MXPA00000440A - Procedimiento para la preparacion de amidas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un nuevo proceso biotecnológico para la preparación de nitrilos a partir de amidas. Para este procedimiento se emplean microorganismos del género Amycolatopsis, Actinomadura o Rhodococcus.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE AMIDAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN L-a. i?ieac ó?i s«= xe?iere a nuevos microorganismos del genero Actinomadura, Amycolatopsis o Rhodococcus, y un nuevo proceso para la preparación de amidas usando esos mocroorganismos o usando extractos enzimáticos de esos microorganismos . Para amidas tales como por ejemplo nicotinamida, una vitamina del complejo B que es esencial para los animales y el hombre, un numero de procesos biotecnológicos ya son conocidos . Generalmente se sabe que los microorganismos que contienen hidratasa de nitrilo convierten los nitrilos a las amidas correspondientes. Asi la EP-A- 0 188 316 describe un proceso para la preparación de nicotinamida a partir de 3-cianopiridina usando microorganismos del genero Rhodococcus, Arthobacter o Microbacterium. Una desventaja de ese proceso es que esos microorganismos solo tienen baja actividad para la conversión de 3-cianopiridina a nicotinamida. EP-A-O 307 926 describe la conversión de 3-ciano-priridina a nicotinamida por medio de microorganismos de las especies Rhodococcus rhodochrous Jl . Con el fin de que esos microorganismos catalicen la conversión deseada, deben ser inducidos . Otra desventaja de este proceso es que Rhodococcus REF.: 32430 rhodochrous Jl tiene color rojo y de acuerdo con esto puede presentarse una decoloración del producto. Además este microorganismo tiene una baja estabilidad térmica y es inhibido por ejemplo por el substrato 3-ciano-piridina. Otro proceso para la preparación de nicotinamida a partir de 3-cianopiridina por medio de microorganismos de la especie Rhodococcus rhodochrous Jl se describe en EP-A-O 362 829. Con el fin de aumentar la actividad especifica de los microorganismos que contienen hidratasa de nitrilo, se agrega urea o un derivado de urea se agrego al medio de cultivo como inductor. Como en el proceso descrito antes, una decoloración del producto también tiene lugar en este proceso . Además, 095/17 505 describe un proceso para la preparación de amidas aromáticas a partir de los nitrilos correspondientes por medio de microorganismos de la especie Rhodococcus rhodochrous M33. Una desventaja de este proceso en la coloración roja de Rhodococcus rhodochrous M323 y también el alto valor K„ para el substrato 3-cianopiridina. El objeto de la presente invención fue el de eliminar esas desventajas y proporcionar un proceso para la preparación de amidas en el cual las amidas correspondientes puedan aislarse con buenos rendimientos y pureza. Este objeto de logra por medio de los microorganismos nuevos de acuerdo con las reivindicaciones 1 3, y por el proceso de acuerdo con la reivindicación 6.

De acuerdo con la invención, el proceso se realiza al convertir un nitrilo, como substrato, a la amida correspondientes por medio de microorganismos del genero Actnomadura, Amycolatopsis o Rhodococcus, usando un extracto enzimático de esos microorganismos o por medio de hidratasa de nitrilo purificadas de microorganismos del genero Amycolatopsis o Actinomadura. Los nitrilos empleados para la biotransformación tal como por ejemplo 3-cianopiridina son compuestos comerciales . Los microorganismos de acuerdo con la invención pueden convertir nitrilos como substratos en las amidas correspondientes . Preferentemente esos microorganismos tienen la capacidad de crecer en los nitrilos o amidas como la única fuente de C y/o N. Los microorganismos de acuerdo con la invención son obtenibles por medio de la selección adecuado, por ejemplo de muestras de terreno, barro o aguas de desecho con la ayuda de técnicas microbiológicas habituales . A continuación los microorganismos se seleccionan para crecer con nitrilos o amidas como preferentemente la única fuente de C y N en la presencia de iones de cobalto. Nitrilos y amidas adecuadas para la selección son en particular los nitrilos también empleados como substratos en la ultima biotransformación y las amidas correspondientes obtenibles de ellas. Medios de cultivo adecuados son igualmente conocidos a los expertos en la técnica, por ejemplo puede usarse el medio descrito en la tabla i. Habitualmente, los microorganismos son cultivados de la misma manera aun antes de la biotransformación real se usan los medios antes mencionados . Como se sabe en la técnica, una hidratasa de nitrilo solo se forma cuando el medio de cultivo contiene iones de cobalto como cofactor. "Compuestos de cobalto adecuados que generen iones de cobalto" son sales C02+ o C03+ .

