Způsob kultivace bakterií |
| US5648256A (en) * | 1990-02-28 | 1997-07-15 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant |
| US5618710A (en) | 1990-08-03 | 1997-04-08 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | Crosslinked enzyme crystals |
| US5593871A (en) * | 1990-09-20 | 1997-01-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for the preparation of enantiometric 2-alkanoic acid amides from nitriles |
| JPH05284982A (ja) * | 1992-04-08 | 1993-11-02 | Japan Energy Corp | 微生物によるラセミ化２−アミノニトリルの製造法 |
| AU3692593A (en) | 1992-04-28 | 1993-11-04 | Mitsubishi Kasei Corporation | Novel protein having nitrile hydratase activity and the gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene |
| RU2053300C1 (ru) * | 1993-12-17 | 1996-01-27 | Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы |
| EP0773297B2 (en) | 1995-11-10 | 2008-04-23 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Process for producing alpha-hydroxy acid or alpha-hydroxyamide by microorganism |
| ES2190098T3 (es) * | 1997-07-22 | 2003-07-16 | Lonza Ag | Procedimiento para la preparacion de amidas. |
-
1998
- 1998-07-22 ES ES98941398T patent/ES2190098T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-22 EA EA200000135A patent/EA006444B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 SK SK19-2000A patent/SK283395B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 AT AT98941398T patent/ATE234932T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 TR TR2000/00150T patent/TR200000150T2/xx unknown
- 1998-07-22 WO PCT/EP1998/004587 patent/WO1999005306A1/de active IP Right Grant
- 1998-07-22 IL IL13375498A patent/IL133754A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 US US09/463,203 patent/US6444451B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-22 DK DK98941398T patent/DK1002122T3/da active
- 1998-07-22 JP JP2000504275A patent/JP4302876B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-22 UA UAA200508810A patent/UA83654C2/ru unknown
- 1998-07-22 EP EP98941398A patent/EP1002122B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-22 AU AU89783/98A patent/AU8978398A/en not_active Abandoned
- 1998-07-22 CN CN98807505A patent/CN1108372C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-22 EA EA200500335A patent/EA009075B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 CA CA002294621A patent/CA2294621C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-22 CN CNB03120113XA patent/CN1269950C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-22 DE DE59807569T patent/DE59807569D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-22 KR KR10-2000-7000642A patent/KR100517776B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 CZ CZ20000153A patent/CZ299166B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 PT PT98941398T patent/PT1002122E/pt unknown
- 1998-07-22 HU HU0003069A patent/HU226274B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-07-22 PL PL98338249A patent/PL194729B1/pl unknown
-
1999
- 1999-12-22 NO NO19996401A patent/NO319663B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-01-11 MX MXPA/A/2000/000440 patent/MX215285B/es not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-09-03 US US10/234,088 patent/US7105322B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-07-28 US US11/495,035 patent/US7741097B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-10-31 US US11/931,500 patent/US7556956B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-31 US US11/931,639 patent/US7666635B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-31 US US11/931,719 patent/US7595178B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1298222C (en) | Process for biological production of amides | |
| US5089411A (en) | Method of culturing a strain of rhodococcus rhodochrous having nitrile hydratase activity | |
| US7556956B2 (en) | Enzymes for the preparation of amides | |
| JP4941990B2 (ja) | Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ | |
| HU216652B (hu) | Eljárás amidszármazékok előállítására mikroorganizmusok felhasználásával | |
| MXPA00000440A (es) | Procedimiento para la preparacion de amidas | |
| EP0334358B1 (en) | Novel D-amidase and process for producing D-alpha-alanine and/or L-alpha-alanineamide | |
| PT1352050E (pt) | Processo microbiológico para a produção de amidas | |
| US4621057A (en) | N-acetylhexosamine oxidase and process for producing the same | |
| JPH02234678A (ja) | アミノ酸アミド加水分解酵素及びその使用 | |
| JP5096911B2 (ja) | ５−置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ−カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法 | |
| HU201515B (en) | Process for producing 2,6-difluorobenzamide by microbial hydrolysis and method of producing the microorganism culture applicable in the process | |
| JPH04360689A (ja) | ４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸の製造法 | |
| UA74768C2 (en) | Method for preparing amides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |