PT88540B - Processo para a producao de amidas por via biologica - Google Patents

Processo para a producao de amidas por via biologica Download PDF

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Description

BASE DA INVENÇÃO
Domínio da Técnica
A presente invenção refere-se a um pro cesso para hidratar um nitrilo convertendo-o deste modo numa ami da correspondente pela acção de uma hidratase de nitrilo origina da num microorganismo. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um processo para a produção biológica de uma amida caracterizado pelo microorganismo utilizado e a um método para produzir hidratase de nitrilo.
Técnica Antecedente * Uma amida alifática inferior, tal como • acrilamida, ê produzida através da hidratação de um nitrilo, tal
ΆΤ
Ί como acrilonitrilo, e têm sido propostos muitos métodos de hidra tação através da acção de enzimas, tais como nitrilase ou hidratase de nitrilo produzidas por microorganismos (ver, por exemplo^ publicação de Patente Japonesa N9. 21519/87, Patente U.S. N9.
001 081; Pedidos de Patentes Japonesas publicados sem exame N9s. 162193/86 e 91189/87, EPC N9s. 0188316 e 0204555; e Publica ções de Patentes Japonesas N9s. 17918/81 e 37951/84, Patente U.
S. N9s. 4 248 968 e 4 637 982). Estes métodos para a produção biológica de uma amida têm sido igualmente utilizados comercialmente e têm chamado a atenção como sendo processos vantajosos pa ra produzir acrilamida.
Vários microorganismos foram já proposi tos como os utilizados para o processo para produção biológica de uma amida. No entanto, atê onde os presentes inventores pesquisaram, estes microoganismos, embora sejam eficazes na hidrata ção de nitrilos alifáticos inferiores, nem sempre o são na hidra tação de nitrilos aromáticos. Deste modo, o método para produzir nicotinamida através da hidratação de 3-cianopiridina mostra um rendimento demasiadamente baixo para fins comerciais.
Conhece-se a técnica anterior para levar a cabo a cultura de microorganismo na presença de um ião de ferro ou de um ião de manganês. Esta técnica ê igualmente utilizada no processo para a produção biológica de uma amida, e foram divulgados exemplos para a cultura dos microorganismos do gênero Rhodococcus na presença de um ião de ferro nos Pedidos de Patentes Japonesas publicados sem exame N9s. 162193/86 e 91189/87.
Como resultado da investigação conduzi da pelos presentes inventores, constatou-se que uma enzima de hi dratação de nitrilo, isto ê, uma hidratase de nitrilo, originada - +++ numa bactéria do genero Pseudomonas contem Fe no seu centro activo e assim a presença de um ião de ferro no meio de cultura é essencial para a cultura do microorganismo. Portanto, presume-se igualmente no caso do microorganismo do gênero Rhodococcus, nos exemplos conhecidos acima descritos, que um ião de ferro no meio de cultura para cultivar o microorganismo ê essencial para a produção de uma enzima de hidratação de nitrilo.
RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção foi elaborada tendo por base a constatação de que uma estirpe específica do gênero Rhodococcus, isto q, uma estirpe J-l da espécie rhodochrous não produz hidratase de nitrilo num meio de cultura contendo um ião de ferro e ê um meio de cultura contendo um ião de cobalto que a estirpe produz hidratase de nitrilo; e que a hidratase de nitrilo assim produzida pode utilizar um nitrilo aromático como um substrato de modo a ser transformado numa amida.
Consequentemente, o processo para produzir uma amida, de acordo com a presente invenção, ê um processo para a produção biológica de uma amida em que um nitrilo ê hi dratado numa amida correspondente pela acção de uma hidratase de nitrilo originada num microorganismo, caracterizado por a referi da hidratase de nitrilo ser obtida por cultura de um microorganismo da espécie Rhodococcus rhodochrous na presença de um ião de cobalto.
De acordo com a presente invenção, embora a actividade de hidratase de nitrilo seja nula num meio de cultura contendo um ião de ferro, a actividade desenvolver-se-ã num meio de cultura que contenha um ião de cobalto. Seria considerado inesperado que o desenvolvimento de hidratase de nitrilo deste microorganismo específico tivesse dependência crítica no tipo de ião de metal num meio de cultura.
Além disso, de acordo com a presente invenção, a hidratação de um nitrilo aromático pode ser efectuada vantajosamente. A eficácia da presente invenção ê útil pela importância da nicotinamida, que ê o produto de hidratação de 3-cianopiridina, como uma matéria prima para a síntese de vitaminas ou de pirazineamida, que ê o produto de hidratação de cianopirazina, útil como um tuberculostãtico.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
1. Alguns Conceitos Gerais de um Processo para a Produção Biológica de uma Amida
A presente invenção refere-se a um pro cesso para hidratar um nitrilo para o converter numa amida correspondente através da acção de uma hidratase de nitrilo origina da num microorganismo, processo este que compreende basicamente a cultura de um microorganismo, a indução de uma hidratase de ni trilo e a utilização da hidratase de nitrilo, assim obtida para agir sobre um substrato de nitrilo.
Estes passos por si são conhecidos como operações unitárias e são usados na sua forma adequada na pre sente invenção. A fraseologia hidratase de nitrilo ê obtida por cultura de um microorganismo na presença de um ião de cobalto toma a indução de uma hidratase de nitrilo como uma premissa natural.