Ejemplos de sales C02+ o C03+ son cloruros de cobalto, sulfatos de cobalto y acetatos de cobalto. Ventajosamente el compuesto de cobalto empleado es una sal de C02+ tal como por ejemplo CoCl2. El crecimiento sin embargo puede realizarse también en la presencia de vitamina B12 junto con cobalto metálico u otros compuestos de cobalto que generen un ion de cobalto in situ. Ventajosamente, el compuesto de cobalto se emplea en una cantidad de 1 a 10 g/l# preferentemente de 1 a 3 mg/1. Habitualmente, el crecimiento se realiza a una temperatura de 20 a 50°C a un pH entre pH 5 y 8, preferentemente de 30 a 45°C y entre pH 5.5. y pH 7.5. La biotransformación real puede realizarse usando microorganismos del genero Actinomadura, Amycolatopsis usando in extracto enzimático de esos microorganismos o por medio de hidratasa de nitrilo purificada de esos microorganismos . ventajosamente la biotransformación se realiza usando microorganismos de la especie Actinomadura spadix, por ejemplo los aislados de Actinomadura spadix E3733, Actinomadura spadix E3736, Actinomadura spadix 45A32, Actinomadura spadix 4501 o Actinomadura spadix C15. La biotransformacion se realiza preferentemente usando microorganismos correspondientes a las especies Amycolatopsis NE 31 y Amycolatopsis NA 40 o sus variantes funcionalmente equivalentes y, mutantes. De manera particularmente preferida se emplean los microorganismos que corresponden a la especie Amycolatopsis NA40 . Los microorganismos de la especie mencionada se depositaron el 03.06.1997 en la Colección Alemania de Microorganismos Cultivos Celulares S.R.L. (Deutschen Samlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH] , Mascheroder eg Ib, D-38124 Braunschweig bajo la designación Amyucolatopsis NE 31 y Amycolatopsis NA40 de acuerdo con la convención de Budapest y tiene los números de deposito DSMZ 11616 y DSMZ 11617 respectivamente. Esos dos microorganismos han sido identificados mas precisamente y han de asignarse a especies del genero Amycolatopsis que han no han sido descritos en la literatura. De acuerdo con esto la invención también se refiere a microorganismos del genero Amycolatopsis o Actinomadura que son capaces de convertir amidas en nitrilos, en particular microorganismos de la designación Amycolatopsis NA40 DSMZ 11617) y Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) . Además ha sido encontrado que microorganismos específicos del genero rhodococcus tienen mejores propiedades para la conversión de nitrilos a amidas que el Rhodococcus rhodochorous Jl descrito en EP-A-O 362 829. Esos microorganismos son Rhodococcus GF6754, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF270 (DSMZ 12211) y Rhodococcus GF376 (DSMZ 12175) o sus variantes y mutantes funcionalmente equivalentes. El microorganismo DSMZ 12175 fue depositado el 15.5.1998 y el microorganismo DSMZ 12211 el 8.6.1998 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, de acuerdo con la Convención de Budapest . Las cepas de Rhodococcus GF270, GF376, GF473, GF578 y GF674 han sido asignadas de acuerdo con la identificación a las especies del genero Rhodococcus que aun no han sido descritas en la literatura. De acuerdo con esto la invención también se refiere a los microorganismos Rhodococcus GF270, Rhodoccoccus GF376, Rhodococcus GF473, Rhodococcus GF578 y Rhodococcus GF674. Contrariamente a los microorganismos del genero Actinomadura o Amycolatopsis, los microorganismos del genero Rhodococcus se inducen ventajosamente antes de la conversión real . Inductores adicionales son aquellos descritos en EP-A-O 307 926, tal como por ejemplo acetamida, butiramida, metacirlamida, propoinamida, crotonamida y valera ida. Como variantes y mutantes funcionalmente equivalentes se implica aquellos microorganismos que se derivan de los organismos fuente antes mencionados y esencialmente tienen las mismas características y funciones que esos. Las variantes y mutantes de este tipo pueden formarse fortuitamente por ejemplo por medio de irradiación UV o químicos mutagénicos . Identificación de Aprycolatopsis NA40 Color del micelio aereo blanco color del substrato del micelio naranja Color del pigmento difuso Espectro de azucares RA + GAL + MAD XYL GLU tr RIB + Tipo A DAP DL Menaquinonas (en %) 9/4 +++ 9/6 9/8 Homología a 16S rADN 96.9% Fosfolípidos tales como no investigado PE, OH-PE, liso PE, met PE, PC, NPG, Pl, PIM, PG, DPG, GL cidos grasos iso 16 +++ iso 15 + iso 17 ( +) anteiso 15 ( +) anteiso 17 ( +) -Me 16 10-Me 17 + 2-OH 15 + 2-OH 16 + Tipo 3f MS Identificación de Amycolatopsis NE31 Color del micelio aereo blanco Color del substrato del micelio naranja Color del pigmento difuso Espectro de azucares ARA + GAL + MAD XYL GLU tr RIB + Tipo A DAP DL Menaquinonas (en %) 8/4 9/0 ( +) 9/2 9/4 +++ 9/6 9/8 Homología a 16S rADN 96.1% Fosfolípidos tales como no investigado PE, OH-PE, liso PE, met PE, PC, NPG, Pl, PIM, PG, DPG, GL Ácidos grasos iso 16 +++ iso 15 + iso 17 ( +) anteiso 15 (+) anteiso 17 (+) 10-Me 16 10-Me 17 + 2-OH 15 + 2-OH 16 + Tipo 3f MS Abreviaciones y explicaciones para la identificación (+) 1-5% + 5-15% ++ 15-30% +++ >30% DAP ácido diaminopimélico ARA arabinosa GAL galactosa MAD adurosa XYL xilosa GLU glucosa RIB ribosa Tipos de azucares de acuerdo con Lechevalier et al. 1971.

