NO175489B

NO175489B - Fremgangsmåte til fremstilling av et amid

Info

Publication number: NO175489B
Application number: NO884114A
Authority: NO
Inventors: Hideaki Yamada; Toru Nagasawa
Original assignee: Hideaki Yamada; Nitto Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1987-09-18
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1994-07-11
Also published as: PL160904B1; HUT50215A; BR8804804A; EP0307926B1; FI884279A; HU204099B; BG48934A3; CN1015473B; PL161959B1; RO101578B; CA1298222C; JPH0655148B2; RU1838416C; DD274631A5; ATE85082T1; DE3877869D1; PT88540B; NO884114L; NO175489C; MX169933B

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av et amid, ved hydratasjon av et nitril. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen hydrolisering av et nitril for omdannelse av dette til det tilsvarende amid ved innvirkning av en nitrilhydratase som stammer fra en mikroorganisme.

Et lavere alifatisk amid, såsom akrylamid, fremstilles ved hydrolyse av et nitril, såsom akrylnitril, og det er foreslått mange fremgangsmåter for å hydrolysere ved innvirkning av enzymer, såsom nitrilase eller nitrilhydratase fremstilt av mikroorganismer (se f.eks. Japansk patentpublikasjon 21519/87, US-patentskrift 4.001.081, Japanske patentsøknader 162193/86 og 91189/87, EPC-patentpublikasjoner 0188316 og 0204555, Japanske patentpublikasjoner 17918/81 og 37951/84 samt US-patentskrifter 4.248.968 og 4.637.982. Slike fremgangsmåter til biologisk fremstilling av et amid har også vært benyttet kommersielt og har vakt oppmerksomhet som fordelaktige fremgangsmåter til fremstilling akrylamid.

Atskillige mikroorganismer er allerede blitt foreslått for fremgangsmåtene til biologisk fremstilling av amider. Men disse mikroorganismer har så langt en har kunnet påvise, ikke alltid vært effektive for hydrolyse av aromatiske nitriler selv om de er effektive for hydrolyse av lavere alifatiske nitriler. Således gir fremgangsmåten til fremstilling nikotinamid ved hydrolyse av 3-cyanopyridin for lavt utbytte til å kunne benyttes for kommer-sielle formål.

Det er kjent å dyrke mikroorganismer i nærvær av et jernion eller et manganion. Disse metoder benyttes også i fremgangsmåten til biologisk fremstilling av et amid, og eksempler på dyrking av mikroorganismer av slekten Rhodococcus i nærvær av et jernion er beskrevet i ovennevnte Japanske patentsøknader 162193/86 og 91189/87. Det vises også til US-patentskrift 4.629.700.

Som er resultat av den forskning som er utført i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse har det vist seg at et nitrilhydrolyseringsenzym, nitrilhydratase, som stammer fra en bakterie av slekten Pseudomonas, inneholder F<+++> i dens aktive senter, og nærværet av et jernion i et dyrkingsmedium er således viktig for dyrkingen av mikroorganismen. Følgelig antas det også når det gjelder mikroorganismen av slekten Rhodococcus i de kjente eksempler som beskrevet ovenfor, at jernionet i dyrkingsmediet for dyrking av mikroorganismen er vesentlig for dannelsen av et nitrilhydrolyseringsenzym.

Den foreliggende oppfinnelse er gjort på basis av de iakt-tagelser at en spesifikk stamme av slekten Rhodococcus, dvs. en stamme J-1 av arten rhodochrous, ikke danner nitrilhydratase i et jernionholdig dyrkingsmedium, at det er i et koboltionholdig dyrkingsmedium at stammen danner nitrilhydratase, og at nitrilhydratase som derved dannes kan anvende et aromatisk nitril som substrat slik at dette omdannes til amid.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til fremstilling av et amid er således kjennetegnet av at det anvendes en nitrilhydratase som oppnås ved dyrking av en mikroorganisme av stammen J-1, FERM BP-14 78 av arten Rhodococcus rhodochrous i nærvær av kobolt ioner i et dyrkningsmedium i en mengde på 5-15 mg pr. liter av dyrkningsmediet, regnet som CoCl2, og at nitrilet er

et aromatisk nitril med 4-10 karbonatomer i den eller de aromatiske ringer, valgt blant:

eller

et alifatisk nitril med 2-6 karbonatomer.

De foretrukne utførelser av fremgangsmåten ifølge o<p>pfinnelsen fremgår av krav 2-5.

