FI93858C

FI93858C - Menetelmä amidin valmistamiseksi mikrobiologisesti

Info

Publication number: FI93858C
Application number: FI884279A
Authority: FI
Inventors: Hideaki Yamada; Toru Nagasawa
Original assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd; Hideaki Yamada
Priority date: 1987-09-18
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1995-06-12
Also published as: RU1838416C; FI93858B; US5334519A; PT88540A; HU204099B; NO175489B; PT88540B; NO175489C; CN1015473B; MX169933B; NO884114D0; DE3877869T2; JPH02470A; HUT50215A; RO101578B; PL160904B1; KR0134094B1; NO884114L; CN1032436A; EP0307926B1

Description

QTOirq MENETELMÄ AMIDIN VALMISTAMISEKSI MIKROBIOLOGISESTI ^ ^ O ^ O KEKSINNÖN TAUSTA Keksinnön alue Tämä keksintö koskee menetelmää nitriilin hydratoimiseksi, jolloin se muutetaan vastaavaksi amidiksi mikro-organismista peräisin olevan nitriilihydrataasin vaikutuksella. Tarkemmin tämä keksintö koskee menetelmää amidin tuottamiseksi biologisesti, jolle menetelmälle on tunnusomaista käytetty mikro-organismi ja menetelmä nitriilihydrataasin tuottamiseksi.

Tekniikan taso

Alempi alifaattinen amidi, kuten akryyliamidi, valmistetaan hydratoimalla nitriili, kuten akrylonitriili, ja on olemassa monia esityksiä hydratointimenetelmistä mikro-organismien avulla tuotettujen entsyymien, kuten nitrilaasin tai nitriilihydrataasin, vaikutuksella (katso esimerkiksi japanilainen patenttijulkaisu nro 21519/87, US-patentti nro 4 001 081; tutkimattomat julkaistut japanilaiset patenttihakemukset nro 162193/86 ja 91189/87, EPC nrot 0188316 ja 0204555; ja japanilaiset patenttijulkaisut nro 17918/81 ja 37951/84, US-pa-tentit nro 4 248 968 ja 4 637 982). Näitä menetelmiä amidin tuottamiseksi biologisesti on myös käytetty kaupallisesti ja ne ovat herättäneet huomiota, koska ovat edullisia menetelmiä akryyliamidin tuottamiseksi.

Useita mikro-organismeja on jo esitetty sellaisina, joita käytetään menetelmään amidin tuottamiseksi biologisesti.

Tämän keksinnön tekijöiden suorittamien tutkimusten mukaan nämä mikro-organismit, vaikka ovat tehokkaita hydratoitaessa alempia alifaattisia nitriileitä, eivät kuitenkaan aina ole tehokkaita hydratoitaessa aromaattisia nitriileitä. Niinpä menetelmä nikotiiniamidin tuottamiseksi hydratoimalla 3-sya-nopyridiiniä antaa liian pienen saannon, jotta sitä voitaisiin käyttää kaupallisiin tarkoituksiin.

2 93858

Tekniikan tasossa on tunnettua suorittaa mikro-organismin viljely rautaionin tai mangaani-ionin läsnäollessa. Tätä tekniikkaa käytetään myös menetelmässä amidin tuottamiseksi biologisesti, ja esimerkkejä Rhodococcus-suvun mikro-organismien viljelystä rauta-ionin läsnäollessa on esitetty tutkimattomissa julkaistuissa japanilaisissa patenttihakemuksissa nrot 162193/86 ja 91189/87.

Tuloksena tämän keksinnön tekijöiden suorittamasta tutkimuksesta havaittiin, että nitriilin hydrataatioentsyymi, s.o. nitriilihydrataasi, joka on peräisin Pseudomonas-suvun bakteerista, sisältää Fe+++-ionin aktiivisessa keskuksessaan ja näin ollen rautaionin läsnäolo kasvualustassa on olennaista mikro-organismin viljelylle. Sen mukaisesti oletetaan myös Rhodococcus-suvun mikro-organismin tapauksessa edellä kuvatuissa tunnetuissa esimerkeissä, että rautaioni kasvualustassa mikro-organismin viljelyssä on olennaista nitriilin hydra-taatioentsyymin syntymiseksi.

Keksinnölle on tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa Tämä keksintö on tehty niiden havaintojen perusteella, että tietty Rhodococcus-suvun kanta, s.o. kanta J-1 lajista rhodochrous ei tuota nitriilihydrataasia rautaionin sisältä-. vässä kasvualustassa ja että koboltti-ionin sisältävässä kas vualustassa kanta tuottaa nitriilihydrataasia; ja että näin muodostunut nitriilihydrataasi voi käyttää aromaattista nit-riiliä substraattina ja muuttuu amidiksi.

Sen mukaisesti menetelmä amidin tuottamiseksi tämän keksinnön mukaan on menetelmä amidin tuottamiseksi biologisesti, jolloin nitriili hydratoidaan vastaavaksi amidiksi mikro-organismista peräisin olevan nitriilihydrataasin vaikutuksella, jolle menetelmälle on tunnusomaista se, että mainittu nitriilihydrataasi sadaan viljelemällä lajia Rhodococcus rhodochrous edustavaa mikro-organismia koboltti-ionin läsnäollessa.

3 93858 Tämän keksinnön mukaan, vaikka rautaionin sisältävässä kasvualustassa onkin nitriilihydrataasin nolla-aktiivisuus, aktiivisuus kehittyy kasvualustassa, joka sisältää koboltti-ionin. Odottamatta voisi olettaa, että tämän tietyn mikro-organismin nitriilihydrataasilla on kriittinen riippuvuus kasvatusalustassa olevan metalli-ionin lajista.

Lisäksi tämän keksinnön mukaan voidaan aromaattisen nitriilin hydratoiminen suorittaa edullisesti. Tämän keksinnön vaikutus on käyttökelpoinen nikotiiniamidin, 3-syanopyridiinin hydratoimistuotteen, tärkeyden takia raaka-aineena vitamiini-synteesissä tai pyratsiiniamidin, syanopyratsiinin hydratoimistuotteen, tärkeyden takia, pyratsiiniamidin ollessa käyttökelpoinen tuberkulostaattina.