Tipos de ácidos grasos de acuerdo con Kroppenstedt 1985 -y 1992. 9/4 MK-9 (H 9/6 MK-9 (H6) 9/8 MK-9 (H8 ) MS ácidos mucólicos PE fosfatidiletanolamina OH-PE hidroxi -PE met PE fosfatidimetiletanola ina PC fosfatidilcolina NPG fosfatidilglucosamina Pl fosfatidilinositol PIM manosida de fosfatidilinositol PG fosfatidilglicerol DPG disfosfatidilglicerol GL glicolipidos Ácidos grasos iso-16 ácidos isohexadecanóicos o ácidos 14-metilpentadecanóicos 10-Me-18 ácido tuberculoesteárico 2-OH-16 ácido 2-hidroxipalmítico Identificación de GF270, GF376, GF473, GF578 y GF674 La identificación de esas cepas se basa en 5 características que son independientes entre si . 1. Morfología y color de las colonias: hifas cortas ramificadas, que se desintegran en elementos en forma de barras y esporas. Las colonias de GF270 y GF 376 son color rosa salmón (RAL 3022) y aquellas de GF578 y GF674 son rojo claro (RAL 3012) . Ácidos diamino de peptidoglicano: ácido meso-diaminopimélico Ácidos icólicos: ácidos micólicos de Rhodococcus; la determinación del ácido micólico de cadena larga se realizo por medio de cromatografía de gases de alta temperatura. Los perfiles de elución de los ácidos micolicos de GF270 y GF376 y aquellos de GF473, GF578 y GF 674 fueron idénticos. La longitud de ácido micolico para GF270 y GF376 fue de C38-C46 y la de GF473, GF578 y GF674 fue de C40-C4ß. Los modelos de ácido micolico se compararon con los modelos de ácido micolico de las cepas de Rhodococcus GF270 se identifico con un factor de correlación muy bajo (0.086) como perteneciente a Rhodococcus rhodochrous; no fue posible identificar GF376 por este método. Los otros tres aislados GF473, GF578 y GF674 se identificaron con un factor de correlación muy bajo como perteneciente a Rhodococcus ruber . Modelo de ácido graso: ácidos grasos no ramificado, saturados e insaturados incluyendo ácido tuberculoesteárico. El modelo de ácido graso es el diagnostico de todos los géneros de Rhodococcus y las especies muy relacionadas Mycobacterium, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella y algunas de Corynebacteria . La identificación a nivel de especie se obtuvo por medio de las diferencias cualitativas y cuantitativas en los modelos de ácidos grasos de GF270, GF376, GF473, GF578 y GF674 con los modelos de ácido graso de especies de Rhodococcus . 5. Las subsecuencias de rADN 16S de GF 270 y GF376 fueron idénticas (100%) , aunque la comparación de ellas con las cepas de Rhodcoccus solo mostró un 99.1% de similaridad a Rhodococcus rhodochrous cercanamente relacionada, GF473 y GF578 fueron idénticas en sus secuencia de rADN 16S (100%) , GF674 difiere de GF578 solo en un par de bases de 500 (99.8%). Los tres aislados muestran solo una relación distante con Rhodococcus coprophilus (98.4%) . En base a los resultados de biología quemotáxica y molecular, puede concluirse que FF270 y GF376 por un lado y GF473, GF578 y GF674 por el otro lado son cepas de 2 nuevas especies de Rhodococcus. GF270 y GF376 están cercanamente relacionadas a Rhodococcus rhodochrous en su rADN 16S (99.1%), sin embargo GF473, GF578 y GF674 solo están distantemente relacionadas a Rhodococcus corpophilus (98.4%). El extracto enzimático puede obtenerse por medio de rompimiento profesionalmente habitual de los microorganismos, tal como por ejemplo ruptura por medio de ultrasonido, por medio de prensa francesa o por lisoziraas . Este extracto enzimático, y claro todas las células de microorganismos pueden inmovilizarse en un material de soporte adecuado, habitualmente atrapadas en un polímero, para realizar el proceso, o absorbidas en un material de soporte adecuado. Las enzimas de acuerdo con la invención que tienen actividad de hidratasa de nitrilo pueden obtenerse a partir de microorganismos del genero Amycolatopsis y son capaces de convertir un nitrilo en- una amida, en particular son obtenibles a partir de NA40 (DSMZ 11617) . Esas enzimas en particular tienen las siguientes propiedades : a) un pH óptimo de 6.5 + 1.0 b) una temperatura óptima ente 35 a 4 °C y un pH de 7.0 c) un valor KH para el substrato de 2-cianopiridina de 41.7 mM ±7.7 mM (20°C, 45 mM de amortiguador de fosfato, pH 7.0) . en particular las enzimas tienen un d) peso molecular de 106 kDa, determinado por ejemplo por medio de SDS-PAGE. Nitrilos pueden emplearse generalmente como substrato para la biotransformacion. Ventajosamente, se utiliza cualquier nitrilo alifático que tenga de 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente substituido por ejemplo por hidroxilo, amino, halógeno o carboxilo o nitrilos aromáticos substituidos o insubstituidos con de 4 a 10 átomos de carbono en el sistema de anillo aromático. Los nitrilos aromáticos que tienen de l a 10 átomos de carbono que pueden usarse son nitrilos, hidroxinitrilo, aminonitrilos tales como por ejemplo n-octanonitrilo, ácido cianoacético, isocapronitrilo, n-valeronitrilo, adiponitrilo, glutaronitrilo , succiononitrilo, sebaconitrilo, porpionitrilo, cronononitrilo, acrilonitrilo, metacrilonitrilo, n-butironitrilo o azelanitrilo. Nitrilos aromáticos con de 4 a 10 átomos de carbono que pueden usarse son los nitrilos de la formula general en la cual R1 y R2 son un átomo de hidrógeno, de halógeno o alquilo con de 1 a 4 átomos de carbono. Como átomo de halógeno se puede usar F, Cl, Br o I . Como alquilo con de 1 a 4 átomos de carbono se pueden usar metilo, etilo, propilo, isopropilo, tere. -propilo, butilo, isobutilo o tere. -butilo pueden usarse como alquilo con de 1 a 4 átomos de carbono . Representantes ventajosos de los nitrilos aromáticos de la formula general I o II son 2-, 3- o 4-cianopiridina, benzonitrlo, fluoro-, cloro- o bromobenzonitrilo, tal como por ejemplo o-, - o p-clorobenzonitrilo o 2-cloro-3-cianopiridina. 3-cianopiridina se usa preferentemente como nitrilo aromático que tiene de 4 a 10 átomos de carbono. La biotransformacion se realza ventajosamente con a adición de substrato en una porción o continuamente de tal forma que la concentración del substrato no excede 40% en peso, preferentemente 30% en peso. El proceso se realiza ventajosamente con células en reposo (sin crecimiento) . Medios adecuados para la biotransformacion son aquello habituales en la técnica, tal como por ejemplo amortiguadores de fosfato de bajo peso molecular, amortiguadores HEPES, amortiguadores de citrato, amortiguadores de borato, los medios de acuerdo con las tablas 1 a 3, o formas modificadas de los mismos, tal como por ejemplo, aquellos descritos en el ejemplo 8 (1) o amortiguadores TRIS/HC1. La biotransformacion se realiza ventajosamente a una temperatura de 0 a 50°C y a un pH entre 4.5 y 10, preferentemente a una temperatura de 20 a 40°C, y a un pH entre 4.5 y 10.0. En una modalidad particularmente preferida, la biotransformacion puede realizarse ene la presencia de alcoholes con de 1 a 4 átomos de carbono, como alcoholes con de 1 a 4 átomos de carbono, se pueden utilizar metanol, etanol, propanol o butanol. Se prefiere usar metanol. Después de la reacción, pueden aislarse las amidas correspondientes por medio de métodos de elaboración habituales tal como por ejemplos por cristalización. EJEMPLOS Ejemplo 1 Cultivo de microorganismos del genero Actinomadura o Amycolatopsis a) Se cultivaron varias muestras de terreno con diferentes nitrilos o amidas como fuente de C y N en medio de enriquecimiento de acuerdo con la tabla 1 y se encubaran a 37°C o 45°C durante 4-7 días. El cultivo entonces se transfirió al mismo medio y otra vez se cultivo a 37°C durante 7-10 días. Todo el proceso se repitió 3 veces.