Ifølge oppfinnelsen vil, selv om der er ingen nitrilhydra-taseaktivitet i et jernionholdig dyrkingsmedium, aktiviteten utvikles i et dyrkingsmedium som inneholder kobolt ion. Det er uventet at utviklingen av nitrilhydratase av denne spesifikke mikroorganisme er kritisk avhengig av typen metallion i dyrkingsmediet.

Ifølge oppfinnelsen kan dessuten hydratase av et aromatisk nitril utføres på fordelaktig måte. Virkningen av oppfinnelsen er nyttig på grunn av viktigheten til nikotinamid, som er hydrolyseproduktet av 3-cyanopyridin, som et råmateriale for vitaminsyn-tese, eller av pyrazinamid, som er hydrolyseproduktet av cyanopyrazin, nyttig som en tuberkulostat. 1. Noen generelle betraktninger vedrørende en fremgangsmåte til biologisk fremstilling av et amid.

Ved fremgagnsmåten ifølge den foreliggende- oppfinnelse hydrataseres som nevnt innledningsvis et nitril til et tilsvarende amid ved innvirkning av en nitrilhydratase som stammer fra en mikroorganisme. Fremgangsmåten omfatter dyrking av mikroorganismen, innføring av en nitrilhydratase og innvirkning av den derved oppnådde nitrilhydratase på et substratnitril.

Disse trinn er i og for seg kjent som enhetsoperasjoner og benyttes i egnet form i den foreliggende oppfinnelse. Ved angivelsen "nitrilhydratase oppnås ved dyrking av en mikroorganisme i nærvær av et koboltion" tas innføringen av en nitrilhydratase som en naturlig forutsetning.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter en ny utførelsesform eller variant for å bringe nitrilhydratasen til å virke på nitrilet. En slik utførelsesform innbefatter oppsamling av et enzym som er dannet av en mikroorganisme og anvendelse av enzymet som et enzympreparat. Denne måte å anvende nitrilhydratasen på, hvorved enzymet anvendes som et enzympreparat skal forstås slik at det er innenfor rammen av fremgangsmåten til biologisk fremstilling ifølge oppfinnelsen.

2. Detaljer ved hydrolysereaksjonen.

1) Mikroorganisme

Mikroorganismen som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse er en mikroorganisme av arten Rhodococcus rhodochrous.

Sn representativ stamme av denne art er stammen J-1.

Detaljer for stammen J-1 er følgende:

(1) Opprinnelse og deponering.

Stammen J-1 ble innsamlet fra jorden i Sakyo-ku i Kyoto, Japan, og deponert som en internasjonal deponering (under Budapestkonvensjonen for internasjonal deponering av mikroorganismer for patentformål) i Fermentation Research Institute, Japan, Agency of Industrial Sciences and Technology med akse-sjonsnummeret FERM BP-1478.

(2) Bakteriologisk egenskaper,

(a) Morfologi

Som et resultat av klassifisering av de ovenfor beskrevne bakteriologiske egenskaper i lys av Bergy's "Manual of Systematic Bacteriology" er stammen J-1 en aerob, grampositiv, svakt syre-fast, katalasepositiv og ikke-endosporedannende basill, som ikke vil danne flimmertråder. Den har også form av en langstrakt basill som et mycelium i begynnelsesstadiet av veksten, vokser med forgrening og deles deretter i korte basiller. Av den grunn anses den ikke for å høre til en bakterie av en Nocardia-type.

Analysen av fettsyresammensetningen viser at bakterien inneholder umettede og mettede, uforgrenete fettsyrer som inneholder tuberkulostearinsyre. Tynnsjiktsanalysen av mycolinsyre gir én eneste flekk som har samme Rf-verdi som standardbakterien Rodococcus rhodochrous (IFO 3338) og er således forskjellig fra stammen Mycobacterium. Den er også forskjellig fra stammen Nocardia som følge av sammensetningen (antall karbonatomer) i mycolinsyre. Som resultat av undersøkelse av andre biokjemiske egenskaper gjenkjennes bakterien som en Rhodococcus rhodochrous.

Mikroorganismer er tilbøyelig til å gjennomgå mutasjon. Følgelig er det unødvendig å si at bakterien, selv om den er en mutant av en kompetent stamme, såsom stammen J-1, kan anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen så lenge produktet fra dyrkingen av den danner nitrilhydratase i nærvær av et koboltion.

2) Substrat/nitril

Nitriler som kan anvendes som substrat for nitrilhydratase fremstilt av mikroorgansimen som er beskrevet ovenfor er aromatiske og alifatiske mononitriler eller dinitriler, særlig mononitriler.