A premissa da presente invenção um processo para a hidratação de um nitrilo para o converter numa amida correspondente pela acção de uma hidratase de nitrilo originada num microorganismo inclui quaisquer formas de concretiza ção apropriadas ou variações para levar a hidratase de nitrilo a agir sobre o nitrilo. Uma das referidas formas de concretização consiste num método para recolher uma enzima produzida por um mi croorganismo e usar a enzima sob a forma de uma preparação enzimãtica. Esta forma de utilização da hidratase de nitrilo, na qual a enzima ê usada sob a forma de uma preparação enzimática, é para ser compreendida como estando incluída numa categoria de um processo para a produção biológica na presente invenção.
2. Pormenores da Reacção da Hidratação
1) Microorganismo microorganismo usado na presente invenção ê um microorganismo de uma espécie Rhodococcus rhodochrous.
Uma estirpe representativa desta espécie ê a estirpe J-l.
Os pormenores da estirpe J-l são os se guintes:
(1) Origem e depósito
A estirpe J-l foi retirada do solo em Sakyo-ku de Kyoto, Japão, e foi depositada como deposito interna .jfi· cional (de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos com a Finalidade de Procedimentos de Patentes) no Instituto de Investigação dei fermentação, Japão, Agência de Ciências Industriais e de Tecnologia com o numero de acesso de FERM BP-1478.
(2) Propriedades bacteriológicas (a) Morfologia
(1) Forma e tamanho de células: 0,9 a 1,0 μ x 3 - 10 p.
(2) Presença de polimorfismo
das células: A célula apresenta a forma
de uma barra comprida na fa-
se inicial de cultura, cres-
ce movendo-se numa forma de
curvatura e, então, ê dividi.
da em pequenos bacilos.
(3) Motilidade: Nenhuma.
(4) Presença de esporos: Nenhuma.
(5) Faculdade de coloração de
Gram: Positiva.
(6) Propriedade de fixação de
acido: Negativa.
(7) Granulócito heterófilo: Detectado.
(b) Estados de crescimento em vários meios de cultura (309C) (1) Cultura em placa de caldo de agar: Círculo com um diâmetro de mm (48 horas), irregular e macio, sendo a superfície bas tante seca, plana, opaca, de cor laranja-rosado claro.
(2) Cultura em cunhas de caldo de agar: Sulco orlado com uma superfí cie macia sendo bastante seca, secção ligeiramente sali ente bastante seca com cor laranja-rosado claro.
(3) Cultura submersa: Crescimento florescente, for mando a membrana celular bac c
(4) Cultura penetrada de gela tina em caldo:
teriana, e formam-se turvação moderada e sedimento aconr panhando o crescimento.
Crescendo muito bem na super fície, na forma de um cone ao longo da parte penetrada, mas não na camada inferior; não se observa liquefação na gelatina.
Sem variação.
(5) Tintura de torne sol:
(c) Propriedades fisiológicas (1) Redução de nitratos: Positiva.
(2) Desnitrificação: Negativa.
(3) Teste MR: Negativo.
(4) Teste VP: Negativo.
(5) Geração de indole: Positiva.
(6) Geração de sulfureto de hidrogénio: Positiva.
(7) Hidrólise de amido: Negativa.
(8) Utilização de ácido cítrico:
Meio de cultura de Kocur: Negativo.
Meio de cultura de
Christensen: Positivo.
(9) Utilização de fonte de azoto inorgânico:
nitrato: Positivo, sal de amónio: Positivo.
(10) Geração de matéria corante: Negativa.
(11) Urease:
(12) Oxidase:
(13) Catalase:
(14) Hidrólise de celulose:
(15) Domínio de crescimento:
(16) Comportamento em relação ao oxigénio:
(17) Decomposição de tirosina:
Positiva.
Negativa.
Positiva.
Negativa.
pH: 5 a 10, temperatura: 10 a 41? C.
Aerôbico.
Positiva.
(18) Decomposição de adenina: Positiva.
(19) Fosfatase: Positiva.
(20) Hidrólise de Tween 80: Positiva.
(21) Teste de 0-F: Negativo.
(22) Resistência térmica (em
leite desnatado a 10% a
729C durante 15 minutos): Nenhuma.
(23) Geração de um acido e de gãs a partir de um açúcar: Ãcido
L-Arabinose -
D-Xilose -
D-Glucose +
D-Manose -
D-Fructose +
Maltose +
Açúcar +
Lactose -
Trealose -
D-Sorbitol +
D-Manitol +
Glicerol +
+: positivo: negativo
(24) Crescimento numa única fonte de carbono
Inositol -
Maltose +
D-Manitol +
Ramnose -
D-Sorbitol +
Ãcido m-Hidroxibenzõico +
Adipato de sódio +
Benzoato de sódio +
Citrato de sódio +
Lactato de sódio +
Testosterona +
L-Tirosina +
Glicerol (1%) (p/v) (+)
Trealose (+)
ãcido p-Hidroxibenzóico (1%) (p/v) + +: positivo? negativo; (+): ligeiramente positivo.
(25) Ácido gordo e analise de parede celular:
Contendo ácidos gordos insaturados e saturados de cadeia linear e ãcido tuberculo-esteãrico. Uma CCF de ãcido mi eólico dã uma mancha única.
Como resultado de classificação das propriedades bacteriológicas acima descritas à luz do Manual de Bacteriologia Sistemática de Bergy, a estirpe J-l ê um bacilo ae róbico, Gram-positivo, resistente a ácidos fracos, catalase-posj. tivo e que não forma endosporos nem introduzirá flagelos. Também apresenta uma forma de um bacilo alongado como um micélio na fase inicial de crescimento, cresce com ramificações e seguidamente divide-se em bacilos curtos. Portanto, reconhece-se como pertencendo a uma bactéria de um tipo de Nocardia.