Los cultivos se diluyeron y trasplantaron con el fin de obtener colonias individuales . Las placas se encubaran durante 5 días a 37°. Se examino la actividad deseada de las diferentes colonias . Se aislaron Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) y Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) de esta manera y luego se cautivaron en el medio optimizado (tabla 3) durante 90-100 horas agitando a 37°C. Adiponitrilo sirio como fuente de C y N para Amycolatopsis NE31 (dsmz 11616) , Actinomadura spadix E3733 y Actinomadura spadix E3736, acelanitrilo sirvió como fuente de C y N para Amycolatopsis NA40 8DSMZ 11617) y Actinomadura spadix 45A32, n-octanontrilo sirvió como fuente de C y N para Actinomadura spadix 4501 y ácido cianoacético sirvió como fuente de C y N para Actinomadura spadix C15. b) Se cultivo Amycolatopsis NA40 en el medio de acuerdo con la tabla 3. El cultivo se realizo durante 2 o 3 a 4 días a una temperatura de 37°C bajo condiciones aerobicas en subcultivos (4 ml/tubo) y en un "cultivo principal" (500 ml/matraz) . El crecimiento celular se midió turbimétricamente a 610 n, y el peso seco de las células se calculo de la siguiente manera: peso de las células secas en mg/ml = OD610 nm x 0.277. Tabla 1 Medio de enriquecimiento Nitrilo 2.0 g KH2P04 7.0 g MgS04.7H20 0.1 g mezcla de vitaminas 1.0 mg CoCl2.6H20 2.0 mg FeSO, .7H,0 2.0 mg diluir a l l con agua (pH 6.7-7.3) Tabla 2 Medio basal Maltosa 2.0 g NaN03 1.0 g KH2P04 0.1 g MgSO, . 1E2Q_ 0-05g diluir a 100 ml con agua (pH 7.0) Tabla 3 Medio optimizado D-glucosa 4 .5 g Extracto de carne 0 . 5 g KH2P04 0 . 1 g MgS04 . 7H20 0 . 05g CoCl, . 6H,0 1 . 0 ms diluir a 100 ml con agua (pH 7.0) Ejemplo 2 Biotransformaciones con microorganismos del genero Actinomadura o Amycolatopsis (1) Para la determinación de la actividad de hidratasa de nitrilo, una mezcla de reacción (2 ml) que contiene 3- cianopiridina (1.0 M, 1.0 ml) , amortiguador de fosfato de potasio (pH 7.0, 0.1 M, 0.5 ml) y 0.5 ml de suspensión celular se encubaran a 20°C durante 30 minutos con agitación. La reacción se detuvo por la adición de 0.2 ml de HCl 3N. Después de centrifugar brevemente, la nicotinamida formada se determino por medio de HPLC (sistema Shimadzu SPF usando una columna C18 (Develosil 0DS-HG-5, 4.6x250 cm) , eluyente: lOM KH2P04/H3P04 (pH 2.8)/ acetonitrilo 9:1 (v/v); tasa de flujo: 1 ml/min; la absorción de midió a 230 nm) . La actividad especifica se expresó como µmol de nicotinamida formada/ml/min/ODe?o nm. Las tasas de reacción de los nitrilos alifáticos en el medio de enriquecimiento (Tabla 1) con bacterias aisladas se resume en la tabla 5, el efecto de los inductores y cofactores en el medio basal (tabla 2) se resume en la tabla 4 y la comparación de actividad de Amycolatopsis a Rhodococcus en el medio basal (tabla 2) se resume en la tabla 6. Los resultados de la tabla 4 muestran que la hidratasa de nitrilo de Amycolatopsis NA40 se expresa constitutivamente pero el cofactor cobalto es necesario para la actividad. (2) Efecto de la temperatura sobre el crecimiento de NA40 Se incubaron subcultivos (2ml) a 37°C durante 2 días en el medio de acuerdo con la tabla 3 , y luego se transfirieron a matraces agitadores que contenían 20 ml del medio de acuerdo con la tabla 3. El cultivo se realizo a 37, 40, 45, 50 y 55°C durante 3 a 4 días con agitación. El crecimiento celular se midió y la actividad de hidratasa de nitrilo se determino a 20°C. La tabla 7 muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad de hidratasa de nitrilo y sobre el crecimiento celular Tabla 4 Efectos de los inductores y cofactores sobre la actividad especifica en el medio basal Tabla 5 Tasa de conversión de los nitrílos alifáticos usando la bacteria aislada Cepa Substratos Crecimiento Actividad Actividad total específica (OD610 MN) (µmol/ml/min) (µmol/ml/min) Amicolaptosis NE31 (DSMZ 11616) Adiponitrilo 2.68 0.377 0.141 Actinomadura spadix E3733 Adiponitrilo 1.62 0.347 0.214 Actinomadura spadix E3736 Adiponitrilo 1.36 3.00 2.21 Actinomadura spadix 45A32 Azelanitrilo 5.81 18.80 3.23 B Actinomadura spadix 4501 n-octano- nitrilo 7.24 32.20 4.45 Actinomadura spadix C15 Acido cianoacetico 2.04 7.01 3.43 Amicolaptosis NA40 (DSMZ116117) Azelanitrilo 5.92 33.00 5.57 Tabla 6 Actividad de Amycolatopsis en comparación a Rhodococcus rhodochrous Jl Microorganismo Microorganismo Amycolatopsis Rhodococcus NA40 (DSZM 11617) rhodochrous Jl (µmol/ml/min) Actividad para 3- 303 314 cianopiridina Enzima purificada Enzima purificada de NA40 de Jl (µmol/min/mg (µmol/min/mg proteína) proteína) Actividad para 3- 1110 371 cianopiridina (3) Para la determinación de la actividad de NA40 con respecto a un numero de substratos, las células que tienen uñ peso seco de 0.0388 mg se encubaran en el amortiguador descrito antes . La reacción se inicio por medio de la adición del substrato adecuado y se incuba s 20°C con agitación durante 10 minutos. La reacción se detuvo por medio de la adición de 0.2 ml de HCl 2N y la mezcla de reacción se centrífugo brevemente. La nata se analizo por medio de HPLC o cromatografía de haces . La tabla 8 muestra las condiciones de prueba para la especificidad del substrato y la tabla 9 muestra la especificidad del substrato de las células NA40 en reposo para varios substratos . Las condiciones de prueba respectivas se resumen en la tabla 8 y los resultados se resumen en la tabla 9. Tabla 7 efecto de la temperatura de crecimiento sobre la actividad de hidratasa de nitrilo y sobre el crecimiento celular Tabla 8 Condiciones de prueba para la especificidad del substrato Substrato Substrato Método Amida formada mM de análisis 3-cianopiridina 1.0 HPLC nicotinamida 2-cianopiridina 0.25 HPLC 2-picolinamida 4-cianopiridina 0.25 HPLC piridino-4- carboxamida crotononitrilo 0.4 HPLC crotonamida Benzonitrilo 0.03 HPLC benzamida Acrilonitrilo 0.4 HPLC acrilamida o-clorobenzonitrilo 0.15 HPLC o-clorobenzamida m-clorobenzonitrilo 0.15 HPLC m-clorobenzamida p-clorobenzoni rilo 0.15 HPLC p-clorobenzamida 2-cloro-3- 0.15 HPLC 2-cloronicoti- cianopridina na ida acetonitrilo 0.4 GC acetamida propionitrilo 0.4 GC propionamida metacrilonitrilo 0.4 GC me acrilamida n-butironitrilo 0.4 GC n-butiramida o-, m-, p-clorobenzonitr lo y 2-cloro-3-c?anop?r?dma se agregaron a la mezcla de reacción disueltos en metanol .

Tabla 9 Especificidad al substrato de hidratasa de nitrilo NA40 Substrato Actividad Substrato Actividad relativa relativa (%) (%) 3-cianopiridina 100 m-clorobenzo- 75 4-cianopiridina 168 nitrilo 2-cianopiridina 128 p-clorobenzo- 16 Benzonitri1o 51 nitrilo crotonotritrilo 52 2-cloro-3- 126 Acrilonitrilo 115 cianopridina o-clorobenzo- 96 acetonitrilo - nitrilo propionitrilo 105 metacrilonitrilo 130 n-butironitrilo 184 (4) Temperatura óptima y estabilidad térmica en células en reposo La reacción se realizo en la mezcla de reacción estándar durante 10 minutos . La temperatura óptima se encontró entre 35 a 40°C (figura 5) . Las células encubaran entonces a diferentes temperaturas durante 30 minutos y se examinó la actividad bajo condiciones de reacción estándar. Como puede observarse de la figura 4, la estabilidad térmica fue de 40°C. (5) pH óptimo y estabilidad de pH en células en reposo Para este propósito, la reacción se realizo durante 10 minutos en la mezcla de reacción estándar en la cual el amortiguador de fosfato de potasio ha sido reemplazado por varios amortiguadores 0.1 M. Como puede observarse de la figura 7, el pH óptimo se encontró entre 4.5 Y 10. después de que la suspensión celular ha sido incubada a 20°c durante 30 minutos a diferentes valores de pH, las células se centrifugaron . Las células se lavaron y se resuspendieron en amortiguador de fosfato de potasio 0. l M pH 7.0. La reacción se realizo en 10 minutos por medio de la adición de 3-ciano-piridina bajo condiciones estándar. La enzima fue estable a un pH entre 4.5 y 10.0 (Figura 7) . (6) Acumulación de nicotinamida desde 3-cianopiridina por medio de NA40 La reacción se realizo en una mezcla de reacción (30 ml) , que consistía de 500 mM de 3-cianopiridina, 40 mM de amortiguador de fosfato de potasio (pH 7.0) y células en reposo (peso seco 2.3 mg) . Durante la reacción se agrego 3-cianopiridina (500 mM) 7 veces en tan pronto como se consumía. De esta manera se agrego 3-cianopiridina 4.0 M en el curso de 15 horas y se formaron 3.89 M (475 g/1) de nicotinamida, correspondiendo a un rendimiento de 97.3%. Acido nicotínico no se formo.