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

1. joitakin yleisiä käsitteitä menetelmästä tuottaa amidia biologisesti Tämä keksintö koskee menetelmää nitriilin hydratoimiseksi, jolloin se muutetaan vastaavaksi amidiksi mikro-organismista peräisin olevan nitriilihydrataasin vaikutuksella, joka menetelmä käsittää periaatteessa mikro-organismin viljelyn, nitriilihydrataasin indusoimisen ja näin saadun nitriilihydrataasin saattamisen toimimaan substraattinitriilinä.

Nämä vaiheet ovat sinänsä tunnettuja yksittäisinä toimintoina ja niitä käytetään sopivassa muodossaan tässä keksinnössä. Sanonta "nitriilihydrataasi saadaan viljelemällä mikro-organismia koboltti-ionin läsnäollessa" käsittää nitriilihydrataasin indusoitumisen luonnollisena lähtökohtana.

Tämän keksinnön lähtökohta "menetelmä nitriilin hydratoimi-seksi, jolloin se muutetaan vastaavaksi amidiksi mikro-organismista peräisin olevan nitriilihydrataasin vaikutuksella" käsittää mitkä tahansa sopivat toteutusmuodot ja muunnokset nitriilihydrataasin saattamiseksi toimimaan nitriilissä. Eräs 93858 tällainen toteutusmuoto on menetelmä mikro-organismilla tuotetun entsyymin keräämiseksi ja entsyymin käyttäminen entsyymi valmisteena . Tämän nitriilihydrataasin käyttötavan, jossa entsyymiä käytetään entsyymivalmisteenä, on ymmärrettävä kuuluvan kategoriaan "menetelmä biologisesti tuottamiseksi" tässä keksinnössä.

2. Hydratoimisreaktion yksityiskohtia l) Mikro-organismi Tässä keksinnössä käytetty mikro-organismi on Rhodococcus rhodochrous-lajin mikro-organismi.

Edustava kanta tästä lajista on kanta j-l.

Yksityiskohdat kannasta j-l ovat seuraavat: (1) Alkuperä ja talletus

Kannasta j-l on otettu näyte Sakyo-ku of Kyoto:n maaperästä, Japanista, ja talletettu kansainvälisenä talletuksena (Budapestin sopimuksen mukaisesti, joka koskee mikro-organismien talletuksen tunnistamista kansainvälisesti patenttitarkoituk-: siin) laitokseen Fermentation Research institute, Japan,

Agency of Industrial sciences and Technology, tulonumerolla FERM BP-1478.

(2) Bakteriologiset ominaisuudet (a) Morfologia (1) Solujen muoto ja koko: 0,9-1,0 μ x 3-10 μ.

(2) Solujen polymorfia: Solu esiintyy pitkän sau- van muotoisena viljelmän alkuvaiheessa, kasvaa nykäisten käyräksi ja jakautuu sitten lyhyiksi basilleiksi.

(3) Liikkuvuus: Ei yhtään.

5 93858 (4) Itiöiden läsnäolo: Ei yhtään.

(5) Gram-värjäytyvyys: Positiivinen.

(6) Haponkesto-ominaisuus: Negatiivinen.

(7) Heterofiilinen granulosyytti: Havaittu.

(b) Kasvuvaiheet eri kasvualustoissa (30°C) (1) Lihaliemiagarlevyviljelmä: pyöreitä, halkasija 1 mm (48 h), epäsäännöllisiä ja pehmeitä, pinta melko kuiva, litteitä, läpikuultavia, väriltään vaalean oranssinpinkkejä.

(2) Lihaliemiagarvinoviljelmä: pehmeäpintaista lankaa, pinnan ollessa melko kuiva, hiukan ulkoneva osa, väri vaalean oranssin-pinkki.

(3) Lihalieminesteviljelmä: Kukoistava kasvu, joka muodostaa solumembraanin, ja kohtuullinen sameus ja sedimentti muodostuvat kasvun seurauksena.

(4) Lihaliemigelatiini- pisteviljelmä: Kasvavat hienosti pinnal la kartion muotoisesti pitkin pisteosaa, mutta ei alemmassa kerroksessa; gelatiinissa ei havaita nesteytymistä.

(5) Litmusmaito: Ei muutosta.

(c) Fysiologiset ominaisuudet (1) Nitraattien pelkistys: positiivinen.

(2) Denitrifikaatio: Negatiivinen.

(3) MR-koe: Negatiivinen.

(4) VP-koe: Negatiivinen.

(5) indolin kehitys: positiivinen.

“ (6) Vetysulfidin kehitys: positiivinen.

6 93858 (7) Tärkkelyksen hydrolyysi: Negatiivinen.

(8) Sitruunahapon hyväksikäyttö:

Kocurin kasvatusalusta: Negatiivinen.

Christensenin kasvatusalusta: positiivinen.

(9) Epäorgaanisen typpilähteen hyväksikäyttö: nitraatti: Positiivinen, anunoniumsuola: Positiivinen.

(10) Värjäävän aineen kehitys: Negatiivinen.

(11) Ureaasi: Positiivinen.

(12) Oksidaasi: Negatiivinen.

(13) Katalaasi: Positiivinen.

(14) Selluloosan hydrolyysi: Negatiivinen.

(15) Kasvualue: pH: 5-10/ lämpötila: 10-41°C.

(16) Suhtautuminen happeen: Aerobinen.

(17) Tyrosiinin hajotus: positiivinen.

(18) Adeniinin hajotus: Positiivinen.

(19) Fosfataasi: positiivinen.

(20) Tween 20:n hydrolyysi: positiivinen.

(21) O-F-koe: Negatiivinen.

(22) Lämmönkesto (10 %:ssa kuoritussa maidossa 72°C:ssa 15 minuuttia): Ei yhtään.

(23) Hapon ja kaasun syntyminen sokerista: Happo Kaasu L-Arabinoosi D-Ksyloosi D-Glukoosi + D-Mannoosi D-Fruktoosi +

Maltoosi + -

Sokeri + -

Laktoosi -

Trehaloosi D-Sorbitoli + D-Mannitoli + -

Glyseroli + +: positiivinen; -: negatiivinen 93858 (24) Kasvu yksittäisessä typpilähteessä:

Inositoli -

Maltoosi + D-Mannitoli +

Ramnoosi D-Sorbitoli + m-Hydroksibentsoehappo +

Natriumadipaatti +

Natriumbentsoaatti +

Natriumsitraatti +

Natriumlaktaatti +

Testotetroni + L-Tyrosiini +

Glyseroli (1%) (w/v) (+)

Trehaloosi (+) p-Hydroksibentsoehappo (l%)((w/v) + +: positiivinen; negatiivinen; (+): hiukan positiivinen .