De nitriler som anvendes ifølge oppfinnelsen er som nevnt foran aromatiske nitriler^ som har 4-10 karbonatomer som danner den aromatiske ring. Typiske eksempler på aromatiske nitriler er de forbindelser som er representert ved de følgende generelle formler (I-IV):

Typiske eksempler på disse er 4-, 3- og 2-cyanopyridiner.

hvor R<1> og R<2> er H, CH3, OH, 0CH3, F, Cl, CN, NH2 eller N02.

Typiske eksempler på disse er benzonitril, o-, m- og p-klorbenzonitriler, o- og m-nitrobenzonitriler, p-aminobenzo-nitril, o-, m- og p-tolunitriler, 4-cyanofenol, anisnitril, ftalonitril, isoftalonitril, tereftalonitril, 2,6-diklorbenzonitril samt 2,4-diklorbenzonitril.

Typiske eksempler på disse er - og -naftonitriler.

hvor X er S eller 0.

Typiske eksempler på disse er 2-tiofenkarbonitril og 2-furonitril.

Typisk eksempel på disse er 5-cyanoindol.

Det typiske eksempel på disse er cyanopyrazin.

En annen gruppe nitriler som kan anvendes ifølge oppfinnelsen er alifatiske nitriler med 2-6 karbonatomer, fortrinnsvis mono- eller dinitriler, og helst mononitriler. Bedømt ut fra anvendbarheten til de amider som skal fremstilles er akrylnitril typisk og har en god produserbarhet.

Amidene som tilsvarer disse nitriler er de som oppnås ved omdannelse av CN-gruppen i nitrilene til en CONI^-gruppe.

Når det gjelder dinitrilene er det de tilsvarende amider som oppnås ved omdannelse av minst én av CN-gruppene til en CONH2~gru<p>pe.

3) Dyrking/fremstilling av nitrilhydratase

Dyrkingen av en mikroorganisme av arten Rhodococcus rhodochrous kan utføres under alle egnete betingelser under forutsetning av at et koboltion foreligger i et dyrkingsmedium. Det kan være vanlig praksis å innføre en substans som vil bevirke enzyminduksjon og som vil bli beskrevet i detalj nedenfor i et dyrkingsmedium, slik at nitrilhydratasen akkumuleres i bakteriecellene .

(1) Basalmedium

Eksempler på egnete dyrkningsmedier er angitt nedenfor. Fagfolk på området kan lettvint variere mengdene av de nedenfor angitte bestanddeler, skifte ut en bestanddel med en annen og fjerne én eller flere bestanddeler eller tilsette én eller flere andre bestanddeler.

(i) Dyrkingsmedium A

(2) Enzyminduserende substans

Enzyminduserende substanser for induksjon og produksjon av nitrilhydratase i en mikroorganisme Rhodococcus rhodochrous kan være enhver som er egnet for formålet.

Typiske induserende substanser som er egnet for den foreliggende oppfinnelse er nitril og amider.

Eksempler på enzyminduserende substanser hvis virkning er blitt bekreftet for stammen J-1 er følgende: Krotonamid, acetonitril, propionitril, benzamid, propion-amid, acetamid, isovaleronitril, n-butyronitril, isobutyronitril, n-kapronitril, 3-pentennitril, pivalonitril, n-butyramid, iso-butyramid, n-valeramid, n-kapronamid, metakrylåmid og fenylacet-amid.

(3) Koboltionkilde

Nitrilhydratase oppnås ikke selv om en enzyminduserende substans som er beskrevet ovenfor er tilstede i et dyrkingsmedium, slik at det er vesentlig ifølge oppfinnelsen at et kobolt ion er tilstede i dyrkingsmediet.

Idet dyrkingsmediet er vandig dannes vanligvis koboltionet ved tilsetning av en vannløselig koboltforbindelse til dyrkingsmediet. De vannløselige koboltforbindelser er beskrevet i kjemisk litteratur, og det vil derved være lettvint for fagfolk på området å velge og anvende en egnet forbindelse (i noen tilfeller ved å utføre en enkel preliminær test). Typiske koboltforbindelser er de som vil gi Co' eller Co , særlig de som vil gi Co , og spesielle eksempler på disse er koboltklorid, koboltsulfat, koboltacetat, koboltbromid, koboltborat eller lignende. Vitamin B12 og metallisk kobolt er andre eksempler på koboltforbindelsene idet disse in situ danner et koboltion i dyrkingsmediet ved ioni-sering eller oksidativt angrep av mikroorganismene under dyrkingen.

(4) Dyrking

Dyrking for å fremstille og akkumulere nitrilhydratase i bakteriecellen kan utføres ved dyrking av mikroorganismen som anvendes, f.eks. stammen J-1, i et av de ovenfor beskrevne dyrkingsmedier, under egnede betingelser.