Ejemplo 3 Identificación de microorganismos del genero Amycolatopsis Los siguientes 5 marcadores quemotaxonómicos apoyaron la identificación: 1. Aminoácido de diagnostico del peptidoglicano: ácido meso-diaminopimélico 2 Azucares de diagnostico: arabinosa y galactosa 3 Menaquinonas : MK-9 (H.) 5 Modelos de ácido graso: ácidos grasos 2-hidroxi o ramificados isa/anti-iso, pequeñas cantidades de ácido rasos 10-metilo ramificados se detectaron adicionalmente. Este modelo de ácido grasó se encontró en todos los representantes del genero Amycolatopsis (modelo de ácido graso 3f) . La combinación de esas características químicas es diagnostico de todas las especies del genero Amycoltopsis . Los datos de ácido graso de los dos cultivos se compararon con la ayuda de análisis de componente principal usando toda la base de datos de ácidos grasos . Usando este método, fue posible asignar tanto NE31 como NA40 al genero Amycolatopsis, sin embargo no fue posible la identificación de la especie, ya que el factor de correlación fue muy bajo» La comparación de los modelos de ácido graso de ambas cepas sin embargo, son dos cepas de diferentes tipos. El resultado se confirmo por los resultados del análisis de secuencia de rADN 16S . Aguí también , se realizo la asignación al genero Amycolatopsis pero no a ninguna de las especies atrtycolatspsis -descritas. En este método la secuencia del rADN 16S se determino por medio de secuenciación directa del gen de xADN 16 atrrpli?icado por PCR. La parte de diagnostico de la secuencia rADN 16S se comparo con la secuencias de las especies típicas del genero Amycolatopsis y taxa relacionadas . El resultado mostró que la cepa pertenece al genero Amycolatopsis . La mayor coincidencia se encontró con Amycolatopsis methanolica con 96.9% (NA40) y 96.1% (NE31) . Entre ellos los dos aislados mostraron coincidencia en las secuencias del 99.0%. Nuestras investigaciones sobre representantes del genero Amycolatopsis han mostrado que para la buena identificación de la especie el factor de correlación debe ser mayor a 99.5%. Ya que 96.9% es un valor claramente por debajo 99.5%, puede concluirse de esto que los dos aislados no fueron representantes de especies de Amycolatopsis conocidas . En base a los presentes resultados, no fue posible asignar a los aislados a ninguna de las especies de Amycolatopsis conocidas. Concluimos d esto que NA40 y NE31 son cepas pertenecientes a una especie nueva no descrita antes del genero Amycolatopsis. Características de identificación de microorganismos del genero Amycolatopsis Color del micelio aereo Color del substrato del micelio Color del pigmento difuso Espectro de azucares ARA + GAL + MAD XYL GLU tr RIB + Tipo A DAP DL Menaquinonas (en %) 8/4 9/0 ( +) 9/2 9/4 +++ 9/6 9/8 Homología a 16S rADN >99.5% Fosfolípidos PE OH-PE liso PE met PE PC NPG l + PIM v PG + DPG + GL Tipo II+OH-PE Ácidos grasos iso 16 +++ iso 15 + iSO 17 ( +) anteiso 15 + anteiso 17 (+) 10-Me 16 (+) 10-Me 17 2-OH 15 2-OH 16 + Tipo 3f MS - Ejemplo 4 Purificación de hidratasa de nitrilo de la cepa de microorganismos NA40 La cepa se cultivo a 37°C durante 3 días en el medio de acuerdo con la tabla 3. Las células de 21 de cultivo se cosecharon por medio de centrifugación y luego se resuspendieron en una solución de NaCl al 0.85%. Las células se transfirieron entonces a un amortiguador de fosfato de potasio O.lM (pH 7.0) que consistía de 44 mM de ácido n-butirico y se trataron con ultrasonido. El extracto celular se centrífugo y los fragmentos células se retiraron. Este extracto se uso para la purificación enzimática. Durante toda la purificación se uso amortiguador de fosfato de potasio (pH 7.0) consistente 44 mM de ácido n-butirico . Como puede observarse de la tabla 10, la enzima se purifico hasta la homogeneidad en 3 etapas . Tabla 10 Purificación de la hidratasa de nitrilo de NA40 Actividad Prot. Activ. Enrique- total totales esp. cimiento (Unidades) (mg) (U/mg) Extracto libre 73,300 1020 71.9 de células DEAE- Sephacel 68,000 110 620 8.62 Fenil-TOYOPEARL 64,800 61.4 1105 15.4 1 Unidad: la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 µmol de nicotinamida/min a 20°C. Ejemplo 5 Caracterización de la hidratasa de nitrilo (1) Determinación del peso molecular, la estructura de la subunidad y el contenido de iones de cobalto El peso molecular se detemino que era 106 KDa por medio de cromatografías en una columna de gel TSK G3000 SW (0.75c60 cm) usando amortiguador de fosfato de potasio O.lM (pH 7.0) conteniendo KCl 0.2 M y 44 mM ácido butírico. Se determino que la enzima consistía de dos subunidades diferentes OÍ y ß, cuyo peso molecular se determino que era 30,000 y 26000 en cada caso. La figura 1 muestra la determinación del peso molecuar por medio de cromatografía en gel TSK G3000 SW. La figura 2 muestra la determinación del peso molecular por medio de SD-PAGE La figura 3 muestra el espectro de absorción de la enzima purificada. Se observo una amplia absorción de 300-400 nm. (2) Especificidad del substrato de la enzima purificada La especificidad del substrato se detemino análogamente al ejemplo 2 (1) . Los resultados se resumen en la tabla 11.