(25) Rasvahappo ja soluseinämän analyysi: Sisältää tyydyttyinättömiä ja tyydyttyneitä suora-ketjuisia rasvahappoja ja tuberkulosteariinihappoa. TLC mykolihaposta antaa yksittäisen täplän.

• ·

Tuloksena edellä kuvatusta bakteriologisten ominaisuuksien luokittelusta julkaisun Bergy's Manual of Systematic Bacteriology valossa selviää, että kanta j-i on aerobinen, gram-positiivinen, heikkoa happoa kestävä, katalaasi-posi-tiivinen ja sisäitiöitä kehittämätön basilli, joka ei sisällä värekarvoja. sillä on myös pitkänomaisen basillin, kuten huo-vaston muoto kasvun alkuvaiheessa, se kasvaa haarautuen ja jakautuu sitten lyhyiksi basilleiksi. Sen vuoksi sen todetaan kuuluvan Nocardia-tyyppisiin bakteereihin.

Rasvahappokoostumuksen analyysi osoittaa, ett bakteeri sisäl- tää tyydyttämättömiä ja tyydyttyneitä suoraketjuisia 93858 rasvahappoja sisältäen tuberkulosteariinihappoa. TLC-analyysi mykolihaposta antaa yksittäisen täplän, jonka Rf-arvo on sama kuin standardibakteerilla Rhodococcus rhodochrous (IFO 3338) ja eroaa näin Mycobacterium-suvusta. Se eroaa myös Nocardia-suvusta mykolihapon koostumuksen vuoksi (hiiliatomien lukumäärä) . Tuloksina muista biokemiallisten ominaisuuksien tutkimuksista bakteerin tunnistetaan olevan Rhodococcus rhodochrous.

Mikro-organismeilla on taipumus·mutatoitua. Siksi on tarpeetonta sanoa, että bakteeria, vaikkakin on mutantti kelpaavas-ta kannasta, kuten kanta J-l, voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä, kunhan sen viljelmä tuottaa nitrii-lihydrataasia koboltti-ionin läsnäollessa.

2) Substraatti/nitriili

Nitriilit, joita voidaan käyttää substraattina edellä kuvatun mikro-organismin tuottamalle nitriilihydrataasille, ovat aromaattisia ja alifaattisia mononitriileitä tai dinitriilei-tä, erityisesti mononitriileitä.

Nitriileitä, jotka parhaiten soveltuvat tämän keksinnön ominaisuuksiin, ovat aromaattiset nitriilit, erityisesti sellaiset, joissa on 4-10 hiiliatomia muodostamassa aromaattista rengasta, useita tyypillisiä esimerkkejä aromaattisista nit-riileistä ovat yhdisteet, joita esittävät seuraavat yleiset kaavat I - IV :

N

111

Tyypillisiä tällaisia yhdisteitä ovat 4-, 3- ja 2-syanopyri-diinit.

93858

CN

jossa r! ja r2 kumpikin ovat H, CH3# OH, OCH3, Cl, CN, NH2 tai NO2·

Tyypillisiä tällaisia yhdisteitä ovat bentsonitriili, o-, raja p-klooribentsonitriilit, o- ja m-nitrobentsonitriilit, p-aminobentsonitriili, o-, m- ja p-tolunitriilit, 4-syano-fenoli, anisonitriili, ftaalinitriili, isoftaalinitriili, tereftaalinitriili, 2,6-diklooribentsonitriili ja 2,4-dikloo-ribentsonitriili.

lÖIOj-»

Tyypillisiä tällaisia yhdisteitä ovat ja β-naftonitrii- lit.

X

uvi jossa X on S tai O.

i Tyypillisiä tällaisia yhdisteitä ovat 2-tiofeenikarbonitriili ja 2-furonitriili.

H

[op]

\CN

10 93858

Tyypillinen tällainen esimerkki on 5-syanoindoli.

N

[VI]

—CN N

Tyypillinen tällainen esimerkki on syanopyratsiini.

Toinen ryhmä nitriileitä, jotka muodostavat tämän keksinnön kohteen, ovat edullisesti alifaattiset nitriilit, edullisemmin mono- tai dinitriilit, joissa on 2-6 hiiliatomia, edullisimmin mononitriilit. Tuotettavien amidien käyttökelpoisuudesta arvioiden akrylonitriili on tyypillinen ja sillä on hyvä tuottavuus.

Sanomattakin on selvää, että näitä nitriileitä vastaavat amidit ovat ne, jotka saadaan muuttamalla nitriilin CN-ryhmä C0NH2-ryhmäksi. Dinitriilien tapauksessa vastaavina amideina tulisi pitää niitä, jotka saadaan muuttamalla ainakin yksi CN-ryhmistä C0NH2“ryhmäksi.

3- Nitriilihydrataasin viljely/tuotanto

Lajin Rhodococcus rhodochrous mikro-organismin viljely voidaan suorittaa missä tahansa sopivissa olosuhteissa sillä edellytyksellä, että koboltti-ioni on läsnä kasvualustassa. Voi olla käytännöllistä panna entsyymin indusoija, jota kuvataan tässä jäljessä tarkemmin, kasvualustaan niin, että nit-riilihydrataasi akkumuloituu bakteerisoluihin.

(l) Peruskasvualusta

Esimerkkejä sopivista kasvualustoista on annettu jäljessä. Alan ammattimies voi helposti vaihdella alla esitetyn komponentin määrää (esitettyjen komponenttien määriä), korvata komponentin toisella, ja eliminoida jonkin komponentin (joitakin komponentteja) ja lisätä toinen (toisia).