Mengden enzyminduserende substans som anvendes er i stør-relsesorden 2-6 g per liter dyrkingsmedium, og mengden koboltion er i størrelsesorden 5-15 mg per liter av dyrkingsmediet, egnet som CoCl2.

Spesielle eksempler på sammensetning av dyrkingsmediet er følgende:

Nitrilhydratasen kan med fordel fremstilles ved ryste-dyrking av stammen J-1 ved en temperatur på fra 15 til 50°C, fortrinnsvis fra 20 til 45°C, helst rundt 30°C, ved pH 7-9 i ca. 30 timer eller mer, fortrinnsvis 40 timer eller mer (med en øvre grense på f.eks. 120 timer). Den enzyminduserende substans bør fortrinnsvis være tilstede fra begynnelsesstadiet av dyrkingen, og det er ønskelig for fremstilling av bakterieceller å ha-en høy aktivitet for å supplere en induserende substans. Når ryste-dyrking skal utføres ved 28°C i 76 timer tilsettes det f.eks. en ytterligere mengde krotonamid henholdsvis 26 timer og 56 timer etter begynnelsen av reaksjonen, slik at konsentrasjonen er 0,2% vekt/volum på hvert tidspunkt.

4) Hydratasjon av nitril

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til fremstilling av et amid ved hydratasjon av et nitril til et tilsvarende amid ved innvirkning av en nitrilhydratase som stammer fra en mikroorganisme omfatter som beskrevet ovenfor forskjellige måter til å bringe nitrilhydratasen til å virke på nitrilet.

En av disse måter er å fremstille et amid i et dyrkingsmedium mens et substratnitril er nærværende i et dyrkingsmedium av en mikroorganisme.

En annen måte til å bringe nitrilhydratasen til å virke på dens substrat er å tilsette et substratnitril til et dyrkingsmedium hvori en nitrilhydratase er blitt opphopet for å utføre hydrolysereaksjonen. En variasjon av denne utførelsesform er å anvende et dyrkingsmedium hvori cellene av mikroorganismen er nedbrutt som dyrkingsmedium hvori en nitrilhydratase er opphopet.

En ytterligere måte til å bringe nitrilhydratasen til å innvirke på dens substrat på er å isolere cellene hvori nitrilhydratasen er blitt opphopet fra et dyrkingsmedium, fortrinnsvis å anbringe cellene på en egnet bærer eller å "immobilisere" dem og deretter å bringe dem i kontakt med et substrat. Denne fremgangsmåte, særlig den foretrukne utførelsesform hvor de immobiliserte celler anvendes, anses for å være egnet for industriell ut-nyttelse like godt eller mer foretrukket enn den andre måte som er beskrevet ovenfor. Denne metode hvor immobiliserte celler anvendes er velkjent på området når det gjelder typen bærer, fremgangsmåten for immobilisering av mikroorganismen i en bærer og anvendelsen av den immobiliserte mikroorganisme i en såkalt bio-reaktor.

En annen måte for nitrilhydratasen å virke- på dens substrat på er metoden hvor et enzympreparat av en nitrilhydratase fremstilles og et nitril hydrolyseres av enzympreparatet på en heller ikke-biologisk måte. Det er ikke nødvendig å si at hydrolysereaksjonen på denne måte bør utføres under slike pH- og temperaturbe-tingelser at enzymaktiviteten ikke vil gå tapt. Slike betingelser kan sies å være de samme som de som foreligger med den ovenfor beskrevne "biologiske måte". Som beskrevet ovenfor betraktes også den måte hvor mikroorganismene ikke foreligger under innvirk-ningen av enzymet også som en biologisk fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen .

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det egnete pH-område for nitrilhydratasen fra 7 til 9 med optimal pH på 8,0. Dersom reaksjonsløsningen viser en pH på mindre enn 7 synker enzymets aktivitet brått. Følgelig er det ønskelig å tilsette en buffer til reaksjonsløsningen. Selv om en vilkårlig buffer, såsom kaliumfosfatbuffer, en Tris/HCl-buffer, en HEPES/KOH-buffer eller en natriumboratbuffer anvendes vil enzymaktiviteten til nitrilhydratasen ikke variere.

Konsentrasjonen av et substrat i et dyrkingsmedium eller i en hydrolysereaksjonsløsning er vanligvis i området 4-7 mol/ liter, og reaksjonstemperaturen er vanligvis i området 10-30°C.