Tabla 11 Especificidad del substrato de la hidratasa de nitrilo purificada Substrato (M) Act . Actividad relativa total (%) (µmol/ml Reacción Reacción /min) enzima- con tica células en reposo J3 3-cianopiridina 1.0 17.7 100 100 2-cianopiridina 0.25 39.1 221 128 4-cianopiridi a 0.25 31.6 179 168 crotonotritrilo 0.4 11.9 67 52 Benzonitrilo 0.03 11.3 64 51 Acrilonitrilo 0.4 16.6 94 115 o-clorobenzonitrilo 0.15 22.4 127 96 m-clorobenzoni rilo 0.15 15.9 90 75 p-clorobenzonitrilo 0.15 2.30 13 16 2-cloro-3- 0.15 16.0 90 126 cianopridi a acetonitriio 0.4 - - - propioxiiLrilo 0.4 39.3 222 105 metacrilonitrilo 0.4 22.1 125 130 n-butironitrilo 0.4 17.9 101 194 1.7 unidades de enzima se agregaron a la mezcla de reacción (2.0 ml) . La mezcla de reacción contenía el substrato respectivo en 45 mM de amortiguador de fosfato (pH 7.0) . (3) Determinación del valor KM El valor KM se determinó que era 41.7 mM para 3- cianopiridina y 3.mM para acrilonitrilo por medio del diagrama de Line eaver-Burk. Comparado con Rhodococcus rhodochrous Jl, que tenía un valor KM relativo a 3- cianopiridina de 20 mM, el de NA40 es significantemente menor. Esta es una de las ventajas principales de NA40. (4) Estabilidad termina y temperatura óptima La enzima purificada se incubo durante 30 minutos a un pH de 7.0 con diferentes temperaturas y se midió la conversión de 3-cianopiridina a nicotinamida a 20°C durante 1 minuto. La enzima se inactivo a una temperatura mayor de 40°C. La estabilidad térmica fue de aproximadamente 40°C como en las células en reposo y la temperatura óptima fue de entre 35 y 40°C (figura 5) . (5) pH óptimo y estabilidad de pH Para este propósito, se realizo la conversión de 3- cianopiridina a nicotina ida a 20°C en una mezcla de reacción (2.0 ml) consistiendo de varios amortiguadores (42.5 mM) , 1.71 unidades de enzima purificada y 500 rnM de 3-cianopiridina. El pH óptimo fue de aproximadamente 6.5 ± 1.0 (figura 8) . Para determinar la estabilidad del pH, 4.2 unidades de enzima purificada se encubaran a 20°C durante 1 hora en diferentes amortiguadores (45 mM) . Una parte de la solución incubada, 1.71 unidades se agrego a la mezcla de reacción estándar (ver ejemplo 2(1)) . Se determino la actividad restante. La enzima era estable en un margen de pH de 5-9. El resultado se muestra en la figura 9. (6) Inhibidores Se determino el efecto de varios inhibidores. Los resultados se resumen en la tabla 12. Tabla 12 Efecto de varios inhibidores sobe la enzima purificada Inhibidor mM Actividad relativa (%) 100 N-etilmaleinimida 1 97 ácido yodocético 1 39 ácido 4- 0.1 69 cloromercurobenzóico Azida de sodio 1 59 Hidroxilamina 1 37 Fenilhirazina 1 8 Semicarbazida 1 82 Tirón (sal sódica de ácido 1 1 110 4, 5-dihidroxi-1, 3-benceno- disulfonico o-fenantrolina 1 89 o¿, a-dipiridilo 1 100 8-hiroxiquinolina 1 110 EDTA (ácido etileno- 1 115 diaminotetra-acético ditiocarbamato de dietilo 89 Ejemplo 6 Efecto de metanol sobre las células en reposo de NA40 La reacción se realizó durante 10 minutos en la presencia de 0-20% (v/v)"metanol de acuerdo con la tabla 13. Como se muestra en la tabla 14, la actividad aumenta por medio de la adición de 5-15% de metanol. Ejemplo 13 Reacción con células en reposo Métodos 3-ciano-piridina 1.0M l . Oml l . Oml l . Oml l . Oml l . Oml KPB* O.lm (pH 7.0) 0.9ml O.Sml 0.7ml 0.6mi 0.5ml Metanol 0. lml 0.2ml 0.3ml 0.4ml Suspensión celular O.lml O.lml O. lml O.lml O.lml (0.388 mg/ml) Volumen total 2. Oml 2. Oml 2. Oml 2. Om-1 2. O l *KPB = amortiguador de fosfato de potasio Tabla 14 Efecto de metanol sobre Amycolatopsis NA40 Métodos Metanol [% (v/v) ] Actividad reí . [%] i 0 100 2 5 123 3 10 128 4 15 130 5 20 105 Ejemplo 7 Enriquecimiento de microorganismos del genero rhsdococcus Se inocularon varias muestras de suelo con ácido cianoacético como fuente de C y N en el medio de enriquecimiento de acuerdo con la tabla 1 y se aislo el microorganismo Rhodococcus GF270, GF578, GF473 y GF376 de acuerdo con el ejemplo 1. Ejemplo 8 Biotiansformacion usando microorganismos del genero Rhodococcus (I) Estabilidad térmica del microorganismo Rhodococcus^ GF674, Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF270 y Rhodococcus GF376 en comparación con Rhodococcus rhodochrous Jl. Para la determinación de la estabilidad térmica, los microorganismos descritos antes se cultivaron en los siguientes medios . Rhodococcus rhodochrous Jl se cultivo durante 72 horas en el medio descrito en EP-A-O 307 926. Los microorganismos Rhodococcus GF674, GF578, GF270 y GF376 se cultivaron en los siguientes medios a un pH de 7.0 hasta durante 96 horas: Rhodococcus GF674 en un medio que consistía de extracto de levadura 1.0 g/1, fructosa 5.0 g/i, extracto de malta 10.0 g/1, acetamida 5.0 g/1, KH2P04, 2.0 g/1, MgS04-7H20 0.5 g/1 y CoCl26H20 10.0 mg. Rhodococcus GF578 en un medio que consistía de extracto de levadura 1.0 g/1, fructosa 15.0 g/1, extracto de malta 10.0 g/1, acetamida 25.0 g/1, KH2P04, 2.0 g/1, MgS04-7H200.5 g/1 y CoCl26H20 5.0 mg. Rhodococcus GF270 en un medio que consistía de extracto de levadura 12.5 g/1, citrato de sodio 5.0 g/1, metacrilamida 7.5 g/1, KH2P04, 2.0 g/1, MgS04.7H20 0.5 g/1 y CoCl26H20 30.0 mg. Rhodococcus GF376 en un medio que consisLía de extracto de levadura 1.0 g/1, citrato de sodio 10.0 g/1, extracto de malta 15.0 g/1, butiramida 7.5 g/1, KH2P04, 2.0 g/1, MgS04.7H20 0.5 g/1 y CoCl26H20 15.0 mg. Las células en reposo se encubaran entonces durante 15 minutos a diferentes temperaturas y la actividad restante se determino bajo condiciones de reacción estándar de acuerdo con el ejemplo 2(1) . En el curso de esto se encontró que Rhodococcus