93858

(i) Kasvatusalusta A

Määrä (1 l:ssa

Komponentti kasvatusalustaa)

Vitamiiniseos *1 0,1 ml K2HPO4 13,4 g KH2PO4 6,5 g

NaCl 1,0 g

MgS04-7H20 0,2 g

Tislattua vettä Tasapainoon (pH 7,0) *lKoostumus:

Biotiini 2 ug

Kalsiumpantotenaatti 0,4 mg inositoli 2 mg

Nikotiinihappo 0,4 mg

Tiamiinihydrokloridi 0,4 mg

Pyridoksiinihydrokloridi 0,4 mg p-Aminobentsoehappo 0,2 ng

Riboflaviini 0,2 mg

Foolihappo 0,01 ng

Vesi 1 litraksi

(ii) Kasvatusalusta B

Glyseroli 10 g

Peptoni 5 g

Mallasuute 3 g

Hiivauute 3 g

Tislattu vesi Tasapainoon (pH 7,0)

(iii) Kasvatusalusta C

Hiivauute 3 g KH2PO4 0,5 g K2HPO4 0,5 g M9S04.7h20 o,5 g

Tislattu vesi Tasapainoon (pH 7,2) 12 93858 (2) Entsyymin indusoija

Entsyymin indusoijat indusoimaan ja tuottamaan nitriilihydra-taasia mikro-organismissa Rhodococcus rhodochrous voivat olla mitä tahansa tarkoitukseen sopivia.

Tyypillisiä indusoijia tähän keksintöön ovat nitriilit ja amidit.

Esimerkkejä entsyymin indusoijista, joiden vaikutus kantaan J-l on vahvistettu, ovat: krotonamidi, asetonitriili, propionitriili, bentsamidi, propionamidi, asetamidi, isovaleronitriili, n-butyronitriili, isobutyronitriili, n-kapronitriili, 3-penteeninitriili, pivalonitriili, n-butyramidi, isobutyramidi, n-valeramidi, n-kapronamidi, metakryyliamidi ja fenyyliasetamidi.

(3) Koboltti-ionin lähde

Nitriilihydrataasia ei tapahdu vaikka edellä kuvattu entsyymin indusoija olisikin läsnä kasvatusalustassa, niin että tämän keksinnön mukaan on oleellista, että koboltti-ioni on läsnä kasvatusalustassa.

Koska kasvualusta on vesipitoinen, koboltti-ioni saadaan syntymään lisäämällä vesiliukoista kobolttiyhdistettä kasvualustaan. vesiliukoisia kobolttiyhdisteitä esitetään kemiallisissa luetteloissa ja alan ammattimiehen on helppo valita sopiva yhdiste ja käyttää sitä (joissakin tapauksissa suorittamalla yksinkertaisia esikokeita). Tyypillisiä kobolttiyhdisteitä ovat ne, joista saadaan Co++ tai Co+++, erityisesti ne, joista saadaan Co++, ja erityisiä esimerkkejä ovat niistä ovat kobolttikloridi, kobolttisulfaatti, kobolttiasetaatti, ko-bolttibromidi, kobolttiboraatti tai vastaavat. Vitamiini B12 ja metallinen koboltti ovat muita esimerkkejä kobolttiyhdis-teistä, koska nämä tuottavat kyseisessä tilanteessa koboltti-ionin kasvualustaan ionisoitumisen tai mikro-organismin aiheuttaman hapettavan hyökkäyksen vuoksi vijelyn aikana.

93858 (4) Viljely

Viljely nitriilihydrataasin tuottamiseksi ja akkumuloimiseksi bakteerisoluun voidaan suorittaa viljelemällä käytettyä mikro-organismia, esimerkiksi kantaa J-l edellä kuvatussa kasvualustassa sopivissa olosuhteissa.

Käytetty entsyymin indusoijan määrä on yleensä 2-6 g litraa kohti kasvualustaa, ja koboltti-ionin määrä on yleensä 5-15 mg litraa kohti kasvatusalustaa perustuen CoCl2:een.

Erityisiä esimerkkejä kasvualustoiden koostumuksesta on esitetty seuraavassa: (i) Kasvatusalusta A 1 litra

Asetonitriili (indusoija) 2 g

CoCl2 10 mg (ii) Kasvatusalusta β 1 litra

Isovaleronitriili 2 g C0CI2 10 mg (iii) Kasvatusalusta C 1 litra

Krotonamidi 2 g C0CI2 10 mg

Nitriilihydrataasia voidaan edullisesti tuottaa ravistusvil-jelemällä kantaa J-l lämpötilassa 15-50°C, edullisesti 20-45°C, edullisimmin noin 30°C pH:ssa 7-9 noin 30 tuntia tai enemmän, edullisesti 40 tuntia tai enemmän (ylärajan ollessa esim. 120 tuntia). Entsyymin indusoija on edullisesti mukana viljelyn alkuvaiheesta lähtien, ja sellaisten bakteerisolujen valmistamiseksi, jotka ovat erittäin aktiivisia, on toivottavaa lisätä indusoijaa. Esimerkiksi, kun ravistusviljely on tarkoitus suorittaa lämpötilassa 28°C 76 tunnin ajan, lisätään enemmän krotonamidia 26 tuntia ja 56 tuntia reaktion alkamisen jälkeen niin että konsentraatio on 0,2% (w/v) koko ajan.

% 93858 4) Nitriilin hydratoiminen Tämän keksinnön lähtökohta "menetelmä amidin tuottamiseksi biologisesti, jossa menetelmässä nitriili hydratoidaan vastaavaksi amidiksi mikro-organismista peräisin olevan nitrii-lihydrataasin vaikutuksella" käsittää, kuten edellä on kuvattu, erilaisia huokeita toteutusmuotoja tai muunnoksia tavaksi saada nitriilihydrataasi toimimaan nitriilissä.

Eräs näistä toteutusmuodoista on tuottaa amidi kasvualustassa, jossa on substraattinitriili on läsnä mikro-organismin kasvualustassa.

Toinen toteutusmuoto nitriilihydrataasin saattamiseksi toimimaan substraatissaan on lisätä substraattinitriili kasvualustaan, johon nitriilihydrataasi on akkumuloitunut, hydratoi-misreaktion suorittamiseksi. Toteutusmuodon muunnos on käyttää kasvualustaa, jossa mikro-organismisolut on tuhottu, "kasvualustaksi, johon nitriilihydrataasi on akkumuloitunut".