3. Eksempler

Fremgangsmåten til måling av aktiviteten for en nitrilhydratase og enheten for aktiviteten i de etterfølgende eksempler er definert som følger: (1) Fremgangsmåte til måling av aktiviteten for en nitrilhydratase

En nitrilhydratases aktivitet måles ved utførelse av reaksjonen med 2 ml av en reaksjonsblanding som inneholder 10 mM benzonitril 30 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0) og en viss mengde av cellen av en mikroorganisme (isolert fra et dyrkingsmedium) ved 10°C i 5 minutter og tilsette 2 ml 1H HC1 for å stoppe reaksjonen .

(2) Definisjon av enhet

1 enhet (U) av nitrilhydrataseaktiviteten defineres som den mengde enzym som er nødvendig for å fremstille benzamid fra benzonitril under de ovenfor beskrevne betingelser med en hastig-het på 1 umol/min.

Referanseeksempel 1

J-l-stammen ble dyrket under anvendelse av et dyrkingsmedium hvis sammensetning er angitt nedenfor under dyrkingsbe-tingelser som også er angitt nedenfor, og nitrilhydrataseaktiviteten ble bestemt ved tilsetning CoC^ og/eller FeSO^ til dyrkingsmediet under dyrkingen.

(i) Dyrkingsmediets sammensetning

De oppnådde resultater er vist nedenfor.

Det fremgår at nitrilhydrataseaktiviteten ikke vil utvikles selv om FeSO^ tilsettes til mediet. Nitrilhydrataseaktiviteten utvikles ved tilsetning av CoC^, og tilsetning av FeS04 til systemet som C0CI2 er blitt tilsatt til vil påvirke resultatene ugunstig.

<*>1: Mengde celler, regnet av tørrvekten.- ;<*>2: U: Enhet for aktivitet ifølge definisjonen som angitt ovenfor, og mengden celler er basert på tørrvekten.

Referanseeksempel 2

Virkningene av forskjellige nitriler eller amider som enzyminduserende substans på stammen J-1 er angitt i tabellen nedenfor.

Resultatene som angitt i tabellen er de resultater som ble oppnådd ved preliminær dyrking av stammen J-1 i det ovenfor angitte dyrkingsmedium B ved 28°C under tilsetning av et nitril eller et amid som induserende substans i en mengde på henholdsvis 0,1% volum/volum eller 0,2% vekt/volum, når stammen er blitt dannet tilstrekkelig ved celledeling, og videre inokulering av stammen i det ovennevnte dyrkingsmedium C hvortil det er blitt tilsatt 0,001% vekt/volum CoC^ for å gjennomføre dyrking i fra 36 til 48 timer.

Eksempel 1

Cellen av stammen J-1, som var oppnådd ved dyrking av stammen i et dyrkingsmedium som omfattet det ovennevente dyrkingsmedium C, som inneholdt CoCl2 og hvortil det var tilsatt krotonamid i mengder på henholdsvis 0,01 g og 2 g per liter av mediet ble omsatt med forskjellige nitriler som ble anvendt som substratet. Reaksjonen ble utført under anvendelse av 2 ml reak-sjonsløsning, som omfattet cellene som var oppnådd fra 2 ml av kulturen, 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og 200 mM av substratet, ved 25°C i 7 6 timer. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 0,2 ml IN HC1. Nitrilhydrataseaktivitetene for de respek-tive substrater er angitt som forholdene mellom reaksjonsproduktet eller den medgåtte mengde substrat, målt ved høytrykksvæske-kromatografi og nitrilhydrataseaktiviteten målt med 3-cyanopyridin som substrat, noe som er den spesifikke aktivitet i prosent.

Resultatene er angitt nedenfor.

Eksempel 2

I en 1-liter Sakaguchi-kolbe ble det anbrakt 400 ml av et dyrkingsmedium som omfattet det ovennevnte dyrkingsmedium C, som inneholdt tilsatt C0CI2 og krotonamid i mengder på henholdsvis 0,01 g og 2 g per liter av mediet, og blandingen ble dyrket i et rysteapparat ved 28°C. Dyrking ble fortsatt med ytterligere tilsetning til dyrkingsmediet av 0,2% vekt/volum krotonamid (800 mg/400 ml) 30 timer og 60 timer etter begynnelsen av dyrkingen og ble stoppet 80 timer etter begynnelsen av dyrkingen.

Bakteriecellene ble oppsamlet ved sentrifugering av dyrkingsmediet ved 12.000 g i 15 minutter med en sentrifugalseparator (Hitachi modell SCR 20 B), vasket med 0,85% NaCl, sentrifugert igjen og suspendert i 40 ml av den ovenfor beskrevne løsning. En liten del av suspensjonen ble tatt som prøve og anvendt for måling av tørrvekt av bakteriecellene i suspensjonen.