A análise da composição em ácidos gordos mostra que a bactéria contêm ácidos gordos insaturados e saturados de cadeia linear contendo ãcido tuberculosteãrico.A ãnálise por CCF de ãcido micõlico dã uma mancha única tendo o mesmo valor de Rf que a bactéria normal Rodococcus rhodochrous (IFO 3338), distinguindo-se deste modo do gênero Micobacterium. Distingue-se também do gene Nocardia pela composição (número de ãto mos de carbono) de ácido micõlico. Como resultado do exame de ou tras propriedades bioquímicas, reconhece-se a bactéria como sendo um Rodococcus rhodochrous.
Os microorganismos têm tendência a sofrer mutações. Em consequência, ê desnecessário dizer que uma bactéria, mesmo que seja um mutante de uma estirpe competente tal como a estirpe J-l, pode ser usada no processo de acordo com a presente invenção, desde que o seu produto de cultura produza hi dratase de nitrilo na presença de um ião de cobalto.
2) Substrato/nitrilo
Os nitrilos que serão usados como um substrato de hidratase de nitrilo produzida pelo microorganismo acima descrito são mononitrilos ou dinitrilos aromáticos e alifá ticos, em especial mononitrilos.
Os nitrilos que apresentam melhor as características da presente invenção são nitrilos aromáticos, em especial os que têm 4 a 10 átomos de carbono formando o anel aro mãtico. vários exemplos típicos dos nitrilos aromáticos são os compostos representados pelas seguintes formulas gerais /1/ a ffilj como se segue:
Exemplos típicos destes nitrilos são
4-, 3- e 2-cianopiridinas.
2 em que R e R , respectivamente, representam H, CH3, OH, OCH3, Cl, F, CN, NH2 ou NO2.
São exemplos típicos destes nitrilos benzonitrilo, o-, m- e p-clorobenzonitrilos, o-, m- e p-fluorobenzonitrilos, o- e m-nitrobenzonitrilos, p-aminobenzonitrilo, o-, m- e p-tolunitrilos, 4-cianofenol, anisonitrilo, ftalonitrilo, isoftalonitrilo, tereftalonitrilo, 2,6-diclorobenzonitrilo,
2,4-diclorobenzonitrilo e 2,β-difluorobenzonitrilo.
São exemplos
típicos destes nitrilosoC e ^3-naftonitrilos
/IV/
em que X representa S ou 0.
São exemplos típicos destes nitrilos
2-tiofeno-carbonitrilo e 2-furonitrilo.
É um exemplo típico destes nitrilos a cianopirazina.
Outro grupo de nitrilos incluídos no objectivo da presente invenção ê constituído, preferencialmente, por nitrilos alifãticos, de preferência por mono- ou di-nitrilos contendo 2 a 6 átomos de carbono, de modo especialmente preferido por mononitrilos. A julgar pela utilidade das amidas a serem produzidas, o acrilonitrilo ê um substrato típico e pode ser facilmente produzido.
Ê desnecessário dizer que as amidas correspondentes a estes nitrilos são as obtidas convertendo o grupo CN das últimas num grupo CONI-]^· No caso dos dinitrilos, de verá considerar-se serem as amidas correspondentes obtidas convertendo pelo menos um dos grupos CN num grupo CONB^.
π r\
3) Cultura/produção de hidratase de nitrilo
A cultura de um microorganismo da espé cie Rhodococcus rhodochrous pode ser efectuada sob quaisquer con dições apropriadas desde que esteja presente um ião de cobalto num meio de cultura. Pode ser uma pratica comum colocar um indutor enzimãtico, que será descrito em pormenor seguidamente, num meio de cultura de modo a que a hidratase de nitrilo se acumule nas células bacterianas.
(1) Meio Básico
Sao ilustrados seguidamente exemplos de meios de cultura apropriados. Podem ser facilmente realizadas por um perito na técnica alterações da(s) quantidade(s) de compo nente(s) apresentados em seguida, a substituição de um componente por outro e a eliminação de algum(s) componente(s) ou a adição de outro(s) componente (s).
(i) Meio de cultura A
Componente Quantidade (em 1 litro meio)
*1
Mistura de vitaminas 0,1 ml
k2hpo4 13,4 g
kh2po4 6,5 g
NaCl 1,0 g
MgSO47H2O 0,2 g
Âgua destilada Balanço (pH 7,0)
*1 . ~ Composição:
Biotina 2 pg
Pantotenato de cálcio 0,4 mg
Inositol 2 mg
Ácido nicotinico 0,4 mg
Cloridrato de tiamina 0,4 mg
Cloridrato de piridoxina 0,4 mg
Ãcido p-aminobenzõico 0,2 ng
Riboflavina 0,2 mg
lÂbido félico 0,01 ng
Âgua atê 1 litro
(ii) Meio de cultura B Glicerol g
Peptona
Extracto de malte Extracto de levedura Água destilada
Balanço (pH 7,0) (iii) Meio de cultura C Extracto de levedura kh2po4 k2hpo4 MgSO47H2O Ãgua destilada
0,5 g 0,5 g 0,5 g
Balanço (pH 7,2) (2) Indutor enzimãtico
Os indutores enzimaticos para induzir e produzir hidratase de nitrilo num microorganismo Rhodococcus rhodochrous podem ser quaisquer apropriados ao objectivo.
Os indutores típicos adequados para a presente invenção são nitrilos e amidas.