Vielä eräs toteutusmuoto nitriilihydrataasin saattamiseksi toimimaan substraatissaan on eristää solut, joihin nitriilihydrataasi on akkumuloitunut, kasvualustasta, edullisesti viedä solut sopivaan kantajaan tai "immobilisoida" ne, ja sitten saattaa ne kosketuksiin substraatin kanssa. Tätä menetelmää, erityisesti edullista toteutusmuotoa, jossa käytetään immobilisoituja soluja, pidetään sopivana teolliseen käyttöön yhtä edullisesti tai vielä edullisemmin kuin toisia edellä kuvattuja toteutusmuotoja. Tämä tekniikka, jossa käytetään immobilisoituja soluja, on alalla hyvin tunnettu mitä tulee kantajaan, menetelmään immobilisoida mikro-organismi kantajaan ja immobilisoidun mikro-organismin hyväksikäyttö niin kutsutussa bioreaktorissa.

Toinen toteutusmuoto nitriilihydrataasin saattamiseksi toimimaan substraatissaan on menetelmä, jossa nitriilihydrataa-sista valmistetaan entsyymivalmiste ja nossa nitriili hydratoidaan entsyymivalmisteella pikemminkin ei-biologisella 15 93858 tavalla, sanomattakin on selvää, että hydratoimisreaktio tällä tavoin tulisi suorittaa sellaisissa pH- ja lämpötilaolosuhteissa, että entsyymin aktiivisuus ei häviä. Näiden olosuhteiden voidaan sanoa olevan samat kuin ne, jotka edellä kuvattiin "biologiseksi tavaksi". Kuten edellä on kuvattu, toteutusmuotoa, jossa mikro-organismit eivät ole mukana entsyymin toiminnan aikana, käsitellään tässä keksinnössä myös "biologisena valmistusmenetelmänä".

Tämän keksinnön mukaan nitriilihydrataasilla on sille sopiva pH-alue 7-9 optimaalisen pH:n ollessa 8,0. Jos reaktioliuok-sessa pH on pienempi kuin 7, entsyymin aktiivisuus pyrkii laskemaan jyrkästi. Siksi on toivottavaa lisätä puskuria reaktioliuokseen. vaikka käytetään jotain puskuria, kuten kaliumfosfaattipuskuri, Tris/HCl-puskuri, HEPES/KOH-puskuri ja natriumboraattipuskuri, nitriilihydrataasin entsyymiaktiivisuus ei vaihtele.

Substraatin konsentraatio kasvatusalustassa tai hydratoimis-reaktion liuoksessa on tavallisesti alueella 4-7 moolia/lit-ra, ja reaktion lämpötila on tavallisesti alueella 10-30°C.

3. Kokeelliset esimerkit

Menetelmä nitriilihydrataasin aktiivisuuden ja aktiivisuus-yksikön mittaamiseksi jäljessä olevissa kokeellisissa esimerkeissä määritetään seuraavasti: (1) Menetelmä nitriilihydrataasin mittaamiseksi

Nitriilihydrataasin aktiivisuus mitataan suorittamalla reaktio 2 ml :11a reaktioseosta, joka sisältää 10 mM bentsonitrii-liä, 30 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,0) ja tietyn määrä mikro-organismisoluja (eristetty kasvatusalustasta), 10°C:ssa 5 minuuttia ja lisäämällä 2 ml IN HC1 reaktion pysäyttämiseksi .

• (2) Yksikön määritelmä 93858

Yksi yksikkö (U) nitriilihydrataasin aktiivisuutta määritellään entsyymin määräksi, joka tarvitaan tuottamaan bentsami-dia bentsonitriilistä edellä kuvatuissa olosuhteissa nopeudella 1 ^amooli/min.

Viite-esimerkki 1

Kantaa j-1 viljeltiin käyttäen kasvualustaa, jonka koostumus on esitetty alla, viljelyolosuhteissa, jotka on myös esitetty alla, ja nitriilihydrataasiaktiivisuuden ilmentymistä tutkitaan lisäämällä Cocl2:a ja/tai FeSO^ä kasvualustaan viljelyn aikana.

(i) Kasvualustan koostumus Määrä (1 l:ssa

Ainesosa kasvatusalustaa)

Vitamiiniseos 3,0 ml K2HPO4 0,5 g KH2PO4 0,5 g

MgS04-7H20 0,5 g propionitriili 2 ml

Tislattu vesi Tasapainoon (pH 7,2) (ii) viljelmän olosuhteet 28°C/70-80 tuntia

Saadut tulokset on esitetty jäljessä.

Voidaan nähdä, että nitriilihydrataasiaktiivisuus ei kehity, vaikka FeS04:ä lisätään peruskasvatusalustaan, nitriilihydrataasiaktiivisuus kehittyy, kun CoCl2:a lisätään, ja Fesc^tn lisääminen systeemiin, johon on lisätty Cod2:a, vaikuttaa päinvastoin haitallisesti tuloksiin. 1 1 solujen määrä: perustuu kuivapainoon *2 U: aktiivisuuden yksikkö edellä olevan määritelmän mukaan, ja solujen määrä perustuu kuivapainoon.

17 93858

Lisätty metalli-ioni CoCl, 0 0 0 0 0 10 10 10 10 10 (mg) __

FeS°4 0 5 10 20 40 0 5 10 20 40 (mg)

Solujer *! 1.06 1.14 1.25 1.24 1.34 2.04 1.90 2.16 2.16 2.07 määrä · (mg/ml) _

Entsyymiaktiivisuus u/mg 12 o o o o o 0.59 0.26 0.34 0.32 o.ie soluja _ u/ml of 0 0 0 0 0 1.20 0.49 0.73 0.69 0.33 kasvual.

Viite-esimerkki 2 . Alla olevassa taulukossa on esitetty erilaisten nitriilien tai amidien vaikutukset entsyymin indusoijana kantaan J-1.

Alla olevassa taulukossa esitetyt tulokset ovat ne, jotka on saatu esiviljelemällä kantaa j-l edellämainitussa kasvualustassa B 28°C:Ssa lisäämällä nitriiliä tai amidia indusoi-; jaksi määrä 0,1 % (v/v) tai 0,2 % (w/v), vastaavasti, kun kantaa on lisäkasvatettu riittävästi, ja edelleen siirrosta-malla kanta edellämainittuun kasvualustaan C, johon on lisätty 0,001 % (w/v) CoCl2 viljelmän säilyttämiseksi 36-48 tuntia .