Den celleholdige suspensjon (tilsvarende 2,33 mg tørre celler) ble tilsatt til 4 ml av reaksjonsløsningen som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og 4,57 M 3-cyanopyridin, og reaksjonen ble utført ved 25°C natten over under tilsetning til reaksjonsblandingen av 0,55 M og 0,49 M 3-cyanopyridin henholdsvis 3 og 6 timer etter begynnelsen av reaksjonen. Utbyttet av nikotinamid var 5,58 M etter 18 timer fra begynnelsen av reaksjonen. Følgelig nådde omdannelsen 99,5%, noe som tilsvarte dannelse av nikotinamid i en mengde på 681 g. Ved denne konsen-trasjon ble reaksjonsproduktet fast som resultat av utfellingen av nikotinamidet.

Det derved dannede nikotinamid ble identifisert ved iso-lering av produktet som krystaller og analysering av det ved elementæranalyse, IR, NMR og massespektrometri. Nikotinsyre ble ikke påvist.

Eksempel 3

Den celleholdige suspensjon (med et innhold av 2,33 mg tørre celler) oppnådd i eksempel 2 ble tilsatt til 4 ml av reak-sjonsløsningen som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og cyanopyrazin i forskjellige konsentrasjoner. Reaksjonen ble ut-ført ved 25°C. 4 mol cyanopyrazin ble omdannet til pyrazinamid ved en omdannelse på 100% etter 6 timers reaksjon, og 6 mol cyanopyrazin etter 9 timers reaksjon. Ved en tilsetning av en suspensjon som inneholdt bakteriecellene i en mengde som tilsvarte 4,66 mg tørrvekt istedenfor 2,33 mg tørrvekt som beskrevet ovenfor til en tilsvarende reaksjonsløsning (4 ml), ble 7 M cyanopyrazin omdannet til pyrazinamid med en omdannelse på 100% etter 6 timers reaksjon, og 8 M cyanopyrazin etter 9 timers reaksjon. Dannelse av pyrazinkarboksylsyre ble ikke iakttatt. •

Pyrazinamidet ble krystallisert fra løsningen når~det ble dannet. Det krystallinske bunnfall ble oppsamlet direkte og rekrystallisert fra metanol. Krystallene ble identifisert som pyrazinamid ved å analysere dem ved elementæranalyse, IR, NMR og massespektrometri.

Analyse av cyanopyrazin, pyrazinamid og pyrazinkarboksylsyre ble utført ved hjelp av væskekromatografi.

Samme analyse som i dette eksempel ble også utført i de etterfølgende eksempler.

Eksempel 4

Suspensjonen av bakterieceller (som svarte til 4,66 mg tørre celler) og som ble oppnådd i eksempel 2, ble tilsatt til 4 ml av reaksjonsløsningen som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og 3 M metakrylnitril, og reaksjonen ble utført ved 25°C med tilsetning av 3 M metakrylnitril til reaksjonsløsningen etter henholdsvis 1 time og 3 timer fra begynnelsen av reaksjonen. Etter 12 timer fra begynnelsen av reaksjonen var det dannet 9 M metakrylamid med 100% omdannelse.

Ved tilsetning av 1 M metakrylnitril 5 timer etter begynnelsen av reaksjonen ble i reaksjonen ovenfor 10 M metakrylamid dannet med en omdannelse på 100% 24 timer etter begynnelsen av reaksjonen. Konsentrasjonen 10 M svarer til at 851 g metakrylamid dannes og akkumuleres per 1 liter reaksjonsløsning.

Reaksjonsløsningen ble tynnet med vann, og bakteriecellene ble fjernet ved sentrifugalbehandling (ved 12.000 g i 15 minutter). Den cellefrie løsning ble konsentrert på en rotasjonsfordamper og krystallisert. Deretter ble krystallene løst i og rekrystallisert fra vann for å oppnå krystallene av metakrylamid.

Eksempel 5

Suspensjonen av bakterieceller (tilsvarende 4,66 mg tørre celler) oppnådd i eksempel 2 ble tilsatt til 4 ml av reaksjons-løsningen som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og 1 M krotonnitril, og reaksjonen ble utført ved 25°C under tilsetning av 1 M porsjoner av metakrylnitril til reaksjonsløsningen fem ganger totalt med intervaller på 1 time etter begynnelsen av reaksjonen. Etter 6 timer fra begynnelsen av reaksjonen var 6 M krotonamid dannet med en omdannelse på 100%. Ved tilsetning av ytterligere 1 M porsjoner krotonnitril til reaksjonsløsningen etter henholdsvis 6 og 10 timer fra begynnelsen av reaksjonen, ble 7 M og 8 M krotonamid dannet med en omdannelse på 100% etter henholdsvis 10 timer og 22 timer. Konsentrasjonen 8 M svarer til at 681 g krotonamid ble dannet og akkumulert per liter av reak-sjonsløsningen.