Os exemplos de indutores de enzimas cu jo efeito foi confirmado pela estirpe J-l são os seguintes:
crotonamida, acetonitrilo, propionitri lo, benzamida, propionamida, acetamida, isovaleronitrilo, n-buti ronitrilo, isobutironitrilo, n-capronitrilo, 3-penteno-nitrilo, pivalonitrilo, n-butiramida, isobutiramida, n-valeramida, n-capronamida, metacrilamida e fenilacetamida.
(3) Fonte de ião de cobalto
Não se obtêm hidratase de nitrilo mesmo que um indutor enzimãtico, acima descrito, esteja presente num meio de cultura, uma vez que ê essencial, de acordo com a presente invenção, que esteja presente no meio de cultura um ião de cobalto.
Como o meio de cultura e aquoso, o iao de cobalto ê normalmente gerado por adição ao meio de cultura de um composto de cobalto solúvel em ãgua. Os compostos de cobalto solúveis em ãgua são descritos em dicionários de química e, deste modo, seria fãcil para um perito na técnica seleccionar e usai· um composto apropriado (em alguns casos, efectuando um simples teste preliminar). Os compostos de cobalto típicos são aqueles que dão origem a um ião Co++ ou Co+++, em especial aqueles que ~ ~ ++ dao origem a um iao Co , e exemplos particulares destes compostos são cloreto de cobalto, sulfato de cobalto, acetato de coba_l to, brometo de cobalto, borato de cobalto ou equivalentes. A vitamina B12 e o cobalto metálico são outros exemplos dos compostos de cobalto, pois estes produzem in situ um ião de cobalto no meio de cultura através de ionização ou de ataque oxidativo pelo microorganismo durante a cultura.
(4) Cultura
Az cultura para a produção e a acumulação de hidratase de nitrilo na célula bacteriana pode ser levada a cabo cultivando o microorganismo usado, por exemplo a estirpe J-l num meio de cultura, como acima se descreve, sob condições apropriadas.
A quantidade do indutor enzimãtico usa da estã na ordem de 2 a 6 g por 1 litro do meio de cultura, e a quantidade do ião de cobalto estã na ordem de 5 a 15 mg por 1 li. tro do meio de cultura baseado em CoCl2.
Exemplos particulares da composição do meio de cultura estão especificados no que se segue:
(i) Meio de cultura A 1 litro
Acetonitrilo (indutor) 2 g
CoCl2 10 mg
(ii) Meio de cultura B 1 litro
Isovaleronitrilo 2 g
coci2 10 mg
(iii) Meio de cultura C 1 litro
Crotonamida 2 g
CoCl2 10 mg
A hidratase de nitrilo pode ser produzida vantajosamente pela cultura agitada da estirpe J-l a uma temperatura de 15 a 509 C, de preferência de 20 a 459 C, mais preferencialmente à volta de 309 C a pH 7 a 9 durante cerca de 30 horas ou mais, de preferência durante 40 horas ou mais (dentro do limite máximo de, por exemplo, 120 horas). É preferível que o indutor enzimático esteja presente desde a fase inicial da cultura, e é desejável adicionar um suplemento de indutor a fim de preparar células bacterianas tendo uma actividade elevada.
Por exemplo, quando a cultura com agitação se destina a ser efec tuada a 289 C durante 76 horas, adiciona-se mais quantidade de crotonamida 26 e 56 horas apôs o início da reacção de modo que a concentração seja de 0,2% (p/v) em qualquer momento.
4) Hidratação de nitrilos
A premissa da presente invenção processo para produção biológica de uma amida na qual se hidrata um nitrilo obtendo-se uma amida correspondente pela acção de uma hi dratase de nitrilo originada num microorganismo inclui, como acima se descreve, várias formas de concretização ou variações rasoãveis de forma a levar a hidratase de nitrilo a actuar sobre o nitrilo.
Uma destas formas de concretização con siste na produção de uma amida num meio de cultura na presença do substrato constituído por um nitrilo num meio de cultura de um microorganismo.
Outra forma de concretização para levar a hidratase de nitrilo a actuar sobre o seu substrato consi£ te em adicionar o substrato constituído por um nitrilo a um meio de cultura no qual uma hidratase de nitrilo tenha sido acumulada para efectuar a reacção de hidratação. A forma de concretização variante consiste em utilizar um meio de cultura no qual as cêlu las do microorganismo tenham sido destruídas como o meio de cul tura no qual uma hidratase de nitrilo tenha sido acumulada.
Uma forma de concretização adicional para levar a hidratase de nitrilo a actuar sobre o seu substrato ê isolar as células nas quais a hidratase de nitrilo tenha sido acumulada a partir de um meio de cultura, de preferência colocar as células num suporte apropriado ou imobilizá-las e, em segui da, fazer as células entrar em contacto com um substrato. Este método, em especial a forma de concretização preferida na qual são usadas células imobilizadas, ê considerado adequado para uti lização industrial do mesmo modo ou ainda mais do que as formas de concretização secundárias acima descritas. Esta técnica, na qual são usadas células imobilizadas, ê bem conhecida na técnica no que se refere ao tipo de suporte, ao método de imobilização do microorganismo num suporte e à utilização do microorganismo imobilizado num reactor designado por bio-reactor.
Outra forma de concretização para fazer a hidratase de nitrilo agir sobre o seu substrato consiste no método segundo o qual se produz um preparado enzimãtico de uma hidratase de nitrilo e no qual se hidrata um nitrilo pelo preparado enzimãtico de acordo com uma via não-biológica. Não é necessário dizer que a reacção de hidratação nesta forma deve ser efectuada sob tais condições de pH e de temperatura que a ac tividade de enzima se não perca. Pode-se dizer que tais condições são as mesmas que as acima descritas na via biológica. Co mo se descreve abaixo, a forma de concretização na qual não esta vam presentes os microorganismos durante a acção da enzima ê igualmente tratada como um processo de produção biológica na presente invenção.