93858

Spesifinen Kokonais- Solujen aktiivisuus aktiivisuus määrä (mg _____(U/mg) (U/ml) in3a/al) l^rotnnn.irii__^2__tM__2.02

Asetoni tr iili 1.41 3.47 2.46

Propionitr iili 1.36 4.44 3.26

Bentsamidi 0.84 2.75 3.26

Propionamidi 0.79 2.29 2.90 A s e f: £ m ^ (j i 0.71 1.55 2.18 n-Butyronitriili 1.40 0.38 3.70

Isohutyronitriil , 041____3·06

Isovaleronitriil. 0.34 1.05 3.07 n-Kapr onitr iil i 0.28 1.04 3.71 3-penteeninitriil:. 0.32 1.42 4.49

Pivalonitriili 0.35 0.24 0.69 n-Butyroamidi 0.43 1.55 3.62 I sobuty yr iamid i 0.09 0.33 3.48

Isovaleramidi 0.44 1.08 1.81 n-Kapronamidi 0.30 1.06 3.52

Metakryyliamidi 0.20 0.62 3.12

Fenyyiiasetamidi 0.29 0.28 0.95

Esimerkki l

Kannan j-i solujen, jotka saatiin viljelemällä kantaa kasvualustassa, joka käsitti edellämainitun, C0CI2 sisältävän kasvualustan c, johon oli lisätty krotonamidia, vastaavina määrinä 0,01 g ja 2 g litraa kohti väliainetta, annettiin reagoida erilaisten substraattina käytettyjen nitriilien kanssa. Reaktio suoritettiin käyttäen 2 ml reaktioliuosta, joka sisälsi solut, jotka oli saatu 2 ml:sta viljelmää, 10 mM

i9 93858 kaliumfosfaattipuskuria (ρπ 8*0) ja 200 mM substraattia, 25°C:ssa 76 tuntia. Reaktio pysäytettiin lisäämällä siihen 0*2 ml 1 N HCl. Nitriilihydrataasin aktiivisuudet vastaaviin substraatteihin on esitetty HPLC:llä mitattuna reaktiotuotteen tai substraatin kuluneen määrän suhteina nitriilihydrataasin aktiivisuuteen mitattuna 3-syanopyridiini substraattina, s.o. spesifinen aktiivisuus (S).

Tulokset on esitety alla.

20 93858 „ , . Spesifinen

Substraatti . ... .

aktiivisuus(%) 3- Syanopyridiini 100

Akrylonitriili 106 4- Syanopyridiini 129 2-Syanopyridiini 64 5- Syanoindoli 9 2-Tiofenonitriili 116 2-Furonitriili 71

Bentsonitriili 80 4-Syanofenoli 24 n-Aminobentsonitrii1i 16 m-Nitrobentsonitriili 7 o-Nitrobentsonitriili 16 m-KlooribentsonitriilL 29 n-Tolunitriili ®_ o-Tolunitriili 46 m-Tolunitriili 32

Anisonitriili 20 o-Klooribentsonitriil _^_ p-Klooribentsonitriil:. ? 2,4-Diklooribentsonitriili 2 2,6-Diklooribentsonitriili 1

Syanopyratsiini 80 21 93858

Esimerkki 2 1 litran sakaguchi-pulloon pantiin 400 ml kasvualustaa, joka sisälsi edellämainittua kasvualustaa C, joka sisälsi C0CI2 ja krotonamidia vastaavasti 0,01 g ja 2 g litraa kohti kasvualustaa, ja seosta viljeltiin ravistuslaitteessa 28°C:Ssa. Viljelemistä jatkettiin lisäämällä kasvualustaan edelleen 0,2 % (w/v) krotonamidia (800 mg/400 ml) 30 tuntia ja 60 tuntia viljelyn aloittamisen jälkeen, ja pysäytettiin 80 tuntia viljelyn aloittamisen jälkeen.

Bakteerisolut kerättiin sentrifugoimalla kasvualusta kiihtyvyydellä 12 000 g 15 minuttia sentrifuugierottimella (Hitachi model SCR 20 B), pestiin 0,85 % Nacl:lla, sentrifugoitiin jälleen, ja suspendoitiin 40 ml jaan edellä kuvattua liuosta, pieni erä suspensiota otettiin näytteeksi ja käytettiin suspensiossa olevien bakteerisolujen kuivapainon mittaamiseen.

Soluja sisältävä suspensio (vastaten 2,33 mg:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml:aan reaktioliuosta, joka sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja 4,57 M 3-syanopyridiiniä, ja reaktion annettiin tapahtua 25°C:ssa yön yli lisäten reak-tioliuokseen 0,55 M ja 0,49 M 3-syanopyridiiniä, 3 ja 6 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta, tässä järjestyksessä. Muodostuneen nikotiiniamidin saanto oli 5,58 M 18 tunnin kuluttua reaktion alkamisesta. Sen mukaan konversio saavutti asteen 99,5 %, joka vastaa nikotiiniamidin akkumuloitumisen määrää 681 g. Tässä konsentraatiossa reaktiotuote kiteytyi tuloksena nikotiiniamidin kertymisestä.

Näin muodostunut nikotiiniamidi identifioitiin eristämällä tuote kiteinä ja analysoimalla se alkuaineanalyysillä, IRrllä, NMRjllä ja massaspektrometrialla. Nikotiinihappoa ei havaittu.

Esimerkki 3

Esimerkissä 2 saatu soluja sisältävä suspensio (vastaten 2,33 mg:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml:aan reaktioliuosta, joka 22 93858 sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja syanopyrat-siinia erilaisina konsentraatioina. Reaktio suoritettiin 25°C:ssa. Neljä moolia syanopyratsiinia muuttui pyratsiini-amidiksi 100 %:n konversiolla 6 tunnin reaktion jälkeen ja kuusi moolia syanopyratsiinia 9 tunnin reaktion jälkeen. Toisaalta, kun suspensio, joka sisältää bakteerisoluja määrän, joka vastaa 4,66 mg:aa kuivapainoa edellä kuvatun 2,33 mg:n kuivapainon sijasta, lisättiin samanlaiseen reaktioliuokseen (4 ml), 7 M syanopyratsiinia muuttui pyratsiiniamidiksi 100 %:n konversiolla 6 tunnin reaktion jälkeen ja 8 M syanopyratsiinia 9 tunnin reaktion jälkeen. Pyratsiinikarboksyylihapon tuotantoa ei todettu.