Krystallisasjonen av krotonamid ble utført på samme måte som i eksempel 4.

Eksempel 6

Suspensjonen av bakterieceller (tilsvarende 4,66 mg tørre celler) oppnådd i eksempel 2 ble tilsatt til 4 ml av reaksjons-løsningen som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og 3 M acetonitril, og reaksjonen ble utført ved 25°C under tilsetning av 3 M porsjoner acetonitril til reaksjonsløsningen 1 time og 3 timer etter begynnelsen av reaksjonen og 5 M acetonitril 6 timer etter begynnelsen av reaksjonen. 12 timer etter begynnelsen av reaksjonen var 14 M acetamid dannet med en omdannelse på 100%. Med andre ord var 82 7 g acetamid dannet og akkumulert per liter reaksjonsløsning.

Reaksjonsløsningen ble tynnet med vann og underkastet sen-trif ugalbehandl ing for fjerning av bakteriecellene. Supernatanten ble konsentrert til tørr tilstand på en rotasjonsfordamper, løst i metanol og deretter krystallisert fra metanol for å oppnå krystallene av acetamid.

Eksempel 7

Suspensjonen av bakterieceller (tilsvarende 4,66 mg tørre celler) oppnådd i eksempel 2 ble tilsatt til 4 ml av reaksjons-løsningen som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og 3 M 3-hydroksypropionitril, og reaksjonen ble utført ved 25°C under tilsetning av 3 M porsjoner av 3-hydroksypropionitril til reak-sjonsløsningen fire ganger totalt med intervaller på 1 time etter begynnelsen av reaksjonen. Etter 5 timer fra begynnelsen av reaksjonen var 15 M 3-hydroksypropionamid dannet med en omdannelse på 100%. Ved tilsetning av ytterligere 3 M porsjoner av 3-hydroksypropionitril til reaksjonsløsningen på dette stadium ble 18 M 3-hydroksypropionamid dannet med en omdannelse på 100% 11 timer fra begynnelsen av reaksjonen. Dette betyr at 1600 g 3-hydroksypropionamid ble dannet og akkumulert per liter av reaksjons-løsningen.

Reaksjonsløsningen ble tynnet med vann og sentrifugalbe-handlet for å fjerne bakteriecellene. Den cellefrie supernatant ble deretter konsentrert på en rotasjonsfordamper og krystallisert ved en temperatur på -20°C. Krystallene ble løst i isopropa-nol og rekrystallisert fra løsningsmidlet for å oppnå krystallene av 3-hydroksypropionamid.

Eksempel 8

I en 1-liter Sakaguchi-kolbe ble det anbrakt 400 ml av et dyrkingsmedium som omfattet det ovenfor beskrevne dyrkingsmedium C som var tilsatt CoC^ og krotonamid i mengder på henholdsvis 0,01 g og 2 g per liter medium, og blandingen ble dyrket i et rysteapparat ved 28°C. Dyrking ble fortsatt med ytterligere tilsetning til dyrkingsmediet av 0,2% vekt/volum krotonamid (800 mg/400 ml) 26 timer og 56 timer etter begynnelsen av dyrkingen, og dyrkingen ble stoppet 76 timer etter begynnelsen.

Bakteriecellene ble oppsamlet ved sentrifugering av dyrkingsmediet ved 10.000 g i 20 minutter med en sentrifugalseparator (Hitachi modell SCR 20B), og vasket med 0,85 NaCl, sentrifugert igjen og suspendert i 40 ml av den ovenfor beskrevne løs-ning. En liten prøve av reaksjonen ble tatt og anvendt for måling av tørrvekten av bakteriecellene i suspensjonen.

Den celleholdige suspensjon (tilsvarende 2,96 mg tørre celler) ble tilsatt til 4 ml av reaksjonsløsning som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og 3-cyanopyridin i forskjellige konsentrasjoner. Reaksjonen ble utført ved 25°C. 8 mol 3-cyanopyridin ble omdannet til nikotinamid med en omdannelse på 100% etter 9 timers reaksjon, og 9 mol 3-cyanopyridin etter 22 timers reaksjon. Ved tilsetning av en suspensjon som inneholder bakteriecellene i en mengde som tilsvarer 5,92 mg tørrvekt istedenfor 2,96 mg tørrvekt som beskrevet ovenfor til tilsvarende reak-sjonsløsning (4 ml), ble 9 M 3-cyanopyridin omdannet til nikotinamid med en omdannelse på 100% etter en 5 timers reaksjon, og 12 M 3-cyanopyridin etter en 9 timers reaksjon. Dannelse av nikotinsyre ble ikke iakttatt.