De acordo com a presente invenção, a hidratase de nitrilo tem uma gama de pH apropriada para utilização desde 7 a 9, sendo o pH óptimo 8,0. Se a solução de reacção apresenta um pH inferior a 7, a actividade da enzima tende a baixar abruptamente. Em consequência, ê preferível adicionar um tam pão â solução de reacção. Mesmo que seja usado um tampão qualquer, tal como um tampão de fosfato de potássio, um tampão de Tris/HCl, um tampão de HEPES/KOH ou um tampão de borato de sódio a actividade da enzima da hidratase de nitrilo não se alterará.
A concentração de um substrato num meio de cultura ou numa solução de reacção de hidratação está normalmente numa gama de 4 a 7 moles/litro, e a temperatura de reacção está normalmente na gama de 10 a 309 C.
3. Exemplos Experimentais método para a medição da actividade de uma hidratase de nitrilo e a unidade da actividade nos exemplos experimentais estão definidos abaixo como se segue:
(1) Método para medição da actividade de uma hidratase de nitri.
lo
A actividade de uma hidratase de nitri lo ê medida levando a cabo a reacção com 2 ml de uma mistura reaccional que contêm 10 mM de benzonitrilo, 30 mM de um tampão de fosfato de potássio (pH 7,0) e uma certa quantidade das células de um microorganismo (isolado a partir de um meio de cultura) a 10? C durante 5 minutos e adicionando 2 ml de HCl IN para parar a reacção.
(2) Definição de unidade
Uma unidade (U) da actividade da hidra tase de nitrilo ê definida como a quantidade de uma enzima necess séria para produzir benzamida a partir de benzonitrilo nas condi ções acima descritas numa proporção de 1 pmole/min.
Exemplo de Referência > Cultivou-se a estirpe J-l usando um meio de cultura cuja composição é abaixo especificada sob as con dições de cultivo, as quais estão igualmente especificadas abaixo, e examina-se a expressão da actividade da hidratase de nitri lo adicionando CoCl2 e/ou FeSO4 ao meio de cultura durante a cul tura.
(i) Composição do meio de
Ingrediente Mistura vitamínica k2hpo4 kh2hpo4 MgSO47H2O Propionitrilo Água destilada cultura
Quantidade (em 1 litro de meio
3,0 ml 0,5 g 0,5 g 0,5 g 2 ml
Balanço (pH 7,2) (ii) Condição de cultura 28?C/70 a 80 horas
Os resultados obtidos sao apresentados seguidamente.
Pode-se verificar que a actividade da hidratase de nitrilo não se desenvolverá mesmo que se adicione FeSO4 ao meio básico, a actividade da hidratase de nitrilo desen volve-se quando se adiciona CoCl2, e a adição de FeSO4 a um sisf-
tema a que se adicionou C0CI2 afectarã adversamente os resulta· dos.
*1 Quantidade de células; com base no peso seco.
*2 U: Unidade de actividade de acordo com a definição acima, sendo a quantidade de células baseada no peso seco.
Exemplo de Referência 2
Os efeitos de vários nitrilos ou amidas como indutores enzimãticos sobre a estirpe J-l estão apresen tados no quadro abaixo.
Os resultados apresentados no quadro abaixo são obtidos por cultura prévia da estirpe J-l no meio de cultura B acima mencionado a 28? C, adição de um nitrilo ou de uma amida como indutor numa quantidade de 0,1% (v/v) ou 0,2% (p/v), respectivamente,
Ião metálico adicionado
coci2 (mg) 0 0 0 0 0 10 10 10 10 10
FeSO4 (mg) 0 5 10 20 40 0 5 10 20 40
Quantida de de ce lulas *1 (mg/ml) 1. 06 1.14 1.25 1. 24 1.34 2.04 1.90 2.16 2.16 2.07
Actividade enzimãtica
U/ml de „ * células Γ 20 0 0 0 0 0.59 0.26 0.34 0.32 0.16
U/ml de meio 0 0 0 0 0 1.20 0.49 0.73 0.69 0.33
quando a estirpe proliferou suficientemente, e continuação da inoculação da estirpe no meio de cultura C acima mencionado ao qual se adicionou 0,001% (p/v) de COCI2 para efectuar a cultura durante 36 a 48 horas.
Ί *T
Actividade especifica (U/mg) Actividade total (U/ml) Quantidade de células (mg de células secas/ml)
Crotonamida 2.22 4.48 2.02
Acetonitrilo 1.41 3.47 2.46
Propionitrilo 1.36 4.44 3.26
Benzamida 0.84 2.75 3.26
Propionamida 0.79 2.29 2.90
Acetanamida 0.71 1.55 2.18
n-Butironitrilo 1.40 0.38 3.70
Isobutironitrilo 0.41 1.24 3.06
Isovaleronitrilo 0.34 1.05 3.07
n-Capronitrilo 0.28 1.04 3.71
3-Penteno-nitrilo 0.32 1.42 4.49
Pivalonitrilo 0.35 0.24 0.69
n-Butiramida 0.43 1.55 3.62
Isobutiramida 0.09 0.33 3.48
Isovaleramida 0.44 1.08 1.81
n-Capronamida 0.30 1.06 3.52
Metacrilamida 0.20 0.62 3.12
Fenilacetamida 0.29 0.28 0.95
Exemplo 1
Fizeram-se reagir com vãrios nitrilos usados como o substrato as células da estirpe J-l obtidas por cultura da estirpe num meio de cultura compreendendo o meio de cultura C acima mencionado contendo C0CI2 θ crotonamida adiciona da, em proporções respectivamente de 0,01 g e 2 g por litro do meio. A reacção foi efectuada usando 2 ml de uma solução reaccio nal compreendendo as células obtidas a partir de 2 ml de cultura 10 mM de um tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 200 mM do substrato a 259 C durante 76 horas. A reacção foi feita parar por adição de 0,2 ml de HC1 IN. As actividades da hidratase de nitri lo em relação aos respectivos substratos estão apresentadas sob a forma das proporções entre o produto de reacção ou da quantida de consumida do substrato medido pela HPLC e a actividade da hidratase de nitrilo medida com 3-cianopiridina como substrato, isto ê a actividade especifica (%).