Pyratsiiniamidi kiteytyi liuoksesta, jossa se valmistettiin. Kiteinen saostuma kerättiin suoraan ja uudelleenkiteytettiin metanolista. Kiteet identifioitiin pyratsiiniamidiksi analysoimalla ne alkuaineanalyysillä, IR:llä, NMR:llä ja massaspektrometrialla .

Syanopyratsiinin, pyratsiiniamidin ja pyratsiinikarboksyylihapon analyysi suoritettiin HPLC:llä.

Sama analyysi kuin tässä esimerkissä suoritettiin myös seu-raavissa esimerkeissä.

Esimerkki 4

Esimerkissä 2 saatu bakteerisolujen suspensio (vastaten 4,66 g:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml:aan reaktioliuosta, joka sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja 3 M metak-rylonitriiliä, ja reaktio suoritettiin 25°C:ssa lisäten 3 M metakrylonitriiliä reaktioliuokseen 1 tunnin ja 3 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta, tässä järjestyksessä. 12 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta saatiin 9 M metakryyli-amidia 100 %:n konversiolla.

Ylläolevassa reaktiossa, kun 5 tuntia reaktion aloittamisen jälkeen lisättiin l M metakrylonitriiliä, saatiin 10 M metak-ryyliamidia 100 %:n konversiolla 24 tuntia reaktion aloitta- 23 93858 inisen jälkeen. 10 M:n konsentraatio vastaa sitä, että 851 g metakryyliamidia saatiin ja akkumuloitui 1 litraa kohti reak-tioliuosta.

Reaktioliuos laimennettiin vedellä ja bakteerisolut poistettiin sentrifugointikäsittelyllä (12 000 g 15 minuutin ajan). Soluton liuos konsentroitiin pyörivässä haihduttimessa ja kiteytettiin. Sitten kiteet liuotettiin ja uudelleenkiteytet-tiin vedestä, jolloin saatiin metakryyliamidikiteitä.

Esimerkki 5

Esimerkissä 2 saatu bakteerisolujen suspensio (vastaten 4,66 g:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml:aan reaktioliuosta, joka sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja 1 M kroto-nitriiliä, ja reaktio suoritettiin 25°C:ssa lisäten 1 M:n eriä krotonitriiliä reaktioliuokseen kaikkiaan viisi kertaa 1 tunnin välein reaktion aloittamisen jälkeen. 6 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta saatiin 6 M krotonamidia 100 %:n konversiolla. Kun reaktioliuokseen vielä lisättiin 1 M:n erät krotonitriiliä 6 tuntia ja 10 tuntia reaktion aloittamisen jälkeen, tässä järjestyksessä, syntyi 7 M ja 8 M krotonamidia 100 %:n konversiolla 10 tunnin ja 22 tunnin kuluttua, tässä järjestyksessä. 8 M:n konsentraatio vastaa sitä, että . 681 g krotonamidia saatiin ja akkumuloitui 1 litraan reaktio- liuosta .

Krotonamidin kiteytys suoritettiin samalla tavalla kuin esimerkissä 4.

Esimerkki 6

Esimerkissä 2 saatu bakteerisolujen suspensio (vastaten 4,66 g:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml;aan reaktioliuosta, joka sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja 3 M aseto-nitriiliä, ja reaktio suoritettiin 25°C:ssa lisäten 3 M:n eriä asetonitriiliä reaktioliuokseen l tunnin ja 3 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta ja 5 M asetonitriiliä 6 tuntia reaktion aloittamisen jälkeen. 12 tuntia reaktion aloittami- 93858 sesta saatiin 14 M asetamidia 100 %:n konversiolla. Toisin sanoen, 827 g asetamidia saatiin ja akkumuloitui l litraan reaktioliuosta.

Reaktioliuos laimennettiin vedellä ja sentrifugoitiin bakteerisolujen poistamiseksi. Supernatantti konsentroitiin kuiviin pyörivässä haihduttimessa, liuotettiin metanoliin ja kiteytettiin sitten metanolista, jolloin saatiin asetamidiki-teitä.

Esimerkki 7

Esimerkissä 2 saatu bakteerisolujen suspensio (vastaten 4,66 g:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml saan reaktioliuosta, joka sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja 3 M 3-hyd-roksipropionitriiliä, ja reaktio suoritettiin 25°C:ssa lisäten 3 M:n eriä 3-hydroksipropionitriiliä reaktioliuokseen kaikkiaan neljä kertaa 1 tunnin välein reaktion aloittamisen jälkeen. 5 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta saatiin 15 M 3-hydroksipropionamidia 100 %:n konversiolla. Kun reaktio-liuokseen lisättiin tässä vaiheessa vielä 3 M:n erä 3-hydroksipropionitriiliä, saatiin 18 M 3-hydroksipropionamidia 100 %:n konversiolla 11 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta. Tämä tarkoittaa sitä, että 1600 g 3-hydroksipropionamidia saatiin ja akkumuloitui 1 litraan reaktioliuosta.

Reaktioliuos laimennettiin vedellä ja sentrifugoitiin bakteerisolujen poistamiseksi. Soluton supernatantti konsetroitiin sitten pyörivässä haihduttimessa ja kiteytettiin -20°C:n lämpötilassa. Kiteet liuotettiin isopropanoliin ja uudelleenki-teytettiin tästä liuottimesta, jolloin saatiin 3-hydroksi-propionamidikiteitä.

Esimerkki 8 1 litran Sakaguchi-pulloon pantiin 400 ml kasvualustaa, joka sisälsi edellämainittua kasvualustaa C sisältäen C0CI2 sekä krotonamidia lisättynä määrinä 0,01 g ja 2 g litraa kohti kasvualustaa, tässä järjestyksessä, ja seosta viljeltiin 25 93858 ravistuslaitteessa 28°C:ssa. Viljelyä jatkettiin lisäten kasvualustaan vielä 0,2 % (w/v) krotonaraidia (800 mg/400 ml) 26 tuntia ja 56 tuntia viljelyn aloittamisen jälkeen, ja pysäytettiin 76 tuntia viljelyn aloittamisen jälkeen.

Bakteerisolut kerättiin sentrifugoimalla kasvualustaa kiihtyvyydellä 10 000 g 20 minuuttia sentrifuugierottimella (Hitachi malli SCR 20B), pestiin 0,85 % NaCl:lla, sentrifu-goitiin uudelleen, ja suspendoitiin 40 ml jaan edellä kuvattua liuosta, pieni erä suspensiota otettiin näytteeksi ja käytettiin suspensiossa olevien solujen kuivapainon mittaamiseen.