Konsentrasjonen 12 M svarer til at 1.465 g nikotinamid ble dannet og akkumulert per liter reaksjonsløsning.

Nikotinamidet ble krystallisert fra løsningen hvor det ble dannet. Krystallene ble oppsamlet og rekrystallisert fra metanol.

Eksempel 9

Suspensjonen av bakteriecellene (tilsvarende 5,92 mg tørre celler) oppnådd i eksempel 8 ble tilsatt til 4 ml av en reak-sjonsløsning som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) dg 1 M benzonitril, og reaksjonen ble utført ved 25°C under tilsetning av 1 M benzonitril til reaksjonsløsningen etter henholdsvis 1, 2, 3, 4, 5 og 7 timer fra begynnelsen av reaksjonen. 24 timer etter begynnelsen av reaksjonen var 7 M (848 g/l) benzamid dannet med 100% omdannelse.

Eksempel 10

Suspensjonen av bakterieceller (tilsvarende 5,92 mg tørre celler) oppnådd i eksempel 8 ble tilsatt til 4 ml av en reak-s"jonsløsning som inneholdt 10 mM kaliumf osf atbuf f er (pH 8,0) og 0,5 M 2,6-difluorbenzonitril, og reaksjonen ble utført ved 25°C under tilsetning av 0,5 M 2,6-difluorbenzonitril til reaksjons-løsningen etter henholdsvis 2, 4, 6 og 8 timer fra begynnelsen av reaksjonen. Etter 22 timer fra begynnelsen av reaksjonen, 2,5 M (3 93 g/l) 2,6-difluorbenzmid ble dannet med en omdannelse på 100%.

Eksempel 11

Suspensjonen av bakterieceller (tilsvarende 5,92 mg tørre celler) oppnådd i eksempel 8 ble tilsatt til 4 ml av en reak-sjonsløsning som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og 1 M 2-tiofenkarbonitril, og reaksjonen ble utført ved 25°C under tilsetning av 1 M 2-tiofenkarbonitril til reaksjonsløsningen 1 time etter begynnelsen av reaksjonen. Etter 5 timer fra begynnelsen av reaksjonen var 2 M (254 g/l) 2-tiofenkarboksamid dannet med en omdannelse på 100%.

Eksempel 12

Suspensjonen av bakterieceller (tilsvarende 5,92 mg tørre celler) oppnådd i eksempel 8 ble tilsatt til 4 ml av en reak-sjonsløsning som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og 1 M 2-furonitril, og reaksjonen ble utført ved 25°C under tilsetning av 1 M 2-furonitril til reaksjonsløsningen henholdsvis 1, 2, 4, 6, 8, 11 og 23 timer etter begynnelsen av reaksjonen. Etter 30 timer fra begynnelsen av reaksjonen var 8 M (888 g/l) 2-furan-karboksamid dannet med en omdannelse på 100%.

Eksempel 13

Suspensjonen av bakterieceller (tilsvarende 5,92 mg tørre celler) oppnådd i eksempel 8 ble tilsatt til 4 ml av en reak-sjonsløsning som inneholdt 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 8,0) og 4 M 3-indolacetonitril, og reaksjonen ble utført ved 25°C. 24 timer etter begynnelsen av reaksjonen var 4 M (697 g/l) 3-indolacetamid dannet med en omdannelse på 100%.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et amid, ved hydratasjon av et nitril, karakterisert ved at det anvendes en nitrilhydratase som oppnås ved dyrking av en mikroorganisme av stammen J-1, FERM BP-1478 av arten Rhodococcus rhodochrous i nærvær av koboltioner i et dyrkningsmedium i en mengde på 5-15 mg pr. liter av dyrkningsmediet, regnet som CoC^, og at nitrilet er et aromatisk nitril med 4-10 karbonatomer i den eller de aromatiske ringer, valgt blant: et alifatisk nitril med 2-6 karbonatomer.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det aromatiske nitril er 2-cyanopyridin, 3-cyanopyridin eller 4-cyanopyridin.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 2, karakterisert ved at det aromatiske nitril er 3-cyanopyridin.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det aromatiske nitril er cyanopyrazin.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det alifatiske nitril er akrylnitril.