GF674 tenía una actividad relativa de casi 100% a una temperatura de 50°C y una actividad de aproximadamente 10% a 60°C. Rhodococcus GF578 de igual forma tenía una actividad de 100% relativa a 50°C y una actividad relativa de 20% a 60%. Rhodococcus GF376 tenía una actividad relativa de 100% hasta a 50°C y una actividad relativa de 70% a 60% y casi una actividad relativa del 5% a 70°C. Rhodococcus GF270 tenía una actividad relata de casi 100% hasta a 60°C y de igual forma una actividad relativa de 5% a 70°. En comparación a esto, Rhodococcus rhodochrous Jl tenía una actividad relativa del 100% hasta a casi 50°C, 80% a 60°C y ninguna actividad a 70°. En resumen puede afirmarse que Rhodococcus GF270 y GF376 tenían una mejor estabilidad térmica que Jl y GF270 tuvo la mejor estabilidad térmica. (2) pH óptimo de las cepas de Rhodococcus El efecto del pH en la actividad de hidratasa de nitrilo de las cepas de Rhodococcus GF674, GF578, GF270 y GF376 se determino de la manera descrita en el ejemplo 2(5) . El pH óptimo de Rhodococcus GF674 fue el pH de 7.5-9.5, de GF578 de pH 8-8.5, de GF270 de pH 6-7.0 y de GF376 el pH de 6-8. (3) Especificidad del substrato para las cepas de Rhodococcus La especificidad del substrato se resume como actividad relativa en la tabla 15. (4) Acumulación de nicotinamida de las cepas de Rhodococcus Análogamente al ejemplo 2(6), las cepas de Rhodococcus GF674, GF578, GF270 y GF376 se cultivaron con 3- cianopiridina (aproximadamente 500 mM) . En el curso de esto Rhodococcus GF674 formo 6M nicotinamida en el trascurso de 25 horas, GF578 5.5 M nicotinamida en el transcurso de 10 horas, GF270 aproximadamente 8.5 M nicotinamida en el transcurso de 20 horas y GF376 7.5 M nicotinamida en el transcurso de 20 horas. (5) Tolerancia de 3-cianopiridina sobre la actividad de las cepas de Rhodococcus Con el fin de probar la tolerancia de.3-cianopiridina, las células en reposo se encubaran durante 15 minutos a 20 °C a concentraciones de 3 -cianopiridina ente 1 y 10% (p/v) y las células entonces se retiraron por medio de centrifugación. Después de lavar las células con 0.85% NaCl, se midió la actividad restante. La tolerancia de 3-cianopiridina como substrato se probo con varias concentraciones de substrato. Se encontró que con una concentración de substrato de 2% (p/v) la actividad de hidratasa de nitrilo de Rhodococcus rhodochrous Jl disminuía por el factor 1.4, la actividad de hidratasa de nitrilo de Rhodococcus GF674 a una concentración de substrato de 4% (p/v) disminuyo en un factor de 1.4, la actividad de hidratasa de nitrilo de Rhodococcus GF578 permaneció casi constante hasta una concentración de 8%, la actividad de hidratasa de nitrilo de Rhodococcus GF 70 a una concentración de substrato de 4% (p/v) disminuyo por el factor 1.17 y la actividad de hidratasa de nitrilo de Rhodococcus GF376 a una concentración de substrato de 10% (p/v) se redujo en un factor de 1.25. En comparación con las otras cepas de Rhodococcus rhodochrous Jl presento la menor tolerancia a 3-cianopiridina.

Tabla 15 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: 1. - Microorganismos del genero Amycolatopsis o Actinomadura, caracterizados porque son capaces de convertir un nitrilo en una amida, y sus extractos enzimáticos.
2. 2.- Microorganismos de acuerdo con la reivindicación 1, de la especie Amycolatopsis NA40 y Amycolatopsis NE321, por ejemplo como los que se depositaron bajo los números de deposito DSM 11617 y DSM 11616, y sus variantes y mutantes con funcionalidad equivalente.
3. 3. - Microorganismos de acuerdo con la especie Rhodococcus GF270 y GF376, por ejemplo los depositados bajo los números de deposito DSM 12211 y DSM 12175, y sus variantes y mutantes de funcionalidad equivalente, caracterizados porque son capaces de convertir un nitrilo en una amida, y sus extractos enzimáticos.
4. 4.- Enzima que tiene actividad de hidratasa de nitrilo, caracterizada porque es obtenible a partir de los microorganismos de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2.
5. 5.- Enzima de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada por a) un pH óptimo de 6.5 ±1.0 b) una temperatura óptimamente 35 y 40°C a un pH de 7.0 c) un valor K„ para el substrato 3-cianopiridina de 41.7 mM + 7.7 mM.
6. 6.- Procedimiento para la preparación de amidas, caracterizado porque un nitrilo como substrato es convertido a la amida correspondientes por medio de los microorganismos de acuerdo con la reivindicación 1 a 3 , con un extracto enzimático de esos microorganismos o por medio de la enzima de acuerdo con la reivindicación 4.
7. 7.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el nitrilo empleado es nitrilo alifático con de i a 10 átomos de carbono opcionalmente substituido .
8. 8. - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 , caracterizado porque el nitrilo empleado es nitrilo aromático opcionalmente substituido con de 4 a 10 átomos de carbono en el sistema anular.
9. 9. - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 , caracterizado porque el nitrilo aromático se selecciona de los compuestos de la formula general en la cual R1 y R2 son átomos de hidrógeno, un átomo de halógeno o alquilo con de l a 4 átomos de carbono. 10. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque la reacción se realiza a una temperatura de 0 a 50°C y a un pH de 4.5 a
10. 10.
11. 11.- Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque la reacción se realiza por medio de microorganismos del genero Amycolatopsis que tienen la designación NA40 (DSMZ 11617) o NE31 (DSMZ 11616) o usando sus variantes o mutantes funcionalmente equivalentes .