Os resultados estão apresentados abaixo.
Substrato Actividade específica (%)
3-Cianopiridina 100
Acrilonitrilo 106
4-Cianopiridina 129
2-Cianopiridina 64
5-Cianoindole 9
2-Tiofenonitrilo 116
2-Furonitrilo 71
Benzonitrilo 80
4-Cianofenol 24
p-Aminobenzonitrilo 16
m-Nitrobenzonitrilo 7
o-Nitrobenzonitrilo 16
m-Clorobenzonitrilo 29
p-Tolunitrilo 5
o- To lun i t r i lo 46
m-Tolunitrilo 32
Anisonitrilo 20
o-Clorobenzonitrilo 41
p-Clorobenzonitrilo 7
2,4-Diclorobenzonitrilo 2
2,6-Diclorobenzonitrilo 1
Cianopirazina 80
EXEMPLO 2
Colocaram-se num frasco Sakaguchi de 1 litro 400 ml de um meio de cultura compreendendo o meio de cultu ra C acima descrito contendo C0CI2 e crotonamida adicionados, respectivamente, numa proporção de 0,01 g e de 2 g por litro do meio, e cultivou-se a mistura num agitador oscilatório a 289 C. Continuou-se a cultura com adição adicional ao meio de cultura de 0,2% (p/v) de crotonamida (800 mg/400 ml) a 30 e a 60 horas após o inicio da cultura, e foi feita parar a 80 horas apôs o inicio da cultura.
Colheram-se as células bacterianas por centrifugação do meio de cultura a 12 000 g durante 15 minutos com um separador centrífugo (modelo Hitachi SCR 20 B), levaram-se com NaCl a 0,85%, centrifugaram-se novamente e suspenderam-se em 40 ml da solução acima descrita. Uma pequena porção da suspensão foi retirada para amostra e usada para medir o peso se co das células bacterianas na suspensão.
Adicionou-se a suspensão contendo as células (correspondendo a 2,33 mg de células secas) a 4 ml de uma solução reaccional que continha 10 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 4,57 M de 3-cianopiridina, e a reacção foi efectuada a 259 C de um dia para o outro adicionando à solução reaccional 0,55 M e 0,49 M de 3-cianopiridina, apôs 3 e 6 ho ras a partir do inicio da reacção, respectivamente. O rendimento da nicotinamida produzida foi 5,58 M após 18 horas a partir do inicio da reacção. Deste modo, a conversão alcançou 99,5%, o que corresponde à acumulação de nicotinamida numa quantidade de 681 g. A esta concentração, o produto de reacção solidificou como o resultado da deposição da nicotinamida.
A nicotinamida assim produzida foi identificada isolando o produto sob a forma de cristais e analisando-o através de análise elementar, XV, NMR e espectrometria em massa. Não se detectou ãcido nicotínico.
EXEMPLO 3
Adicionou-se a suspensão contendo célu η λ las (correspondendo a 2,33 mg de células secas) obtida no Exemplo 2 a 4 ml de uma solução reaccional que continha 10 mM de tam pão de fosfato de potássio (pH 8,0) e cianopirazina em várias concentrações. A reacção foi efectuada a 259 C. Converteram-se quatro moles de cianopirazina em pirazinamida com uma conversão de 100% apõs uma reacçao de 6 horas, e 6 moles de cianopirazina apôs uma reacção de 9 horas. Por outro lado, quando se adicionou a solução reaccional semelhante (4 ml) uma suspensão que continha as células bacterianas numa quantidade correspondente a 4,66 mg do peso seco em vez de 2,33 mg do peso seco acima descrito, converteu-se 7 M da cianopirazina em pirazinamida com uma conver são de 100% apõs uma reacção de 6 horas, e 8 M de cianopirazina apôs uma reacçao de 9 horas. Não se reconheceu produção de ácido pirazinacarboxxlico.
Cristalizou-se a pirazinamida a partir da solução â medida que se produzia. Colheu-se directamente o de pôsito cristalino e recristalizou-se a partir de metanol. Identificaram-se os cristais como sendo pirazinamida analisando-os atra vês de analises elementares, IV, NMR e espectrometria de massa.
Efectuou-se a analise da cianopirazina, da pirazinamida e do ácido pirazinacarboxxlico através de cromatograf ia líquida de alta pressão.
A mesma análise deste exemplo foi igual mente efectuada nos exemplos seguintes.