Soluja sisältävä suspensio (vastaten 2,96 mg:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml jaan reaktioliuosta, joka sisälsi 10 mM ka-liumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja 3-syanopyridiiniä eri kon-sentraatioina. Reaktio suoritettiin 25°C:ssa. 8 moolia 3-syanopyridiiniä muuttui nikotiiniamidiksi 100 %:n konversiolla 9 tunnin reaktion jälkeen, ja 9 moolia 3-syanopyridiiniä 22 tunnin reaktion jälkeen. Toisaalta, kun suspensio, joka sisältää bakteerisoluja määrän, joka vastaa 5,92 mgjn kuivapainoa edellä kuvatun 2,96 mgjn kuivapainon sijasta, lisättiin samanalaiseen reaktioseokseen (4 ml), 9 M 3-syanopyridiiniä muuttui nikotiiniamidiksi 100 %:n konversiolla 5 tunnin reaktion jälkeen, ja 12 M 3-syanopyridiiniä 9 tunnin reaktion jälkeen. Nikotiinihapon syntymistä ei todettu.

12 Mjn konsentraatio vastaa sitä, että 1465 g nikotiiniamidia saatiin ja akkumuloitui 1 litraa kohti reaktioseosta.

Nikotiiniamidi kiteytettiin liuoksesta, jossa se valmistettiin. Kiteet kerättiin ja uudelleenkiteytettiin metanolista.

Esimerkki 9

Esimerkissä 8 saatu bakteerisolujen suspensio (vastaten 5,92 g jaa kuivia soluja) lisättiin 4 ml jaan reaktioliuosta, joka sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja l M bentso-nitriiliä, ja reaktion annettiin tapahtua 26 93858 25°C:ssa lisäten l M bentsonitriiliä reaktioliuokseen l, 2, 3, 4, 5 ja 7 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta, vastaavasti. 24 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta saatiin 7 M (848 g/1) bentsamidia 100 %:n konversiolla.

Esimerkki 10

Esimerkissä 8 saatu bakteerisolujen suspensio (vastaten 5,92 g:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml jaan reaktioliuosta, joka sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8/0) ja 0,5 M 2,6-difluoribentsonitriiliä, ja reaktio suoritettiin 25°C:ssa lisäten 0,5 M 2,6-difluoribentsonitriiliä reaktioliuokseen 2, 4, 6 ja 8 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta, vastaavasti. 22 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta saatiin 2,5 M (393 g/1) 2,6-difluoribentsamidia 100 %:n konversiolla.

Esimerkki 11

Esimerkissä 8 saatu bakteerisolujen suspensio (vastaten 5,92 g:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml:aan reaktioliuosta, joka sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja 1 M 2-tio-feenikarbonitriiliä, ja reaktio suoritettiin 25°C:ssa lisäten 1 M 2-tiofeenikarbobentsonitriiliä reaktioliuokseen 1 tunti reaktion aloittamisen jälkeen. 5 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta saatiin 2 M (254 g/1) 2-tiofeenikarboksamidia 100 %:n konversiolla.

Esimerkki 12

Esimerkissä 8 saatu bakteerisolujen suspensio (vastaten 5,92 g:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml jaan reaktioliuosta, joka sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja 1 M 2-furo-nitriiliä, ja reaktio suoritettiin 25°C:ssa lisäten 1 M 2-fu-ronitriiliä reaktioliuokseen 1, 2, 4, 6, 8, 11 ja 23 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta, vastaavasti. 30 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta saatiin 8 M (888 g/1) 2-furaa-nikarboksamidia 100 %:n konversiolla.

93858 27

Esimerkki 13

Esimerkissä 8 saatu bakteersolujen suspensio (vastaten 5,92 g:aa kuivia soluja) lisättiin 4 ml:aan reaktioliuosta, joka 5 sisälsi 10 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 8,0) ja 4 H 3-indo-liasetonitriiliä, ja reaktio suoritettiin 25eC:ssa. 24 tunnin kuluttua reaktion aloittamisesta saatiin 4 M (697 g/1) 3-indo-liasetamidia 100 %:n konversiolla,

10 PATENTTIVAATIMUKSET

1. Menetelmä amidin valmistamiseksi mikrobiologisesti, jossa nitriili hydratoidaan vastaavaksi amidiksi nitriilihydrataasin sin vaikutuksella, tunnettu siitä, että käytetään 15 nitriilihydrataasia, joka on saatu viljelemällä Rhodococcus rhodochrous -kantaa J-l, FERM BP-1478, koboltti-ionin läsnäollessa, jota on kasvualustassa noin 5-15 mg CoCl2:na laskettuna litraa kohti kasvualustaa.

20 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä amidin tuottamiseksi mikrobiologisesti, tunnettu siitä, että nitriili on aromaattinen nitriili, jossa on 4-10 hiiliatomia aromaattisessa ytimessään.

25 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä amidin tuottamis- seksi mikrobiologisesti, tunnettu siitä, että aromaattinen amidi on valittu ryhmästä, johon kuuluvat: (O)-cn m

CN

35 TT

i ίΛΛί tII] r—tUj-*2 28 93858 jossa R1 ja R2, vastaavasti, ovat H, CH3, OH, OHC3, Cl, CN, NH2 tai N03; 5 QjQj-OI f1”)·'

X

10 fÖV™ 1IV1, jossa X on S tai O;

15 H

20

N

lVl1*

^ S

N

25 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä amidin tuottamiseksi mikrobiologisesti, tunnettu siitä, että aromaattinen nitriili on 2-syanopyridiini, 3-syanopyridiini tai 4-syanopyridiini.

30 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä amidin tuottamiseksi mikrobiologisesti, tunnettu siitä, että aromaattinen nitriili on syanopyratsiini.

35 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä amidin tuottamiseksi mikrobiologisesti, tunnettu siitä, että nitriili on alifaattinen nitriili, jossa on 2-6 hiiliatomia.

29 93858 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä amidin tuottamiseksi mikrobiologisesti, tunnettu siitä, että ali-faattinen 2-6 hiiliatomia sisältävä nitriili on akrylonitrii- li.