EXEMPLO 4
Adicionou-se a suspensão das células bacterianas (correspondente a 4,66 mg das células secas) obtidas no Exemplo 2 a 4 ml da solução reaccional contendo 10 mM de um tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 3 M de metacrilonitrilo, e efectuou-se a reacção a 259 C adicionando 3M de metacrilonitri lo à solução reaccional apôs 1 e 3 horas a partir do início da reacção, respectivamente. Apôs 12 horas a partir do início da re acção, produziu-se 9 M de metacrilamida com uma conversão de 100%.
Na reacção anterior, quando se adicionou 1 M de metacrilonitrilo 5 horas depois do início da reacção, produziu-se 10 M de metacrilamida numa conversão de 100% 24 horas apos o início da reacção. A concentração de 10 M corresponde ã produção e ã acumulação de 851 g de metacrilamida por 1 litro de solução reaccional.
Dilulu-se em agua a solução reaccional e separaram-se as células bacterianas por centrifugação (sob 12 000 g durante 15 minutos). A solução isenta de células foi concentrada num evaporador rotativo e cristalizada. Seguidamentej dissolveram-se os cristais e recristalizaram-se a partir de ãgua obtendo-se cristais de metacrilamida.
EXEMPLO 5
Adicionou-se a suspensão das células bacterianas (correspondente a 4,66 mg das células secas) obtida no Exemplo 2 a 4 ml da solução reaccional contendo 10 mM de um tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 1 M de crotonitrilo, e efectuou-se a reacção a 259 C com a adição de porções 1 M de metacrilonitrilo à solução reaccional num total de cinco vezes com um intervalo de 1 hora após o inicio da reacção. Após 6 horas a partir do inicio da reacção, produziu-se 6 M de crotonamida numa conversão de 100%. Quando se adicionaram porções de 1 M adicionais de crotonitrilo à solução reaccional apõs 6 e 10 horas a partir do inicio da reacção, respectivamente, produziu-se 7 M e 8 M de crotonamida numa conversão de 100%, apos 10 e 22 horas, respectivamente. A concentração de 8 M corresponde à produção e acumulação de 681 g de crotonamida por litro da solução reaccional.
A cristalização de crotonamida foi efec; tuada da mesma forma gue no Exemplo 4.
EXEMPLO 6
Adicionou-se a suspensão das células bacterianas (correspondente a 4,66 mg das células secas) obtida no Exemplo 2 a 4 ml da solução reaccional contendo um tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 8,0) e acetonitrilo 3 M, e efectuou-se a reacção a 259 C com a adição de porções 3 M de acetonitrilo à solução reaccional 1 e 3 horas após o início da reacção e de 5 M de acetonitrilo 6 horas apõs o início da reacção. Após 12 horas do inicio da reacção, produziu-se 14 M de acetamida numa conversão de 100%. Por outras palavras, produziu-se e acumulou-se por 1 litro da solução reaccional 827 g de acetamida.
Diluíu-se em água e submeteu-se a tratamento centrífugo a solução reaccional para remover as células bacterianas. 0 sobrenadante foi concentrado ã secura num evapora dor rotativo, foi dissolvido em metanol e depois cristalizado a partir de metanol, obtendo-se cristais de acetamida.
EXEMPLO 7
Adicionou-se a suspensão das células bacterianas (correspondente) a 4,66 mg das células secas) obtida no Exemplo 2 a 4 ml da solução reaccional contendo 10 mM de um tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 3 M de 3-hidroxipropionitrilo, e efectuou-se a reacção a 259 C com a adição de porções de 3 M de 3-hidroxipropionitrilo ã solução reaccional num total de quatro vezes com um intervalo de 1 hora apõs o início da reac ção. Apõs 5 horas do início da reacção, produziu-se 15 M de 3-hi droxipropionamida numa conversão de 100%. Quando se juntaram por ções de 3 M adicionais de 3-hidroxipropionitrilo à solução reaccional nesta fase, produziu-se 18 M de 3-hidroxipropionamida numa conversão de 100% apõs 11 horas do início da reacção. Isto quer dizer que se produziu e se acumulou 1600 g de 3-hidroxipropionamida por 1 litro da solução reaccional.
A solução reaccional foi diluída em agua e sujeita a tratamento centrífugo para remover as células bacterianas. O sobrenadante isento de células foi em seguida con centrado num evaporador rotativo e cristalizado a uma temperatura de -209 C. Dissolveram-se os cristais em isopropanol e recris talizaram-se do solvente para se obterem cristais de 3-hidroxipropionamida.
EXEMPLO 8
Colocaram-se num Frasco de Sakaguchi de 1 litro 400 ml de um meio de cultura compreendendo o meio de cultura C, acima mencionado, contendo CoCl2 e crotonamida adicio nados, respectivamente, numa proporção de 0,01 g e de 2 g por li tro do meio, e cultivou-se a mistura num agitador oscilatório a 28? C. Continuou-se a cultura com nova adição ao meio de cultura de 0,2% (p/v) de crotonamida (800 mg/400 ml) a 26 horas e 56 horas após o início da cultura, e fez-se parar às 76 horas após o inicio da cultura.
Colheram-se as células bacterianas cen trifugando o meio de cultura a 10 000 g durante 20 minutos com um separador centrífugo (modelo Hitachi SCR 20B), lavaram-se com 0,85 NaCl, centrifugaram-se novamente e suspenderam-se em 40 ml da solução acima descrito. Uma pequena porção da suspensão foi retirada para amostra e usada para medir o peso seco das células bacterianas na suspensão.
Adicionou-se a suspensão contendo célu las (correspondendo a 2,96 mg das células secas) a 4 ml da solução reaccional a qual continha 10 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 3-cianopiridina em varias concentrações. Efectuou-se a reacção a 25? C. Foram convertidas oito moles de 3-cia nopiridina em nicotinamida com uma conversão de 100% apôs uma re acção de 9 horas, e nove moles de 3-cianopiridina apos uma reacção de 22 horas. Por outro lado, quando se adicionou uma suspensão, que continha as células bacterianas numa quantidade correspondente a 5,92 mg do peso seco em vez de 2,96 mg do peso seco acima descrito, a uma solução reaccional semelhante (4 ml), converteu-se 9 M da 3-cianopiridina em nicotinamida com uma conversão de 100% apôs uma reacção de 5 horas, e 12 M de 3-cianopiridi. na após uma reacção de 9 horas. Não se detectou a produção de ãcido nicotínico.
Produziu-se e acumulou-se por 1 litro da solução reaccional a concentração de 12 M que corresponde à de 1 465 g de nicotinamida.
Cristalizou-se a nicotinamida a partir da solução à medida que esta era produzida. Separaram-se os cris tais e recristalizaram-se a partir de metanol.
EXEMPLO 9
Adicionou-se a suspensão das células bacterianas (correspondente a 5,92 mg das células secas) obtida no Exemplo 8 a 4 ml da solução reaccional contendo 10 mM de um tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 1 M de benzonitrilo, e efectuou-se a reacção a 259 C adicionando 1 M de benzonitrilo à solução reaccional após 1, 2, 3, 4, 5e7 horas do início da reacção, respectivamente. Após 24 horas do início da reacção, produziu-se 7 M (848 g/litro) de benzamida com uma conversão de 100!
EXEMPLO 10
Adicionou-se a suspensão das células bacterianas (correspondente a 5,92 mg das células secas) obtida no Exemplo 8 a 4 ml da solução reaccional contendo 10 mM de um tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 0,5 M de 2,6-difluorobenzonitrilo, e efectuou-se a reacção a 259 C adicionando 0,5 M de 2,6-difluorobenzonitrilo à solução reaccional após 2, 4, 6 e 8 horas do início da reacção, respectivamente. Apôs 22 horas do inicio da reacção, produziram-se 2,5 M (393 g/litro) de 2,6-difluorobenzamida com uma conversão de 100%.
EXEMPLO 11
Adicionou-se a suspensão das células bacterianas (correspondente a 5,92 mg das células secas) obtida no Exemplo 8 a 4 ml da solução reaccional contendo 10 mM de um tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 1 M de 2-tiofeno-carbonitrilo, e efectuou-se a reacção a 259 C adicionando 1 M de 2-tiofeno-carbobenzonitrilo â solução reaccional apôs 1 hora do início da reacção. Após 5 horas do início da reacção, produziu-se 2 M (254 g/litro) de 2-tiofeno-carboxamida com uma conversão de 100%.
π r κ
EXEMPLO 12
Adicionou-se a suspensão das células bacterianas (correspondente a 5,92 mg das células secas) obtida no Exemplo 8 a 4 ml da solução reaccional contendo 10 mM de um tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 1 M de 2-furonitrilo, e efectuou-se a reacção a 259 C adicionando 1 M de 2-furonitrilo â solução reaccional apôs 1, 2, 4, 6, 8, 11 e 23 horas do início da reacção, respectivamente. Apés 30 horas do início da reacção, produziu-se 8 M (888 g/litro) de 2-furano-carboxamida com uma conversão de 100%.
J
EXEMPLO 13
Adicionou-se a suspensão das células bacterianas (correspondente a 5,92 mg das células secas) obtida no Exemplo 8 a 4 ml da solução reaccional contendo 10 mM de um tampão de fosfato de potássio (pH 8,0) e 4 M de 3-indoleacetonitrilo, e efectuou-se a reacção a 259 C. Apôs 24 horas do início da reacção, produziram-se 4 M (697 g/litro) de 3-indoleacetamida com uma conversão de 100%.

Claims (1)

  1. Processo para a preparaçao por via bio lógica de uma amida por hidratação de um nitrilo para obtenção da amida correspondente pela acção de uma hidratase de nitrilo originaria de um microorganismo, caracterizado por compreender a utilização de uma hidratase de nitrilo obtido por cultura de um microorganismo da espécie Rhodococcus rhodochrous na presença de um ião de cobalto.
    Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microorganismo referido ser uma estirpe J-l da espécie Rhodococcus rhodochrous, FERM BP-1478.
    - 3- Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o referido nitrilo ser um nitrilo aromatico contendo 4 a 10 ãtomos de carbono no núcleo aromático.
    Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido nitrilo aromático ser selecciona o n do de entre o grupo constituído por:
    1 2 em que R e R , respectivamente, representam H, CH^, OH, OCH^, Cl, F, CN, NH2 ou N02;
    em que X representa S ou 0?
    H
    N
    N
    VI
    Π o
    - 5- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido nitrilo aromático ser 2-cianopiridina, 3-cianopiridina ou 4-cianopiridina.
    Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido nitrilo aromático ser 3-cianopiridina.
    - 7- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido nitrilo aromático ser cianopirazina.
    Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o referido nitrilo ser um nitrilo alifático contendo 2 a 6 átomos de carbono no núcleo aromático.
    Processo de acordo com a reivindicação
    - 9- 8, caracterizado por o referido nitrilo alifático contendo 2 a 6 átomos de carbono ser acrilonitrilo.
    Os requerentes declaram que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados no Japão em 18 de Setembro de 1987 e em 26 de Março de 1988, sob os n9s. 234597/ /1987 e 72766/1988, respectivamente.
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